10-動物細(xì)胞融合課件

第十章動物細(xì)胞融合

細(xì)胞融合機理單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)

單克隆抗體技術(shù)細(xì)胞融合的基礎(chǔ)知識第十章動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合機理單克隆抗體的單克隆抗體技術(shù)1第一節(jié)細(xì)胞融合的基礎(chǔ)知識

細(xì)胞融合（cellfusion）：兩個或多個細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細(xì)胞融合。分為自發(fā)細(xì)胞融合和誘導(dǎo)細(xì)胞融合。細(xì)胞雜交（cellhybridization）：指用人工方法把不同類型的兩個或兩個以上細(xì)胞合并成一個細(xì)胞的技術(shù)。所得到的融合細(xì)胞叫雜交細(xì)胞。融合指數(shù)（fusionindex,FI）：指細(xì)胞融合的效率。1反映融合實驗中多核細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。FI=（對照組細(xì)胞數(shù)-實驗組細(xì)胞數(shù)）/實驗組細(xì)胞數(shù)2反映融合實驗中多核細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)出現(xiàn)頻率。FI=多核細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)/所有細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)第一節(jié)細(xì)胞融合的基礎(chǔ)知識細(xì)胞融合（cellfu2一自發(fā)細(xì)胞融合自發(fā)細(xì)胞融合（spontaneouscellfusion）：指在未施加任何條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。體內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合

可以在受精過程、個體內(nèi)的肌管形成、胚胎著床、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成、腫瘤細(xì)胞的融合等過程中觀察到。體外細(xì)胞的自發(fā)融合小鼠和雞成肌細(xì)胞的融合：可在原代培養(yǎng)中觀察到，只有處于G1期的成肌細(xì)胞才能彼此發(fā)生融合。

腫瘤細(xì)胞的融合：體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)一樣彼此發(fā)生融合一自發(fā)細(xì)胞融合自發(fā)細(xì)胞融合（spontane3二誘導(dǎo)細(xì)胞融合

誘導(dǎo)細(xì)胞融合（inducedcellfusion）：指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。

人工誘導(dǎo)形成的融合細(xì)胞有兩類：同核體：由同一親本細(xì)胞融合而來。異核體：由不同親本細(xì)胞融合而來。二誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合（induc4三細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合技術(shù)研究細(xì)胞間遺傳信息轉(zhuǎn)移、基因在染色體的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。細(xì)胞融合技術(shù)的主要過程：

1、制備親本細(xì)胞；2、誘導(dǎo)細(xì)胞融合；3、篩選雜合細(xì)胞。細(xì)胞融合的主要過程：

細(xì)胞在誘導(dǎo)劑或正弦電場作用下凝聚，彼此靠近；兩個相鄰細(xì)胞之間的質(zhì)膜相互融合；質(zhì)膜上的受體、糖蛋白、糖脂等質(zhì)膜成分在融合后的質(zhì)膜上重新分布；細(xì)胞質(zhì)發(fā)生融合；細(xì)胞核融合，形成單核融合細(xì)胞。三細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)研究細(xì)胞間遺5植物細(xì)胞融合與人造小鼠培育過程植物細(xì)胞融合與人造小鼠培育過程61.親本細(xì)胞的制備

兩種完整細(xì)胞融合轉(zhuǎn)移的整套染色體組、核外DNA和細(xì)胞質(zhì)因子。親本細(xì)胞可以是兩個完整細(xì)胞；

親本細(xì)胞可以是胞質(zhì)體和核體胞質(zhì)體（無核細(xì)胞）：由絕大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)組成，外面包有細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。核體(小型細(xì)胞)：含有完整細(xì)胞核，外面包有細(xì)胞膜和少量細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)。將細(xì)胞接種到塑料培養(yǎng)皿上，加入一定量的細(xì)胞松弛素B（CB）處理，將培養(yǎng)皿中長有細(xì)胞的一面朝下置于離心管中離心，可分開胞質(zhì)體和核體。胞質(zhì)體和核體單獨存活的時間不超過2小時。

