ABO血型的基因型檢測課件

ABO血型的基因型檢測ABO血型的基因型檢測1一、實驗?zāi)康呐c原理1.目的了解ABO血型的遺傳學(xué)原理掌握在DNA水平上鑒定ABO基因型的基本原理和操作過程一、實驗?zāi)康呐c原理1.目的22.原理ABO血型抗原是由IA;IB;i

基因編碼的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成的紅細(xì)胞膜表面的糖蛋白和糖脂。ABO基因座位位于第九號染色體上,其3個等位基因IA、IB、i

形成4種主要的血型A、B、AB和O。ABO血型系統(tǒng)遺傳方式

A血型：IAIA;IAiB血型：IBIB;IBiAB血型：IAIBO血型：ii2.原理ABO血型抗原是由IA;IB;i3IA基因與IB基因之間在cDNA上有7個單堿基替換：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。

i基因與IA基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失，出現(xiàn)框移突變，使第352位的1-rA變成了TAA(終止密碼子)，提前終止了轉(zhuǎn)移酶的合成，導(dǎo)致合成的轉(zhuǎn)移酶沒有活性區(qū)，所以在紅細(xì)胞膜上沒有Ａ，Ｂ抗原的產(chǎn)生。IA基因與IB基因之間在cDNA上有7個單堿基替換：A2944根據(jù)genebank上公布的IA、IB、i基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增ABO糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的2個區(qū)段。

引物由上海生工合成，引物序列為：引物1：5′-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3′引物2：5′-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3′引物3：5′-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3′引物4：5′-CACCGACCCCCCGAAGAA-3′根據(jù)genebank上公布的IA、IB、i5用1、2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因IA，IB產(chǎn)物為200bp，等位基因i

(258位G缺失)產(chǎn)物為199bp。限制性內(nèi)切酶kpnI：i基因PCR產(chǎn)物199bp切出171bp＋28bp，IA，IB基因PCR產(chǎn)物200bp沒有該酶的切點依然是200bp。用3、4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因IA、IB、i的產(chǎn)物均為159bp。限制性內(nèi)切酶AluI：IB基因PCR產(chǎn)物159bp切出118bp＋41bp，IA、i基因PCR產(chǎn)物159bp沒有該酶的切點依然是159bp用1、2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因IA，IB產(chǎn)物為206kpnI（1，2引物產(chǎn)物）消化：A，B基因200bp：————————200O基因199bp:———————17128kpnI（1，2引物產(chǎn)物）消化：A，B基因7AluI消化(3,4引物產(chǎn)物):A，O基因159bp：————————159B基因159bp:———————11841AluI消化(3,4引物產(chǎn)物):A，O基因81，2引物產(chǎn)物kpnI3,4引物產(chǎn)物AlunIA200159B200118+41O171+281591，2引物產(chǎn)物3,4引物產(chǎn)物A200159B20019二、實驗用品PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和電泳槽、微型移液器、恒溫水浴鍋、凝膠成像系統(tǒng)等，離心管、PCR管、移液器槍頭等蛋白酶K、TritonX-100、TKM液、10%SDS、DTT、飽和NaCl、95%冰乙醇、TE緩沖液、10×PCRbuffer、TaqDNAPolymerase、10×EasyTaqDNAPolymeraseBuffer、dNTP、KpnⅠ、10×BufferKpnⅠ（withBSA）、AluⅠ、10×BufferAluⅠ（withBSA）、DNAMarker二、實驗用品PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和電泳槽、微型移液器、恒溫10三、實驗內(nèi)容與操作1.材料準(zhǔn)備：

收集志愿者帶有毛囊的頭發(fā)6~7根，用無水乙醇清洗、蒸餾水漂洗后，自然風(fēng)干待用。每根頭發(fā)取毛根0.5cm，剪為兩段，分別放入至0.2mL離心管中（每管中的頭發(fā)均取自同一個體）。三、實驗內(nèi)容與操作1.材料準(zhǔn)備：112.DNA提?。篋TT-TKM-TritonX-100抽提法每管樣品加入200μLTKM液，混勻，加1滴TritonX-100，混勻，6000r/min離心5min，棄上清。將沉淀溶于40μLTKM液，加3μL10%SDS，4μL蛋白酶K

（0.2g/L），8μLDTT（4mol/L），劇烈混勻，55℃水浴5min。加入15μL飽和NaCl（6mol/L），混勻，13000r/min離心5min。轉(zhuǎn)移上清約40μL至另一管中，加2.5倍體積95%冰乙醇，-20℃，30min。13000r/min離心10min，棄上清，加75%冰乙醇洗1次，干燥，溶于100μLTE，-20℃保存。2.DNA提?。篋TT-TKM-TritonX-100抽123.擴(kuò)增反應(yīng)：3.擴(kuò)增反應(yīng)：13擴(kuò)增程序：1.94℃預(yù)變性5min2.94℃變性50s，3.60℃退火30s，4.72℃延伸60s，5.72℃延伸10min6.4℃保溫。35次循環(huán)擴(kuò)增程序：35次循環(huán)144.酶切反應(yīng)：

置37℃酶切反應(yīng)3h，65℃10min終止反應(yīng)。

4.酶切反應(yīng)：置37℃酶切反應(yīng)3h，65℃10m155.電泳檢測：將酶切產(chǎn)物在3％的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后觀察結(jié)果并照相。5.電泳檢測：16四、注意事項

