產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究

Goodisgood,butbettercarriesit.

精益求精，善益求善。Goodisgood,butbettercarriesit.

精益求精，善益求善。產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究摘要摘要PAGEPAGE36-摘要PAGE摘要目的：通過對金銀花不同組織器官內(nèi)生真菌的分離，篩選能產(chǎn)生綠原酸的菌株，通過菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得高產(chǎn)綠原酸的發(fā)酵菌株及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。方法：從金銀花不同組織器官中分離內(nèi)生真菌，通過分離純化、發(fā)酵，對其發(fā)酵產(chǎn)物進行TLC和HPLC分析，同時利用顯微觀察法對其進行顯微鑒定，對篩選的高產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化選擇，并對菌株發(fā)酵液進行抑菌學實驗。結果：從金銀花中分離篩選到三株純化的的內(nèi)生真菌，其濃縮發(fā)酵液與對照品有相同的遷移率，保留時間與對照品保留時間一致，結果表明，三株純化獲得的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生綠原酸，分別屬于青霉屬、毛霉屬、曲霉屬。經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃,120r/min，震蕩培養(yǎng)72小時結論：金銀花不同器官中具有豐富的內(nèi)生真菌，并有可能產(chǎn)生與宿主相同的活性成分綠原酸，純化的產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵液具有明顯的與金銀花相同的抑菌效果。[關鍵詞]：金銀花；內(nèi)生真菌；綠原酸；發(fā)酵縮寫詞表TLCthinlayerchromatography薄層色譜HPLChighperformanceliquidchromatography高效液相色譜PDApotato-dextrose-agarmedium馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDBpotato-dextrosebroth馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基目錄1前言 41.1內(nèi)生菌與植物的關系 41.2內(nèi)生菌天然藥物新資源及其展望 52問題的提出 63材料與方法 73.1試劑 7培養(yǎng)基配方 83.2實驗方法 83.2.1菌株的篩選 83.2.1.1實驗材料的采集 83.2.1.2樣品的消毒處理 83.2.1.3表面消毒效果的檢測 93.2.1.4分離與純化 93.2.1.5菌種的保藏 93.2.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測 93.2.2.1菌株的小樣培養(yǎng) 93.2.2.2內(nèi)生菌發(fā)酵液的提取處理 103.2.2.3薄層色譜法(TLC)檢測綠原酸 103.2.2.4高效液相色譜法(HPLC)檢測綠原酸 103.2.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定 103.2.4二次發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 113.2.4.1固體基本培養(yǎng)基的選擇 113.2.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇 113.2.4.3發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化 12碳源的選擇 12氮源的選擇 12溫度的選擇 123.2.4.4發(fā)酵條件的正交試驗 123.2.5金銀花內(nèi)生真菌的抑菌實驗 134結果與分析 134.1菌株篩選的結果 134.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測結果 144.2.1薄層色譜法(TLC)檢測 144.2.2高效液相色譜法(HPLC)檢測 154.3.1.2顯微形態(tài)鑒定 194.4二次發(fā)酵條件的優(yōu)化結果 224.4.1固體基本培養(yǎng)基的選擇結果 224.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇 234.4.3純化分離出的菌株發(fā)酵液形態(tài) 254.4.4發(fā)酵條件的單因素比較 274.4.4.1碳源的選擇 274.4.4.2氮源的選擇 284.4.4.3溫度的選擇 284.4.5發(fā)酵條件的正交試驗 294.5抑菌實驗結果 305結論與討論 315.3TLC分析顯示三株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液與綠原酸對照品Rf值相近，HPLC進一步分析顯示三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液與對照品有相同或者相近的保留時間。