三.HPLC分析方法的建立課件

第三講.HPLC分析方法的建立天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心BaseLine?一.RPC分析方法建立二.NPC分析方法建立三.GPC分析方法四.HPLC應(yīng)用實(shí)例五.HPLC的定量分析一.反相HPLC（RPC）分析方法的建立樣品中的化學(xué)成分化合物的結(jié)構(gòu)與官能團(tuán)化合物的分子量化合物的酸堿性和pKa樣品適宜的溶劑及溶解度樣品各成分的含量范圍化合物的紫外吸收光譜樣品的組成與性質(zhì)樣品的制備溶劑萃取固相萃取膜分離，超濾，超臨界萃取等圖1非離子樣品的反相分離過程示意圖黑點(diǎn)表示在極性流動(dòng)相和非極性固定相間分配的樣品分子RPC的保留機(jī)理影響RPC的保留的因素：2.%B的選擇：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷反相色譜的選擇性：溶劑強(qiáng)度的選擇性溶劑類型的選擇性柱類型對(duì)選擇性的影響溫度對(duì)選擇性的影響1.溶劑強(qiáng)度的選擇性

2.溶劑類型的選擇性

3.柱類型對(duì)選擇性的影響

反相色譜中分析方法的建立：反相方法建立的推薦步驟：1.調(diào)整%B，使0.5<k<20，（1<k<10更好）2.檢查峰拖尾或塔板數(shù)低的現(xiàn)象3.如果必要，調(diào)整選擇性a.微調(diào)%Bb.改變有機(jī)溶劑c.混合有機(jī)溶劑d.改變柱類型e.改變溫度4.優(yōu)化柱條件（柱長、顆粒尺寸、流速）混合溶劑的使用：不同溶劑與柱類型的結(jié)合使用：正相色譜分析方法的建立正相色譜保留機(jī)理正相分析方法建立的推薦方法：

1.調(diào)整%B，使0.5<K<20，（氰基柱、己烷-丙醇做流動(dòng)相）2.檢查峰拖尾現(xiàn)象3.如必要，調(diào)整選擇性a.微調(diào)%Bb.改變有機(jī)溶劑種類（MC、MTBE、EtAc）；微調(diào)%Bc.混合有機(jī)溶劑d.改變柱類型（二醇、氨基、硅膠）；微調(diào)%B4.優(yōu)化色譜柱條件（柱長、顆粒大小、流速）NPC溶劑選擇性實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)色譜圖15×0.46cm硅膠柱，流動(dòng)相如前，2.0ml/min，350C。樣品為取代萘混合物，取代基：12-OCH3，21-NO2，31，2-（OCH3）2，41，5-（NO2）2；51-CHO，82-CHO，91-CH2CN，101-OH，111-COCH3，122-COCH3，132-OH。GPC分析方法SEC保留機(jī)理GFC:凝膠過濾色譜水相流動(dòng)相分離水溶性大分子固定相：多糖型凝膠、多孔交聯(lián)聚甲基丙稀酸酯類樹脂、交聯(lián)聚乙稀基醇樹脂、羥基化聚醚類親水性樹脂等。GPC:凝膠滲透色譜有機(jī)相流動(dòng)相分離脂溶性高分子固定相填料：苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列理想SEC填料的性能要求

SEC填料的色譜特征：SEC應(yīng)用：分離復(fù)雜樣品，然后再以高分辨率的HPLC分離純化.分析純化高分子化合物，以確定單聚、二聚和多聚物.以校正曲線估算大分子物質(zhì)分子量.實(shí)例:凝膠滲透色譜法測定羥乙基淀粉分子量色譜條件:1.色譜儀器：pharmaciaLKBHPLCpump2248KNAUERDifferental-referactometer2.色譜柱：ShodexOHpakSB-804HQ(聚羥甲基丙烯酸酯凝膠)規(guī)格：

柱名

排阻限(Pullulan)

粒徑(μm)

尺寸(mm)

SB-804

HQ

1,000,000

10

8.0

x

3003.流動(dòng)相：0.7%硫酸鈉+0.02%疊氮化鈉4.流速：0.5ml/min5.柱溫：35℃實(shí)驗(yàn)步驟：1.選用分子量為2000000和180的兩種淀粉確定該色譜柱的檢測窗口,見圖一。

