單分子熒光檢測(cè)技術(shù)課件

單分子熒光檢測(cè)技術(shù)

singlemoleculesfluorescencedetection

B200425010前言單分子檢測(cè)技術(shù)單分子熒光檢測(cè)技術(shù)原理及應(yīng)用小結(jié)

前言統(tǒng)計(jì)力學(xué)的各態(tài)遍歷假設(shè)（ErgodicHypothesis）：

系綜個(gè)體物理量軌跡的時(shí)間平均等于該物理量在給定時(shí)間的系綜平均在包含完全相同個(gè)體的系綜，測(cè)量時(shí)間足夠長(zhǎng)系綜測(cè)量和單分子測(cè)量結(jié)果相同在均相體系：測(cè)量時(shí)間可能小于漲落時(shí)間非均相體系：個(gè)體軌跡平均不等于系綜平均系綜測(cè)量和單分子測(cè)量結(jié)果不等單分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的重要性：對(duì)非均相體系，可給出分子性質(zhì)的分布信息對(duì)均相和非均相體系，單分子軌跡即是分子性質(zhì)漲落的直接記錄，蘊(yùn)涵豐富的動(dòng)力學(xué)知識(shí)單分子檢測(cè)技術(shù)

掃描探針顯微技術(shù)

(ScanningProbeMicroscopy)光學(xué)和光譜技術(shù)掃描隧道顯微技術(shù)（STM）原子力顯微技術(shù)(AFM)掃描離子電導(dǎo)顯微技術(shù)(SICM)光鉗技術(shù)(OpticalTweezer)

熒光技術(shù)(Fluorescence)掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微技術(shù)（SNOM）

單分子熒光檢測(cè)原理單分子熒光檢測(cè)是單分子檢測(cè)最常用的方法標(biāo)記在生物大分子上各個(gè)熒光基團(tuán)的各種特性的變化反映了有關(guān)分子間相互作用、酶活性、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、構(gòu)象動(dòng)力學(xué)、分子運(yùn)動(dòng)自由度及在化學(xué)和靜電環(huán)境下活性改變的信息對(duì)宿主影響小稀溶液中熒光發(fā)射檢測(cè)較為靈敏，背景值較低，信噪比高2.單分子熒光產(chǎn)生原理T1hAhAAbsorption10-15sVibrationalrelax,VR,10-1210-14sInternalconversion,IC,10-1110-13sIntersystemcrossing,ISC,10-210-6sFluorescencePhosphorescenceICISCS0S1S2321010-8s10-3100shFhPJablonskiDiagram4.單分子熒光探測(cè)的技術(shù)關(guān)鍵在被照射的體積中只有一個(gè)分子與激光發(fā)生相互作用（調(diào)整研究體系的濃度或密度）確保單分子的信號(hào)大于背景干擾信號(hào)(有效減少拉曼散射、瑞利散射及其雜質(zhì)熒光所造成的干擾)1.單分子熒光壽命單分子的熒光壽命在由非輻射弛豫決定時(shí)對(duì)局域環(huán)境非常敏感，因此可以通過熒光標(biāo)記生物大分子的某一特殊位置，檢測(cè)生物大分子的構(gòu)象運(yùn)動(dòng)。虛線：?jiǎn)沃笖?shù)曲線擬合實(shí)線：雙指數(shù)曲線擬合3.單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理

當(dāng)能量給體分子（D）和受體分子(A)相隔的距離遠(yuǎn)大于D–A碰撞直徑時(shí)，如若D的發(fā)射譜與A的吸收光譜發(fā)生重疊，且距離在有效范圍內(nèi)，能量就可以從短波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)D傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)A，這個(gè)過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移，實(shí)際相當(dāng)于將短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)D釋放的熒光屏蔽 這是一種通 過偶極－偶極耦 合作用的能量轉(zhuǎn) 移過程。單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移即是在一個(gè)生物大分子或兩個(gè)相互作用的分子上標(biāo)記兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)，作為能量的供體和受體通過檢測(cè)能量在供、給體之間的轉(zhuǎn)移效率，可確定兩點(diǎn)間距離的變化。依據(jù)其距離變化隨時(shí)間的改變關(guān)系則可推測(cè)生物大分子在生命活動(dòng)中（