陜西省高中生物《12基因工程的基本操作程序》課件-選修3

1.2基因工程的基本操作程序12/27/202211.2基因工程的基本操作程序12/21/202211原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)：不編碼蛋白質(zhì),能調(diào)控遺傳信息表達12/27/20222原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下2真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子外顯子與RNA聚合酶結(jié)合位點編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列12/27/20223真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上3非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子啟動子原核真核基因的結(jié)構(gòu)12/27/20224非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子4原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼12/27/20225山西省孝義市第二中學(xué)原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都5基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞操作過程目的基因的檢測與鑒定12/27/20226基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目612/27/2022712/21/202277目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因的獲取供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細胞內(nèi)提取出來目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子12/27/20228目的基因主要是指___________________8獲得目的基因的方法

從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文庫？2.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫：部分基因文庫：(如cDNA文庫)基因的核苷酸序列等利用PCR技術(shù)擴增目的基因人工合成含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA未知序列基因較小已知序列已知序列12/27/20229獲得目的基因的方法從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文91.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！诵?.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達載體的構(gòu)建12/27/2022101.用一定的_________切割——核心3.將切下的目的10質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——核心同一種(二)基因表達載體的構(gòu)建4.過程:12/27/202211質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶重組DN11

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:12/27/202212科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努12基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因12/27/202213基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并13(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。轉(zhuǎn)化——目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達12/27/202214(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸14方法導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞吸收DNA分子(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞12/27/202215方法導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍15(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交12/27/202216(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定—①檢測16①直接分離法:用限制酶切成許多片斷2.構(gòu)建基因文庫將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。12/27/202217①直接分離法:用限制酶切成許多片斷2.構(gòu)建基因文庫將含有某17①直接分離法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶分別與載體連接受體細胞分別導(dǎo)入2.構(gòu)建基因文庫12/27/202218①直接分離法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶分18mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）DNA聚合酶雙鏈DNA②反轉(zhuǎn)錄法：2.構(gòu)建基因文庫12/27/202219mRNA②反轉(zhuǎn)錄法：2.構(gòu)建基因文庫12/21/2022119cDNA合成過程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。12/27/202220cDNA合成過程第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與R20基因組文庫：一般針對原核生物的基因，因為基因少部分基因文庫：一般針對真核生物的基因，如cDNA文庫文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種之間的基因交流可以部分基因可以說明基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性.基因文庫的構(gòu)建方法12/27/202221基因組文庫：一般針對原核生物的基因，因為基因少部分基因文庫：21依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。3．如何從基因文庫中得到所需要的基因？12/27/202222依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列3．如何從22利用PCR技術(shù)擴增目的基因原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。12/27/202223利用PCR技術(shù)擴增目的基因原理:12/21/20222323①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、_______________、___________、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：選修1P60聚合酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/27/202224①概念：PCR全稱為_______________，是一項24⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈12/27/202225⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、2512/27/20222612/21/20222626利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/27/202227山西省孝義市第二中學(xué)利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/21/202227山西省孝義27PCR技術(shù)擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈12/27/202228PCR技術(shù)擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DN28PCR技術(shù)DNA復(fù)制過程DNA變性（90～95℃）→退火（復(fù)性55~60℃）→子鏈延伸（70~75℃）→重復(fù)循環(huán)DNA復(fù)制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同點原則堿基互補配對條件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等不同點解旋方式氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解開解旋酶催化氫鍵逐步斷裂場所體外主要在細胞核中引物DNARNA酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等結(jié)果在短時間內(nèi)形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/27/202229PCR技術(shù)DNA復(fù)制過程DNA變性（90～95℃）→退火（復(fù)29目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：12/27/202230目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄合302.微生物作受體細胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少

處理細胞→

細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→_________細胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：12/27/2022312.微生物作受體細胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.轉(zhuǎn)化方31目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞整合到受體細胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達1.農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞的染色體上2.轉(zhuǎn)化12/27/202232目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌3212/27/20223312/21/20223333如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。12/27/202234如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)34細胞類型常用方法受體細胞轉(zhuǎn)化過程植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的DNA動物細胞顯微注射技術(shù)受精卵將含有目的基因的表達載體提純→取卵→受精卵→顯微注射→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→發(fā)育成為具有新性狀的動物微生物細胞Ca2+處理法原核細胞用Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胧荏w的方法12/27/202235細胞類型常用方法受體細胞轉(zhuǎn)化過程植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細胞將35

目的基因的檢測與鑒定檢測步驟目的方法原理工具現(xiàn)象1DNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對放射性同位素作標記的含目的基因的DNA片段雜交帶2檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNADNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對放射性同位素作標記的含目的基因的DNA片段雜交帶3檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交抗體的專一性特定抗體雜交帶(陽性反應(yīng))檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因12/27/202236目的基因的檢測與鑒定檢測步驟目的方法原理工具現(xiàn)象1DN36尋根問底——為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。12/27/202237尋根問底——提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不37尋根問底：將目的基因直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進行表達載體的構(gòu)建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物。此法目前爭議頗多，嚴格來講不算基因工程。12/27/202238尋根問底：將目的基因直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做38思考與探究：1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；12/27/202239思考與探究：1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以39（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等；（5）有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。12/27/202240（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標記；12/2140思考與探究2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。12/27/202241思考與探究2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理,你413.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。思考與探究：12/27/2022423.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能42（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達載體。（3）將表達載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。（4）培養(yǎng)進入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進行設(shè)計？12/27/202243（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。4432、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提取④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥1、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460個）放入DNA擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是（）個A.540B.8100C.17280D.756012/27/2022442、下列屬于獲取目的基因的方法的是()1、在基443.細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對目的基因是否導(dǎo)入進行檢測C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基因連接4.有關(guān)基因工程的敘述正確的是A．限制酶只在獲得目的基因時才用B．重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的C．質(zhì)粒都可作為運載體D．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料12/27/2022453.細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工455.哪項不是基因表達載體的組成部分()