親本細(xì)胞可以是微細(xì)胞含有幾條甚至一條染色體的微核，外面包有細(xì)胞膜和少量細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)。動物細(xì)胞經(jīng)秋水仙素處理后，再經(jīng)CB處理和離心作用形成。微細(xì)胞與核體不同，微細(xì)胞含有微核；核體含有完整細(xì)胞核。1.親本細(xì)胞的制備兩種完整細(xì)72.誘導(dǎo)細(xì)胞融合

人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：病毒誘導(dǎo)：滅活的仙臺病毒化學(xué)誘導(dǎo)：PEP、Ca2+、溶血卵磷脂等物理誘導(dǎo)：電誘導(dǎo)2.誘導(dǎo)細(xì)胞融合人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：83.篩選雜合細(xì)胞細(xì)胞融合后，存在5類種型的細(xì)胞：異核體（雙核或多核）、兩種同核體(雙核或多核)以及未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞。篩選的基本原理是把雜合體從同核體以及未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞中分離出來。篩選的方法非選擇性篩選：利用雜交細(xì)胞生長比親本細(xì)胞快的現(xiàn)象，用機械的方法（如毛細(xì)管吸取法）把單個雜交細(xì)胞挑選出來，分裂繁殖，培養(yǎng)出細(xì)胞克隆。所以也稱為單細(xì)胞克隆。選擇性篩選：根據(jù)細(xì)胞對藥物的抗性、營養(yǎng)要求或溫度敏感性等的不同，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，將雜交細(xì)胞分離出來。常用方法有：抗藥性篩選；營養(yǎng)陷型篩選；溫度敏感型篩選等。3.篩選雜合細(xì)胞細(xì)胞融合后，存在5類種型的細(xì)胞：異核體（雙核9第二節(jié)單克隆抗體技術(shù)1975年，英國科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。

B淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無限增殖，因此雜交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。第二節(jié)單克隆抗體技術(shù)1975年，英國科學(xué)家Milstei10單克隆抗體技術(shù)（雜交瘤技術(shù)）

單克隆抗體：一種漿細(xì)胞只產(chǎn)生一種類型的免疫球蛋白分子。從一個單克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體分子，即稱為單克隆抗體，其具有獨特的均一結(jié)構(gòu)。原理：正常淋巴細(xì)胞在體外無法培養(yǎng)成功（Ｂ淋巴細(xì)胞）。多發(fā)性骨髓瘤疾病中的B細(xì)胞腫瘤，在漿細(xì)胞中發(fā)生了在成瘤轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生免疫球蛋白，并能在體外生長易被克隆。單克隆抗體技術(shù)（雜交瘤技術(shù)）單克隆抗體：一種漿細(xì)胞只產(chǎn)生一11單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體制備流程：用特異抗原免疫實驗動物取含大量B細(xì)胞的脾細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合篩選雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體制備流程：12雜交瘤技術(shù)過程雜交瘤技術(shù)過程1310_動物細(xì)胞融合課件14一親本的選擇B淋巴細(xì)胞經(jīng)特定抗原免疫的能產(chǎn)生目的抗體的動物淋巴細(xì)胞；免疫動物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或有相近的親源關(guān)系。如：鼠－鼠雜交瘤細(xì)胞；人鼠或鼠兔雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定。一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫(向動物腹腔內(nèi)注射抗體)、加強免疫(向動物靜脈內(nèi)注射抗體)三個過程。如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。

一親本的選擇B淋巴細(xì)胞一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫15骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)

骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。骨髓瘤細(xì)胞：

不能馬上使用，需同時具有兩個獨特的性質(zhì)：骨髓瘤細(xì)胞系不能分泌抗體，否則雜交瘤細(xì)胞將分泌混合抗體；要選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型

（TK-）。骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系16二雜交瘤細(xì)胞建立的技術(shù)關(guān)鍵

親本細(xì)胞的準(zhǔn)備1、致敏B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備材料：8周齡的BALB/C系小白鼠，少數(shù)用Lou系大鼠；方法：腹腔注射，0.5ml/次3-4天一次共3-4周；皮下注射，0.1ml/次；殺死前3天進行一次加強注射（靜脈）；目的抗原：各種病毒，細(xì)菌，癌細(xì)胞等；病毒抗原（lmg/mlPSS）：福氏完全佐劑（Freund）1:1等量混合制成乳劑。