圖一：分子量為180的淀粉的色譜圖tR1:19.673min分子量為2000000的淀粉的譜圖tR0:12.902min2.分別以分子量為11800、22800、47300、112000、212000淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，其相應(yīng)的GPC譜圖，見圖二。圖二：分子量為11800淀粉譜圖tR2：16.965分子量為22800淀粉譜圖tR2：16.230分子量為47300淀粉譜圖tR2：15.445分子量為112000淀粉譜圖tR2：14.930分子量為2000000淀粉譜圖tR2：13.7203.標(biāo)定曲線的確定4.未知淀粉譜圖

y=-2.692x+5.6637R2=0.9989X=(VR-VR1)/(VR0-VR1)tR1:19.673mintR0:12.902mintR1:14.530計(jì)算得：未知淀粉M=29046銀杏內(nèi)酯色譜條件：色譜柱：BaselineC184.6×150mm,5μm流動(dòng)相：甲醇：水：四氫呋喃=25：65：10流速：1ml/min檢測：ELSD,蒸發(fā)管溫度85℃，氣體流速4.0Bar系統(tǒng)評(píng)價(jià)峰號(hào)峰名保留時(shí)間/min峰面積mAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1銀杏內(nèi)酯A6.247158814.3445146.719/1.1742銀杏內(nèi)酯B7.615402280.1886086.1683.1611.1443白果內(nèi)酯8.870418603.3446992.2792.6221.0914銀杏內(nèi)酯C11.713330196.2507052.8474.8990.981

五種二氫吡啶類藥物色譜條件：色譜柱：BaselineC184.6×250mm,5μm流動(dòng)相：甲醇：水=75:25流速：1ml/min檢測：UV237nm系統(tǒng)評(píng)價(jià)峰號(hào)峰名保留時(shí)間/min峰面積mAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1雜質(zhì)12.74567928.125/1.8181/2硝苯地平4.927294767.2507041.1491.4751.4153尼群地平8.078648196.7508204.8964.0431.2834尼莫地平9.060810590.8758377.0292.2371.2605非洛地平14.5971114624.25010027.2095.3661.2556拉西地平25.787691817.81310525.8752.9571.229酚咖片色譜條件：色譜柱：BaselineC18,4.6×250mm,5μm流動(dòng)相：甲醇：水：冰醋酸=32：65：3流速：1ml/min檢測：UV275nm酚咖片色譜圖（d/qhq/酚咖片/B0029,5.0μl）系統(tǒng)評(píng)價(jià)峰號(hào)峰名保留時(shí)間/min峰面積MAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1撲熱息痛3.812285765.188///2咖啡因6.008183115.5476073.3806.2261.4383阿司匹林14.447180600.40612993.96617.5691.2174苯甲酸20.563475402.96916084.1758.9951.172五.HPLC定量分析方法

1.歸一化法：以峰面積為基礎(chǔ)的歸一化法加校正因子的歸一化法2.外標(biāo)法：外標(biāo)曲線法外標(biāo)一點(diǎn)法3.內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)曲線法內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)加校正因子法4.標(biāo)準(zhǔn)加入法1.歸一化法：1.1以峰面積為基礎(chǔ)的歸一化法1.2加校正因子的歸一化法

相對(duì)校正因子：2.外標(biāo)法

2.1外標(biāo)曲線法2.2外標(biāo)一點(diǎn)法：內(nèi)標(biāo)法3.1內(nèi)標(biāo)曲線法3.2內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：3.3內(nèi)標(biāo)加校正因子法：相對(duì)校正因子：例2校正因子法的測定復(fù)方炔諾酮片中炔諾酮的含量ODS色譜柱、甲醇－水（60：40）流動(dòng)相、監(jiān)測器UV280nm、對(duì)硝基甲苯為內(nèi)標(biāo)物。（1）校正因子的測定：取對(duì)硝基甲苯（內(nèi)標(biāo)物）、炔諾酮和炔雌醇對(duì)照品適量，用甲醇制成10ml容量，進(jìn)樣10ul，記錄色譜圖。重復(fù)3次。測得含0.0733ml/ml內(nèi)標(biāo)物、0.600mg/ml炔諾酮和0.035mg/ml炔雌醇的對(duì)照品溶液平均峰面積列于表。（2）試樣測定：取本品20片，精密稱定，求出平均片重（60.3mg/片）。研細(xì)后稱取732.8mg（約相當(dāng)于炔諾酮7.2mg）,用甲醇配制成10ml供試品溶液（含內(nèi)標(biāo)物0.0733mg/ml）。測得峰面積列于表。計(jì)算炔諾酮的校正因子和復(fù)方炔諾酮片中炔諾酮的含量。表復(fù)方炔諾酮片中各成分及內(nèi)標(biāo)物平均峰面積（μV·S）炔諾酮炔雌醇內(nèi)標(biāo)物（對(duì)硝基甲苯）對(duì)照品溶液1.981×1061.043×1056.587×105供試品溶液2.442×1061.387×1056.841×105炔諾酮的含量為：每片含炔諾酮的量為：