A.啟動子B.終止密碼C.標記基因D.目的基因6.(2008,全國高考)已知某種限制酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點。如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段。現(xiàn)有多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種數(shù)是A．3B．4 C.9D．12abcd12/27/2022465.哪項不是基因表達載體的組成部分()A．3461.2基因工程的基本操作程序12/27/2022471.2基因工程的基本操作程序12/21/2022147原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)：不編碼蛋白質(zhì),能調(diào)控遺傳信息表達12/27/202248原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下48真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子外顯子與RNA聚合酶結(jié)合位點編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列12/27/202249真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上49非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子啟動子原核真核基因的結(jié)構(gòu)12/27/202250非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子50原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼12/27/202251山西省孝義市第二中學(xué)原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都51基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞操作過程目的基因的檢測與鑒定12/27/202252基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目5212/27/20225312/21/2022753目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因的獲取供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細胞內(nèi)提取出來目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子12/27/202254目的基因主要是指___________________54獲得目的基因的方法

從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文庫？2.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫：部分基因文庫：(如cDNA文庫)基因的核苷酸序列等利用PCR技術(shù)擴增目的基因人工合成含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA未知序列基因較小已知序列已知序列12/27/202255獲得目的基因的方法從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文551.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。——核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達載體的構(gòu)建12/27/2022561.用一定的_________切割——核心3.將切下的目的56質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——核心同一種(二)基因表達載體的構(gòu)建4.過程:12/27/202257質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶重組DN57

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:12/27/202258科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努58基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因12/27/202259基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并59(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。轉(zhuǎn)化——目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達12/27/202260(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸60方法導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞吸收DNA分子(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞12/27/202261方法導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍61(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交12/27/202262(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定—①檢測62①直接分離法:用限制酶切成許多片斷2.構(gòu)建基因文庫將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。12/27/202263①直接分離法:用限制酶切成許多片斷2.構(gòu)建基因文庫將含有某63①直接分離法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶分別與載體連接受體細胞分別導(dǎo)入2.構(gòu)建基因文庫12/27/202264①直接分離法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶分64mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）DNA聚合酶雙鏈DNA②反轉(zhuǎn)錄法：2.構(gòu)建基因文庫12/27/202265mRNA②反轉(zhuǎn)錄法：2.構(gòu)建基因文庫12/21/2022165cDNA合成過程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。12/27/202266cDNA合成過程第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與R66基因組文庫：一般針對原核生物的基因，因為基因少部分基因文庫：一般針對真核生物的基因，如cDNA文庫文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種之間的基因交流可以部分基因可以說明基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性.基因文庫的構(gòu)建方法12/27/202267基因組文庫：一般針對原核生物的基因，因為基因少部分基因文庫：67依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。3．如何從基因文庫中得到所需要的基因？12/27/202268依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列3．如何從68利用PCR技術(shù)擴增目的基因原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。12/27/202269利用PCR技術(shù)擴增目的基因原理:12/21/20222369①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、_______________、___________、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：選修1P60聚合酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/27/202270①概念：PCR全稱為_______________，是一項70⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈12/27/202271⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、7112/27/20227212/21/20222672利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/27/202273山西省孝義市第二中學(xué)利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/21/202227山西省孝義73PCR技術(shù)擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈12/27/202274PCR技術(shù)擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DN74PCR技術(shù)DNA復(fù)制過程DNA變性（90～95℃）→退火（復(fù)性55~60℃）→子鏈延伸（70~75℃）→重復(fù)循環(huán)DNA復(fù)制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同點原則堿基互補配對條件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等不同點解旋方式氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解開解旋酶催化氫鍵逐步斷裂場所體外主要在細胞核中引物DNARNA酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等結(jié)果在短時間內(nèi)形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技術(shù)擴增目的基因12/27/202275PCR技術(shù)DNA復(fù)制過程DNA變性（90～95℃）→退火（復(fù)75目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：12/27/202276目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄合762.微生物作受體細胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少

處理細胞→

細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→_________細胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：12/27/2022772.微生物作受體細胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.轉(zhuǎn)化方77目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞整合到受體細胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達1.農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞的染色體上2.轉(zhuǎn)化12/27/202278目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌7812/27/20227912/21/20223379如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。12/27/202280如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)80細胞類型常用方法受體細胞轉(zhuǎn)化過程植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的DNA動物細胞顯微注射技術(shù)受精卵將含有目的基因的表達載體提純→取卵→受精卵→顯微注射→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→發(fā)育成為具有新性狀的動物微生物細胞Ca2+處理法原核細胞用Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胧荏w的方法12/27/202281細胞類型常用方法受體細胞轉(zhuǎn)化過程植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細胞將81

目的基因的檢測與鑒定檢測步驟目的方法原理工具現(xiàn)象1DNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對放射性同位素作標記的含目的基因的DNA片段雜交帶2檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNADNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對放射性同位素作標記的含目的基因的DNA片段雜交帶3檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交抗體的專一性特定抗體雜交帶(陽性反應(yīng))檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因12/27/202282目的基因的檢測與鑒定檢測步驟目的方法原理工具現(xiàn)象1DN82尋根問底——為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。12/27/202283尋根問底——提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不83尋根問底：將目的基因直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進行表達載體的構(gòu)建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物。此法目前爭議頗多，嚴格來講不算基因工程。12/27/202284尋根問底：將目的基因直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做84思考與探究：1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；12/27/202285思考與探究：1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以85（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等；（5）有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。12/27/202286（3）目的基因