四、注意事項

17ABO血型的基因型檢測課件18五、作業(yè)與思考題給出實驗結(jié)果并進(jìn)行分析五、作業(yè)與思考題給出實驗結(jié)果并進(jìn)行分析19ABO血型的基因型檢測ABO血型的基因型檢測20一、實驗?zāi)康呐c原理1.目的了解ABO血型的遺傳學(xué)原理掌握在DNA水平上鑒定ABO基因型的基本原理和操作過程一、實驗?zāi)康呐c原理1.目的212.原理ABO血型抗原是由IA;IB;i

基因編碼的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成的紅細(xì)胞膜表面的糖蛋白和糖脂。ABO基因座位位于第九號染色體上,其3個等位基因IA、IB、i

形成4種主要的血型A、B、AB和O。ABO血型系統(tǒng)遺傳方式

A血型：IAIA;IAiB血型：IBIB;IBiAB血型：IAIBO血型：ii2.原理ABO血型抗原是由IA;IB;i22IA基因與IB基因之間在cDNA上有7個單堿基替換：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。

i基因與IA基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失，出現(xiàn)框移突變，使第352位的1-rA變成了TAA(終止密碼子)，提前終止了轉(zhuǎn)移酶的合成，導(dǎo)致合成的轉(zhuǎn)移酶沒有活性區(qū)，所以在紅細(xì)胞膜上沒有Ａ，Ｂ抗原的產(chǎn)生。IA基因與IB基因之間在cDNA上有7個單堿基替換：A29423根據(jù)genebank上公布的IA、IB、i基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增ABO糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的2個區(qū)段。

引物由上海生工合成，引物序列為：引物1：5′-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3′引物2：5′-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3′引物3：5′-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3′引物4：5′-CACCGACCCCCCGAAGAA-3′根據(jù)genebank上公布的IA、IB、i24用1、2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因IA，IB產(chǎn)物為200bp，等位基因i

(258位G缺失)產(chǎn)物為199bp。限制性內(nèi)切酶kpnI：i基因PCR產(chǎn)物199bp切出171bp＋28bp，IA，IB基因PCR產(chǎn)物200bp沒有該酶的切點依然是200bp。用3、4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因IA、IB、i的產(chǎn)物均為159bp。限制性內(nèi)切酶AluI：IB基因PCR產(chǎn)物159bp切出118bp＋41bp，IA、i基因PCR產(chǎn)物159bp沒有該酶的切點依然是159bp用1、2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因IA，IB產(chǎn)物為2025kpnI（1，2引物產(chǎn)物）消化：A，B基因200bp：————————200O基因199bp:———————17128kpnI（1，2引物產(chǎn)物）消化：A，B基因26AluI消化(3,4引物產(chǎn)物):A，O基因159bp：————————159B基因159bp:———————11841AluI消化(3,4引物產(chǎn)物):A，O基因271，2引物產(chǎn)物kpnI3,4引物產(chǎn)物AlunIA200159B200118+41O171+281591，2引物產(chǎn)物3,4引物產(chǎn)物A200159B200128二、實驗用品PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和電泳槽、微型移液器、恒溫水浴鍋、凝膠成像系統(tǒng)等，離心管、PCR管、移液器槍頭等蛋白酶K、TritonX-100、TKM液、10%SDS、DTT、飽和NaCl、95%冰乙醇、TE緩沖液、10×PCRbuffer、TaqDNAPolymerase、10×EasyTaqDNAPolymeraseBuffer、dNTP、KpnⅠ、10×BufferKpnⅠ（withBSA）、AluⅠ、10×BufferAluⅠ（withBSA）、DNAMarker二、實驗用品PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和電泳槽、微型移液器、恒溫29三、實驗內(nèi)容與操作1.材料準(zhǔn)備：

收集志愿者帶有毛囊的頭發(fā)6~7根，用無水乙醇清洗、蒸餾水漂洗后，自然風(fēng)干待用。每根頭發(fā)取毛根0.5cm，剪為兩段，分別放入至0.2mL離心管中（每管中的頭發(fā)均取自同一個體）。三、實驗內(nèi)容與操作1.材料準(zhǔn)備：302.DNA提?。篋TT-TKM-TritonX-100抽提法每管樣品加入200μLTKM液，混勻，加1滴TritonX-100，混勻，6000r/min離心5min，棄上清。將沉淀溶于40μLTKM液，加3μL10%SDS，4μL蛋白酶K

（0.2g/L），8μLDTT（4mol/L），劇烈混勻，55℃水浴5min。加入15μL飽和NaCl（6mol/L），混勻，13000r/min離心5min。轉(zhuǎn)移上清約40μL至另一管中，加2.5倍體積95%冰乙醇，-20℃，30min。13000r/min離心10min，棄上清，加75%冰乙醇洗1次，干燥，溶于100μLTE，-20℃保存。2.DNA提取：DTT-TKM-TritonX-100抽313.擴(kuò)增反應(yīng)：3.擴(kuò)增反應(yīng)：32擴(kuò)增程序：1.94℃預(yù)變性5min2.94℃變性50s，3.60℃退火30s，4.72℃延伸60s，5