加強注射：可在抗原乳劑中加入細(xì)菌脂多糖（LPS），促進Ｂ淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高脾細(xì)胞分泌抗體的能力

抗體效價檢查：如果檢查抗體效價低，可進行多次加強免疫。制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。二雜交瘤細(xì)胞建立的技術(shù)關(guān)鍵親本細(xì)胞的準(zhǔn)備17親本細(xì)胞的準(zhǔn)備－雜交瘤細(xì)胞2、骨髓瘤細(xì)胞

要選擇與B淋巴細(xì)胞來源相同的代謝缺陷型(ＨGPRT-或ＴＫ-)克隆形成率達到80%以上。取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。親本細(xì)胞的準(zhǔn)備－雜交瘤細(xì)胞2、骨髓瘤細(xì)胞18雜交細(xì)胞融合將骨髓細(xì)胞：脾細(xì)胞按1:4～1:10，一般為1:5混合，并加入PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合，混合時間在１min內(nèi)。30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。離心，棄上清，用20％小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。

細(xì)胞分裝：混合細(xì)胞中加入HAT培養(yǎng)液，濃度為２×105細(xì)胞/0.1ml培養(yǎng)基，５-6天出現(xiàn)新細(xì)胞克隆。雜交細(xì)胞融合19骨髓瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞沒融合的淋巴細(xì)胞6-10天死亡雜交瘤細(xì)胞沒融合的骨髓細(xì)胞如何選擇？

三融合細(xì)胞的篩選骨髓瘤細(xì)胞沒融合的淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞沒融合的骨髓細(xì)胞三融合20培養(yǎng)基的選擇

HAT培養(yǎng)基：在培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（Ｈ）、氨基喋呤（Ａ）及胸腺嘧啶脫氧核苷（Ｔ）。培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的選擇HAT培養(yǎng)基：在培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤21篩選原理DNA的合成：正常途徑：糖、氨基酸——核苷酸——DNA，可以被氨基蝶呤阻斷。

胸腺嘧啶核苷激酶（TK）補救途徑：核苷酸前體——核苷酸——DNA

次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）篩選原理DNA的合成：22氨基蝶呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細(xì)胞不能采用該途徑合成DNA。融合所用的瘤細(xì)胞一般是HPRT－與TK－缺陷型，因此也不能采用補救途徑合成DNA。兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？瘤細(xì)胞（未融合的和多聚體）命運：因不能正常合成DNA而死亡。融合細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的HPRT與TK，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。氨基蝶呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細(xì)23利用HAT培養(yǎng)基選擇的基礎(chǔ)二氫葉酸FH2甘氨酸

Gly四氫葉酸FH4

天冬氨酸Asp

DNAdGTPdATPdTTP次黃嘌呤核苷酸HMP次黃嘌呤

H胸腺嘧啶T

HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶)氨基喋呤(A)

TK（胸腺嘧啶核苷激酶）

利用HAT培養(yǎng)基二氫葉酸甘氨酸四氫葉酸天冬氨酸DNAd2410_動物細(xì)胞融合課件25四分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選

——ELISA方法檢測抗體

雜交瘤抗體檢測

抗原結(jié)合法第二抗體法

克隆選擇

有限稀法５個／0.2ml軟瓊脂法0.5%瓊脂，１～５個細(xì)胞／0.2ml將融合的細(xì)胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個細(xì)胞之間，培養(yǎng)一段時間后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞。找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體。四分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選

——ELISA方法檢測抗26第三節(jié)單克隆抗體的大量生產(chǎn)1）實體瘤法

對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107cells／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml。待腫瘤達到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。采血量有限。第三節(jié)單克隆抗體的大量生產(chǎn)1）實體瘤法272）腹水制備法

腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml，這是目前最常用的方法。2）腹水制備法腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～283）單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)

