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細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院那杰細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及NOR的觀察
骨髓細(xì)胞具有豐富的細(xì)胞質(zhì)和高度分裂能力,可直接觀察到分裂細(xì)胞,是研究動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)的好材料。細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及NOR的觀察骨實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆談?dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備技術(shù)觀察染色體的數(shù)目以及形態(tài)特征熟悉銀染法顯示動(dòng)物細(xì)胞NOR的原理和方法,并了解NOR在細(xì)胞中分布情況實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆談?dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理經(jīng)秋水仙素處理后,分裂的骨髓細(xì)胞被阻斷在有絲分裂中期,再經(jīng)離心、低滲、固定、滴片等步驟,便可制作出理想的染色體標(biāo)本。銀染法可以顯示中期染色體上的核仁組織區(qū)(NOR)。當(dāng)NOR在間期轉(zhuǎn)錄時(shí),產(chǎn)生一種與轉(zhuǎn)錄活動(dòng)有關(guān)的酸性蛋白,此蛋白可保留至中期并能將染液中的銀離子還原為金屬銀而顯現(xiàn)為黑色。所以銀染法可在中期染色體上顯示具有轉(zhuǎn)錄活性的NOR數(shù)目。而且,染色的深黑程度,還可以反應(yīng)出基因的活性高低。實(shí)驗(yàn)原理經(jīng)秋水仙素處理后,分裂的骨髓細(xì)胞被阻斷在有絲分裂中期實(shí)驗(yàn)材料小白鼠或青蛙實(shí)驗(yàn)材料小白鼠或青蛙實(shí)驗(yàn)儀器、用具天平離心機(jī)溫箱(或水浴鍋)顯微鏡酒精燈注射器(1ml)解剖盤解剖剪刀片離心管吸管燒杯冰凍載玻片實(shí)驗(yàn)儀器、用具天平注射器(1ml)試劑1Carnoy固定液(現(xiàn)用現(xiàn)配)甲醇:冰醋酸=3:1生理鹽水0.1%秋水仙素溶液用生理鹽水配制1/15mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)Giemsa染液試劑1Carnoy固定液(現(xiàn)用現(xiàn)配)試劑250%硝酸銀溶液氨銀溶液:4g硝酸銀溶于5ml蒸餾水,再加入5ml濃氨水3%甲醛溶液:3ml36%甲醛液,加蒸餾水97ml,用4g無(wú)水醋酸鈉調(diào)節(jié)pH7,4℃保存。使用前用甲酸調(diào)pH4.5試劑250%硝酸銀溶液動(dòng)物染色體制備方法和步驟秋水仙素處理實(shí)驗(yàn)前3~4h,按動(dòng)物每克體重2~4μg的劑量,腹腔注射秋水仙素收集骨髓細(xì)胞處死動(dòng)物后,立即取出股骨,用刀片剔掉肌肉,切開股骨兩端,用吸有生理鹽水的注射器插入股骨的上端,沖出骨髓細(xì)胞至離心管中,直至股骨變白色為止。將收集的骨髓細(xì)胞于1000rpm離心10min動(dòng)物染色體制備方法和步驟秋水仙素處理動(dòng)物染色體制備方法和步驟低滲處理離心后加入600ul蒸餾水,用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液,置37℃低滲20min固定沿管壁逐滴加入固定液600ul,吹打成懸液,室溫固定20min,離心。重復(fù)此操作一次。最后用500ul固定液將沉淀懸浮。動(dòng)物染色體制備方法和步驟低滲處理動(dòng)物染色體制備方法和步驟滴片用鑷子取預(yù)先冰凍的干凈載玻片,迅速滴上2~3滴細(xì)胞懸液,立即用嘴向同一方向吹氣,使細(xì)胞分散均勻,然后置酒精燈上微微加熱干燥Giemsa染液染色30min,鏡檢動(dòng)物染色體制備方法和步驟滴片注意事項(xiàng)低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵處理和操作過(guò)程中注意要有利于細(xì)胞完整和染色體的伸展、分散注意事項(xiàng)低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵作業(yè)繪出骨髓細(xì)胞分裂中期染色體核型圖指出染色體數(shù)目(2n)作業(yè)繪出骨髓細(xì)胞分裂中期染色體核型圖NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟快速銀染法(可選):