綜合TLC與HPLC分析，推斷三株內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中可能含有綠原酸類成分。 325.4內(nèi)生真菌在發(fā)酵過程中，不同的發(fā)酵溫度、pH值、碳源和氮源濃度都會影響其有效成分的種類及含量。相應的，也很可能會產(chǎn)生不同種類的代謝產(chǎn)物。 326展望 32參考文獻 331前言1.1內(nèi)生菌與植物的關系內(nèi)生菌(endophyte)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。內(nèi)生菌也可理解為植物組織內(nèi)的正常菌群，它們與植物的關系相當密切，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組成成分。關于內(nèi)生菌的起源仍然有不同的觀點，存在兩種假說，即“內(nèi)生說”和“外生說”:內(nèi)生說認為內(nèi)生菌與宿主植物應該具有相同或相似的遺傳背景；外生說認為內(nèi)生菌源于植物體外，通過植物體表、根際的自然孔口、傷口或誘導植物形成的通道進入體內(nèi)。內(nèi)生菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，植物以其內(nèi)生菌的組織、細胞及其代謝產(chǎn)物為內(nèi)環(huán)境，而內(nèi)生菌以宿主植物的組織和細胞及其代謝產(chǎn)物為外環(huán)境，兩者之間互相進行物質(zhì)、能量及基因交流，在長期進化過程中與宿主協(xié)同進化，在演化過程中兩者形成了互利共生的關系。一方面內(nèi)生菌可從宿主中吸取營養(yǎng)供自己生長所需；另一方面，內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，能刺激植物的生長發(fā)育，提高宿主植物對非生物脅迫（如抗干旱）和生物脅迫（如抵抗病蟲害等）的抵抗能力，內(nèi)生菌與宿主植物在長期協(xié)同進化過程中彼此構成了和諧穩(wěn)定的生態(tài)關系。另有觀點認為內(nèi)生菌與宿主植物間存在基因交流，對紅豆杉，長春花等藥用植物內(nèi)生菌的研究中，通過對其內(nèi)生菌的發(fā)酵液進行化學分析，分離得到了和宿主植物相同或相似的生理活性成分，可見宿主植物與其內(nèi)生真菌由于長期的共同生活因而關系非常密切。1.2內(nèi)生菌天然藥物新資源及其展望研究發(fā)現(xiàn)某些內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或類似的生理活性成分，這一發(fā)現(xiàn)可能在一定程度上解決了某些藥物資源短缺的問題。近年來先后從紅豆杉（Taxus），長春花等藥用植物中分離得到了內(nèi)生真菌，并從這些藥用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵液中分離得到了和宿主植物研究相同或相似的生理活性成分。內(nèi)生菌作為許多重要藥用成分的新來源，可工業(yè)化生產(chǎn)而不受土壤氣候以及資源的限制，從而緩解了藥物資源的短缺。目前已經(jīng)從紅豆杉、長春花、銀杏等植物中分離出能產(chǎn)生活性成分的內(nèi)生真菌[1,2,3]。1993年Stiede首次從短葉紅豆杉(Taxusbreviflia)中分離得到一株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomycesandreanae)，此后對東北紅豆杉也進行了研究[3]。云南大學張玲琪等從桃兒七（Sinopodophyllumhexandrum）的莖中分離到能夠產(chǎn)生鬼臼毒素的內(nèi)生真菌[4,5,6]。從桃兒七植株中共分離得到28株真菌，其中有兩株能夠產(chǎn)生鬼臼毒素類似物，它們分別屬于青霉屬和交鏈孢屬。1999年，中山大學王偉等人從南方紅豆杉(Tchinensisvar．mairei)中分離得到87株內(nèi)生真菌，其中有6個菌株能分泌紫杉烷類化合物，它們分別屬于頭孢霉屬、輪柄梳霉屬和無孢菌群等。通過比較發(fā)現(xiàn)，以上產(chǎn)生與宿主相同或相似生理活性成分的內(nèi)生真菌菌株之間并不存在種屬聯(lián)系，表明內(nèi)生菌具備這一能力并不是偶然現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)掀起了一場從藥用植物體內(nèi)分離內(nèi)生菌的熱潮，為人類解決某些藥用植物生長緩慢、資源短缺等問題提供了新思路。另一方面，多樣性的內(nèi)生菌也能產(chǎn)生許多具有生物活性的次生產(chǎn)物，從而增強植物的抗逆性，表現(xiàn)在非生物脅迫（如抗干旱）和生物脅迫（如抵抗病蟲害等）方面，這些次生代謝產(chǎn)物多數(shù)具有抗菌、抗腫瘤等生物活性。