-生物反應(yīng)器抗體效價可達10～100mg/ml。如：美國Damon公司申請專利－中空微球體（微末）技術(shù)，0.1～1g抗體/L培養(yǎng)基.不為其他免疫球蛋白污染。有一定純度。用無血清培養(yǎng)基；純化用硫酸銨沉淀，DEAE為介質(zhì)在離子交換層析柱上提純。

使用單克隆抗體的風(fēng)險（不能含病毒）多數(shù)哺乳動物細(xì)胞在它們的染色體中含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳信息；（純系）鼠細(xì)胞常釋放病毒――逆轉(zhuǎn)錄病毒；有關(guān)管理部門規(guī)定：除非單克隆抗體和雜交瘤無病毒，否則不能批準(zhǔn)；美國FDA發(fā)現(xiàn)鼠源雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗?jié)撛谖廴镜牟《荆合俨《?、胸腺病毒、腦脊髓炎心臟炎病毒、腦脊髓炎病毒、呼吸腸道病毒、出血熱病毒、肝炎病毒、缺肢畸胎病毒、多形瘤等。3）單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)

-生物反應(yīng)器抗體效價29生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞：WuT3雜交瘤細(xì)胞生物反應(yīng)器：采用3.5升、14升、75升攪拌式生物反應(yīng)器，具有自動消毒、控制溫度、轉(zhuǎn)速、DO和pH等功能。培養(yǎng)液：RPMI1640中添加慶大霉素至100單位、胎牛血清（NcS）或健康人血清（HuS）、添加劑HEN（蛋白胨和糖類）。生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞：WuT3雜30培養(yǎng)方式

控制溫度在37℃、pH7.1、轉(zhuǎn)速40-60r/min、DO在30-50%，分批和半連續(xù)培養(yǎng)。離心機除去細(xì)胞，收集上清液用于單抗?jié)舛?、免疫活性、熱原等分析測定。

3.5升攪拌式生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)，WuT3雜交瘤細(xì)胞經(jīng)48小時適應(yīng)期后進入對數(shù)生長期，維持24小時后進入平衡期，這一階段持續(xù)約48小時，分泌單抗。繼續(xù)放大至75升生物反應(yīng)器，半連續(xù)生產(chǎn)，細(xì)胞濃度達到1.5×106/ml，單抗產(chǎn)量為50-70μg/ml。這樣每間隔2天收獲1批，獲得上清液40升，平均日產(chǎn)單抗達1克。培養(yǎng)方式控制溫度在37℃、pH7.1、轉(zhuǎn)速40-60r/m31抗體工程動物抗原的不足：例如——雖然可以識別抗原卻不能激活補體系統(tǒng)，常被人免疫系統(tǒng)識別產(chǎn)生人抗鼠抗體或激發(fā)免疫反應(yīng)，易被清除等?？贵w修飾與人源化抗體：例如將人抗體恒定區(qū)與鼠可變區(qū)拼接?？贵w工程動物抗原的不足：例如——雖然可以識別抗原卻不能激活補32單克隆抗體的應(yīng)用提高免疫分析或其他新分析的靈敏度和重復(fù)性

組織相容性抗原、互補成分、血液凝固、血型抗原、干擾素、雌激素、精子抗原、黃體酮、人生長激素、血細(xì)胞介素、促胃液素診斷

性傳播疾病、血型、懷孕或排卵、癌（早期癌抗原的檢測）治療

藥過劑量的校正、減少由骨髓移植帶來的危險、檢測癌轉(zhuǎn)移、治療癌癥（直接地或定向細(xì)胞毒藥物）、糖尿病。

T細(xì)胞雜交瘤

淋巴細(xì)胞活素T細(xì)胞生產(chǎn)：免疫干擾素、巨細(xì)胞激活因子、白細(xì)胞介素－1.2、集落刺激因子（CSF）、B細(xì)胞分化因子（BCDF）。單克隆抗體的應(yīng)用提高免疫分析或其他新分析的靈敏度和重復(fù)性33小結(jié)細(xì)胞融合的定義、原理與方法融合細(xì)胞的篩選方法：雜交瘤細(xì)胞的篩選方法單克隆抗體的制備方法小結(jié)細(xì)胞融合的定義、原理與方法34第十章動物細(xì)胞融合