在染色體標(biāo)本上滴加含1%甲酸的2%明膠水溶液3滴,再加50%硝酸銀3滴,混合后蓋上蓋片,將標(biāo)本置于60℃恒溫臺(tái)上處理至液體為棕黃色為止,自來(lái)水沖洗,空氣干燥,鏡檢。NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟快速銀染法(可選):NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟氨銀染色法(建議)標(biāo)本上滴加4-8滴50%硝酸銀溶液,立即覆以蓋玻片,放入潮濕密封的培養(yǎng)皿中,37℃溫箱中24-48h,或50℃2-5h流水沖去蓋玻片,蒸餾水洗2次,室溫晾干加4d氨銀溶液和4d3%甲醛溶液(pH4.5)于染色體標(biāo)本上,立即覆以蓋玻片,室溫12min流水沖去蓋玻片,蒸餾水洗凈2%Giemsa染色10-15min水洗,空氣干燥,鏡檢。NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟氨銀染色法(建議)實(shí)驗(yàn)結(jié)果若染色適中,間期核及染色體為金黃色,油鏡觀察,可在某些染色體上看到成對(duì)的黑色小點(diǎn),此即為銀染NOR(Ag-NOR)。若整張片子色淡,間期核及染色體都不易看清,為染色時(shí)間不足,在未滴過(guò)香柏油的情況下,可重新續(xù)染。若染色時(shí)間偏長(zhǎng),則染色體為棕色,此時(shí),仍可看到黑色的NOR,只是NOR與染色體間的反差較低。染色嚴(yán)重過(guò)度時(shí),整張片子都布滿黑色沉淀,這樣的標(biāo)本一般都丟棄不用。若標(biāo)本珍貴,也可采用特殊方法褪色后重新染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果若染色適中,間期核及染色體為金黃色,油鏡觀察,可在某注意事項(xiàng)硝酸銀現(xiàn)配現(xiàn)用銀染液可使衣服、皮膚染色,小心操作3%甲醛工作液pH必須為4.5注意事項(xiàng)硝酸銀現(xiàn)配現(xiàn)用作業(yè)
在油鏡下繪制一中期分裂相圖(Ag-NOR的位置、數(shù)目和形態(tài))。作業(yè)思考題分析你做的標(biāo)本的優(yōu)劣,并分析要使實(shí)驗(yàn)中的成功應(yīng)注意哪些問(wèn)題思考題分析你做的標(biāo)本的優(yōu)劣,并分析要使實(shí)驗(yàn)中的成功應(yīng)注意哪些細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院那杰細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及NOR的觀察
骨髓細(xì)胞具有豐富的細(xì)胞質(zhì)和高度分裂能力,可直接觀察到分裂細(xì)胞,是研究動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)的好材料。細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及NOR的觀察骨實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆談?dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備技術(shù)觀察染色體的數(shù)目以及形態(tài)特征熟悉銀染法顯示動(dòng)物細(xì)胞NOR的原理和方法,并了解NOR在細(xì)胞中分布情況實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆談?dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理經(jīng)秋水仙素處理后,分裂的骨髓細(xì)胞被阻斷在有絲分裂中期,再經(jīng)離心、低滲、固定、滴片等步驟,便可制作出理想的染色體標(biāo)本。銀染法可以顯示中期染色體上的核仁組織區(qū)(NOR)。當(dāng)NOR在間期轉(zhuǎn)錄時(shí),產(chǎn)生一種與轉(zhuǎn)錄活動(dòng)有關(guān)的酸性蛋白,此蛋白可保留至中期并能將染液中的銀離子還原為金屬銀而顯現(xiàn)為黑色。所以銀染法可在中期染色體上顯示具有轉(zhuǎn)錄活性的NOR數(shù)目。