細(xì)胞融合機理單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)

單克隆抗體技術(shù)細(xì)胞融合的基礎(chǔ)知識第十章動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合機理單克隆抗體的單克隆抗體技術(shù)35第一節(jié)細(xì)胞融合的基礎(chǔ)知識

細(xì)胞融合（cellfusion）：兩個或多個細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細(xì)胞融合。分為自發(fā)細(xì)胞融合和誘導(dǎo)細(xì)胞融合。細(xì)胞雜交（cellhybridization）：指用人工方法把不同類型的兩個或兩個以上細(xì)胞合并成一個細(xì)胞的技術(shù)。所得到的融合細(xì)胞叫雜交細(xì)胞。融合指數(shù)（fusionindex,FI）：指細(xì)胞融合的效率。1反映融合實驗中多核細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。FI=（對照組細(xì)胞數(shù)-實驗組細(xì)胞數(shù)）/實驗組細(xì)胞數(shù)2反映融合實驗中多核細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)出現(xiàn)頻率。FI=多核細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)/所有細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)第一節(jié)細(xì)胞融合的基礎(chǔ)知識細(xì)胞融合（cellfu36一自發(fā)細(xì)胞融合自發(fā)細(xì)胞融合（spontaneouscellfusion）：指在未施加任何條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。體內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合

可以在受精過程、個體內(nèi)的肌管形成、胚胎著床、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成、腫瘤細(xì)胞的融合等過程中觀察到。體外細(xì)胞的自發(fā)融合小鼠和雞成肌細(xì)胞的融合：可在原代培養(yǎng)中觀察到，只有處于G1期的成肌細(xì)胞才能彼此發(fā)生融合。

腫瘤細(xì)胞的融合：體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)一樣彼此發(fā)生融合一自發(fā)細(xì)胞融合自發(fā)細(xì)胞融合（spontane37二誘導(dǎo)細(xì)胞融合

誘導(dǎo)細(xì)胞融合（inducedcellfusion）：指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。

人工誘導(dǎo)形成的融合細(xì)胞有兩類：同核體：由同一親本細(xì)胞融合而來。異核體：由不同親本細(xì)胞融合而來。二誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合（induc38三細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合技術(shù)研究細(xì)胞間遺傳信息轉(zhuǎn)移、基因在染色體的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。細(xì)胞融合技術(shù)的主要過程：

1、制備親本細(xì)胞；2、誘導(dǎo)細(xì)胞融合；3、篩選雜合細(xì)胞。細(xì)胞融合的主要過程：

細(xì)胞在誘導(dǎo)劑或正弦電場作用下凝聚，彼此靠近；兩個相鄰細(xì)胞之間的質(zhì)膜相互融合；質(zhì)膜上的受體、糖蛋白、糖脂等質(zhì)膜成分在融合后的質(zhì)膜上重新分布；細(xì)胞質(zhì)發(fā)生融合；細(xì)胞核融合，形成單核融合細(xì)胞。三細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)研究細(xì)胞間遺39植物細(xì)胞融合與人造小鼠培育過程植物細(xì)胞融合與人造小鼠培育過程401.親本細(xì)胞的制備

兩種完整細(xì)胞融合轉(zhuǎn)移的整套染色體組、核外DNA和細(xì)胞質(zhì)因子。親本細(xì)胞可以是兩個完整細(xì)胞；

親本細(xì)胞可以是胞質(zhì)體和核體胞質(zhì)體（無核細(xì)胞）：由絕大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)組成，外面包有細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。核體(小型細(xì)胞)：含有完整細(xì)胞核，外面包有細(xì)胞膜和少量細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)。將細(xì)胞接種到塑料培養(yǎng)皿上，加入一定量的細(xì)胞松弛素B（CB）處理，將培養(yǎng)皿中長有細(xì)胞的一面朝下置于離心管中離心，可分開胞質(zhì)體和核體。胞質(zhì)體和核體單獨存活的時間不超過2小時。

親本細(xì)胞可以是微細(xì)胞含有幾條甚至一條染色體的微核，外面包有細(xì)胞膜和少量細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)。動物細(xì)胞經(jīng)秋水仙素處理后，再經(jīng)CB處理和離心作用形成。微細(xì)胞與核體不同，微細(xì)胞含有微核；核體含有完整細(xì)胞核。1.親本細(xì)胞的制備兩種完整細(xì)412.誘導(dǎo)細(xì)胞融合

人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：病毒誘導(dǎo)：滅活的仙臺病毒化學(xué)誘導(dǎo)：PEP、Ca2+、溶血卵磷脂等物理誘導(dǎo)：電誘導(dǎo)2.誘導(dǎo)細(xì)胞融合人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：423.篩選雜合細(xì)胞細(xì)胞融合后，存在5類種型的細(xì)胞：異核體（雙核或多核）、兩種同核體(雙核或多核)以及未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞。篩選的基本原理是把雜合體從同核體以及未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞中分離出來。篩選的方法非選擇性篩選：利用雜交細(xì)胞生長比親本細(xì)胞快的現(xiàn)象，用機械的方法（如毛細(xì)管吸取法）把單個雜交細(xì)胞挑選出來，分裂繁殖，培養(yǎng)出細(xì)胞克隆。所以也稱為單細(xì)胞克隆。選擇性篩選：根據(jù)細(xì)胞對藥物的抗性、營養(yǎng)要求或溫度敏感性等的不同，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，將雜交細(xì)胞分離出來。常用方法有：抗藥性篩選；營養(yǎng)陷型篩選；溫度敏感型篩選等。3.篩選雜合細(xì)胞細(xì)胞融合后，存在5類種型的細(xì)胞：異核體（雙核43第二節(jié)單克隆抗體技術(shù)1975年，英國科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。

B淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無限增殖，因此雜交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。第二節(jié)單克隆抗體技術(shù)1975年，英國科學(xué)家Milstei44單克隆抗體技術(shù)（雜交瘤技術(shù)）

單克隆抗體：一種漿細(xì)胞只產(chǎn)生一種類型的免疫球蛋白分子。從一個單克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體分子，即稱為單克隆抗體，其具有獨特的均一結(jié)構(gòu)。原理：正常淋巴細(xì)胞在體外無法培養(yǎng)成功（Ｂ淋巴細(xì)胞）。多發(fā)性骨髓瘤疾病中的B細(xì)胞腫瘤，在漿細(xì)胞中發(fā)生了在成瘤轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生免疫球蛋白，并能在體外生長易被克隆。單克隆抗體技術(shù)（雜交瘤技術(shù)）單克隆抗體：一種漿細(xì)胞只產(chǎn)生一45單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體制備流程：用特異抗原免疫實驗動物取含大量B細(xì)胞的脾細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合篩選雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體制備流程：46雜交瘤技術(shù)過程雜交瘤技術(shù)過程4710_動物細(xì)胞融合課件48一親本的選擇B淋巴細(xì)胞經(jīng)特定抗原免疫的能產(chǎn)生目的抗體的動物淋巴細(xì)胞；免疫動物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或有相近的親源關(guān)系。如：鼠－鼠雜交瘤細(xì)胞；人鼠或鼠兔雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定。一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫(向動物腹腔內(nèi)注射抗體)、加強免疫(向動物靜脈內(nèi)注射抗體)三個過程。如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。

一親本的選擇B淋巴細(xì)胞一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫49骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)

骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。骨髓瘤細(xì)胞：

不能馬上使用，需同時具有兩個獨特的性質(zhì)：骨髓瘤細(xì)胞系不能分泌抗體，否則雜交瘤細(xì)胞將分泌混合抗體；要選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型

（TK-）。骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系50二雜交瘤細(xì)胞建立的技術(shù)關(guān)鍵