而且,染色的深黑程度,還可以反應(yīng)出基因的活性高低。實(shí)驗(yàn)原理經(jīng)秋水仙素處理后,分裂的骨髓細(xì)胞被阻斷在有絲分裂中期實(shí)驗(yàn)材料小白鼠或青蛙實(shí)驗(yàn)材料小白鼠或青蛙實(shí)驗(yàn)儀器、用具天平離心機(jī)溫箱(或水浴鍋)顯微鏡酒精燈注射器(1ml)解剖盤解剖剪刀片離心管吸管燒杯冰凍載玻片實(shí)驗(yàn)儀器、用具天平注射器(1ml)試劑1Carnoy固定液(現(xiàn)用現(xiàn)配)甲醇:冰醋酸=3:1生理鹽水0.1%秋水仙素溶液用生理鹽水配制1/15mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)Giemsa染液試劑1Carnoy固定液(現(xiàn)用現(xiàn)配)試劑250%硝酸銀溶液氨銀溶液:4g硝酸銀溶于5ml蒸餾水,再加入5ml濃氨水3%甲醛溶液:3ml36%甲醛液,加蒸餾水97ml,用4g無(wú)水醋酸鈉調(diào)節(jié)pH7,4℃保存。使用前用甲酸調(diào)pH4.5試劑250%硝酸銀溶液動(dòng)物染色體制備方法和步驟秋水仙素處理實(shí)驗(yàn)前3~4h,按動(dòng)物每克體重2~4μg的劑量,腹腔注射秋水仙素收集骨髓細(xì)胞處死動(dòng)物后,立即取出股骨,用刀片剔掉肌肉,切開股骨兩端,用吸有生理鹽水的注射器插入股骨的上端,沖出骨髓細(xì)胞至離心管中,直至股骨變白色為止。將收集的骨髓細(xì)胞于1000rpm離心10min動(dòng)物染色體制備方法和步驟秋水仙素處理動(dòng)物染色體制備方法和步驟低滲處理離心后加入600ul蒸餾水,用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液,置37℃低滲20min固定沿管壁逐滴加入固定液600ul,吹打成懸液,室溫固定20min,離心。重復(fù)此操作一次。最后用500ul固定液將沉淀懸浮。動(dòng)物染色體制備方法和步驟低滲處理動(dòng)物染色體制備方法和步驟滴片用鑷子取預(yù)先冰凍的干凈載玻片,迅速滴上2~3滴細(xì)胞懸液,立即用嘴向同一方向吹氣,使細(xì)胞分散均勻,然后置酒精燈上微微加熱干燥Giemsa染液染色30min,鏡檢動(dòng)物染色體制備方法和步驟滴片注意事項(xiàng)低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵處理和操作過(guò)程中注意要有利于細(xì)胞完整和染色體的伸展、分散注意事項(xiàng)低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵作業(yè)繪出骨髓細(xì)胞分裂中期染色體核型圖指出染色體數(shù)目(2n)作業(yè)繪出骨髓細(xì)胞分裂中期染色體核型圖NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟快速銀染法(可選):
在染色體標(biāo)本上滴加含1%甲酸的2%明膠水溶液3滴,再加50%硝酸銀3滴,混合后蓋上蓋片,將標(biāo)本置于60℃恒溫臺(tái)上處理至液體為棕黃色為止,自來(lái)水沖洗,空氣干燥,鏡檢。NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟快速銀染法(可選):NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟氨銀染色法(建議)標(biāo)本上滴加4-8滴50%硝酸銀溶液,立即覆以蓋玻片,放入潮濕密封的培養(yǎng)皿中,37℃溫箱中24-48h,或50℃2-5h流水沖去蓋玻片,蒸餾水洗2次,室溫晾干加4d氨銀溶液和4d3%甲醛溶液(pH4.5)于染色體標(biāo)本上,立即覆以蓋玻片,室溫12min流水沖去蓋玻片,蒸餾水洗凈2%Giemsa染色10-15min水洗,空氣干燥,鏡檢。NOR的顯示實(shí)驗(yàn)步驟氨銀染色法(建議)實(shí)驗(yàn)結(jié)果若染色適中,間期核及染色體為金黃色,油鏡觀察,可在某些染色體上看到成對(duì)的黑色小點(diǎn),此即為銀染NOR(Ag-NOR)。若整張片子色淡,間期核及染色體都不易看清,為染色時(shí)間不足,在未滴過(guò)香柏油的情況下,可重新續(xù)染。若染色時(shí)間偏長(zhǎng),則染色體為棕色,此時(shí),仍可看到黑色的NOR,只是NOR與染色體間的反差較低。染色嚴(yán)重過(guò)度時(shí),整張片子都布滿黑色沉淀,這樣的標(biāo)本一般都丟棄不用。若標(biāo)本珍貴
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