親本細(xì)胞的準(zhǔn)備1、致敏B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備材料：8周齡的BALB/C系小白鼠，少數(shù)用Lou系大鼠；方法：腹腔注射，0.5ml/次3-4天一次共3-4周；皮下注射，0.1ml/次；殺死前3天進行一次加強注射（靜脈）；目的抗原：各種病毒，細(xì)菌，癌細(xì)胞等；病毒抗原（lmg/mlPSS）：福氏完全佐劑（Freund）1:1等量混合制成乳劑。

加強注射：可在抗原乳劑中加入細(xì)菌脂多糖（LPS），促進Ｂ淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高脾細(xì)胞分泌抗體的能力

抗體效價檢查：如果檢查抗體效價低，可進行多次加強免疫。制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。二雜交瘤細(xì)胞建立的技術(shù)關(guān)鍵親本細(xì)胞的準(zhǔn)備51親本細(xì)胞的準(zhǔn)備－雜交瘤細(xì)胞2、骨髓瘤細(xì)胞

要選擇與B淋巴細(xì)胞來源相同的代謝缺陷型(ＨGPRT-或ＴＫ-)克隆形成率達到80%以上。取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。親本細(xì)胞的準(zhǔn)備－雜交瘤細(xì)胞2、骨髓瘤細(xì)胞52雜交細(xì)胞融合將骨髓細(xì)胞：脾細(xì)胞按1:4～1:10，一般為1:5混合，并加入PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合，混合時間在１min內(nèi)。30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。離心，棄上清，用20％小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。

細(xì)胞分裝：混合細(xì)胞中加入HAT培養(yǎng)液，濃度為２×105細(xì)胞/0.1ml培養(yǎng)基，５-6天出現(xiàn)新細(xì)胞克隆。雜交細(xì)胞融合53骨髓瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞沒融合的淋巴細(xì)胞6-10天死亡雜交瘤細(xì)胞沒融合的骨髓細(xì)胞如何選擇？

三融合細(xì)胞的篩選骨髓瘤細(xì)胞沒融合的淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞沒融合的骨髓細(xì)胞三融合54培養(yǎng)基的選擇

HAT培養(yǎng)基：在培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（Ｈ）、氨基喋呤（Ａ）及胸腺嘧啶脫氧核苷（Ｔ）。培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的選擇HAT培養(yǎng)基：在培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤55篩選原理DNA的合成：正常途徑：糖、氨基酸——核苷酸——DNA，可以被氨基蝶呤阻斷。

胸腺嘧啶核苷激酶（TK）補救途徑：核苷酸前體——核苷酸——DNA

次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）篩選原理DNA的合成：56氨基蝶呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細(xì)胞不能采用該途徑合成DNA。融合所用的瘤細(xì)胞一般是HPRT－與TK－缺陷型，因此也不能采用補救途徑合成DNA。兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？瘤細(xì)胞（未融合的和多聚體）命運：因不能正常合成DNA而死亡。融合細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的HPRT與TK，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。氨基蝶呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細(xì)57利用HAT培養(yǎng)基選擇的基礎(chǔ)二氫葉酸FH2甘氨酸

Gly四氫葉酸FH4

天冬氨酸Asp

DNAdGTPdATPdTTP次黃嘌呤核苷酸HMP次黃嘌呤

H胸腺嘧啶T

HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶)氨基喋呤(A)

TK（胸腺嘧啶核苷激酶）

利用HAT培養(yǎng)基二氫葉酸甘氨酸四氫葉酸天冬氨酸DNAd5810_動物細(xì)胞融合課件59四分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選

——ELISA方法檢測抗體

雜交瘤抗體檢測

抗原結(jié)合法第二抗體法

克隆選擇

有限稀法５個／0.2ml軟瓊脂法0.5%瓊脂，１～５個細(xì)胞／0.2ml將融合的細(xì)胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個細(xì)胞之間，培養(yǎng)一段時間后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞。找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體。四分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選

——ELISA方法檢測抗60第三節(jié)單克隆抗體的大量生產(chǎn)1）實體瘤法

對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107cells／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml。待腫瘤達到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。采血量有限。第三節(jié)單克隆抗體的大量生產(chǎn)1）實體瘤法612）腹水制備法

腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml，這是目前最常用的方法。2）腹水制備法腹腔注射1×1