本研究通過分離金銀花內(nèi)生真菌得到產(chǎn)綠原酸的菌株，尋找出此類菌株是如何通過其自身次生代謝產(chǎn)物來影響宿主次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，探討兩者之間的相關性。并以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌為指示菌，通過紙片法對分離得到的能夠產(chǎn)生綠原酸的金銀花內(nèi)生真菌進行抑菌學實驗，驗證其發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物具有抑菌活性。本研究為后期利用金銀花內(nèi)生真菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)綠原酸提供科學理論依據(jù)，具有很大的經(jīng)濟價值和研究意義。2問題的提出在河南的道地藥材中，近幾年有一種藥材，價格連年上漲，而且用途廣泛，這就是我們關注的-金銀花，金銀花具有清熱解毒、通經(jīng)活絡、廣譜抗菌及抗病毒等功效，70%以上的感冒、消炎中成藥原料藥材中幾乎都有金銀花的蹤跡，具有“中藥抗生素”、“綠色抗菌素”之稱。金銀花的作用除藥用外，其飲料、美容、減肥和保健養(yǎng)生的作用更為神奇，對身體所起到的巨大保護和修復作用是十分顯著的。金銀花既然有如此之多的用途，它起作用的活性成分什么？通過請教老師和查閱資料，得知金銀花所含綠原酸是其主要的活性成分之一，綠原酸能促進人體新陳代謝、調(diào)節(jié)人體功能、提高免疫力。既然清楚綠原酸是金銀花的活性成分，綠原酸具有抗菌、消炎、解毒、利膽、降壓、升高白細胞及顯著增加胃腸蠕動和促進胃液分泌等藥理作用。那么綠原酸在植物體內(nèi)是如何產(chǎn)生的，它和土壤中的大量微生物存在有關系嗎？而且在植物體內(nèi)有一類微生物存活于健康植物組織內(nèi)部，在長期進化過程中與宿主協(xié)同進化，在演化過程中兩者形成了互惠共生關系，此類微生物稱為內(nèi)生菌。那么在金銀花中有沒有能產(chǎn)生綠原酸的內(nèi)生菌。那如果能把該菌分離出來，就可以利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)金銀花中活性成分綠原酸了。那樣就可以節(jié)約大量的土地和勞動力，又能實行工廠化生產(chǎn)。那么，采用什么樣的技術才能分離出產(chǎn)綠原酸的金銀花內(nèi)生菌并進行培養(yǎng)發(fā)酵呢？于是我們開始了從金銀花中分離產(chǎn)綠原酸內(nèi)生菌的研究歷程。3材料與方法3.1試劑可溶性淀粉天津市化學試劑三廠蛋白胨上海東海制藥廠牛肉膏北京奧博星生物技術有限責任公司瓊脂北京奧博星生物技術有限責任公司葡萄糖上?；瘜W試劑采購供應站試劑廠硅膠H青島海洋化工廠甲醇天津市風船化學試劑科技有限公司乙酸丁酯天津市風船化學試劑有限責任公司羧甲基纖維素鈉天津市福辰化學試劑廠氯仿淄博廣然化工有限公司甲苯天津市富宇精細化工有限公司甲酸上海三浦化工有限公司乙腈天津市四友精細化學品有限公司以上試劑除乙腈，甲醇外均為分析純。KNO3，K2HPO4，MgSO4?7H2O，NaCl，F(xiàn)eSO4·7H2O等均為天津市化學試劑三廠培養(yǎng)基配方PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000mlPDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，自然pH以上各種培養(yǎng)基配制好分裝完成后于121℃3.2實驗方法3.2.1菌株的篩選3.2.1.1實驗材料的采集選取健康金銀花植株的不同組織部位（新鮮根、莖、葉、花）作為內(nèi)生真菌分離的實驗材料，采摘時，盡量選擇植物老的組織部位，因為對老的組織采樣能最大程度的發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的多樣性，此外盡量選擇對離地面較遠的組織采樣，減少因泥土濺到組織上造成的表面雜菌污染。采集后立即保存于保鮮袋內(nèi)，4℃冰箱保存，24小時內(nèi)進行內(nèi)生菌的分離。3.2.1.2樣品的消毒處理金銀花組織表面消毒方法的考察。將樣品用自來水洗凈，無菌剪刀剪成0.5×0.5cm2的小塊，采用75%乙醇與5%次氯酸鈉相結合的方法進行表面消毒。表1金銀花內(nèi)生真菌分離的消毒方法方法Solution處理時間(s)Timetreated無菌水（sterilizedwater）30（2times)75%乙醇（ethanol）30（1times)無菌水（sterilizedwater）30(3times)5%次氯酸鈉（NaCl0）60（5times）無菌水（sterilizedwater）60（5times）3.2.1.3表面消毒效果的檢測取最后一次消毒的無菌水200μL置入已消毒培養(yǎng)基中，緊貼培養(yǎng)基本表面，作為對照組，以確定金銀花組織表面消毒徹底。3.2.1.4分離與純化將植物組織用無菌剪刀剪成0.5×0.5cm2的小塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，并取最后一次消毒無菌水用無菌棉簽涂抹于PDA培養(yǎng)基上，作為對照。將培養(yǎng)基置于28℃暗室恒溫培養(yǎng)5天，定時觀察，當有新的菌絲或菌落出現(xiàn)時轉接至新的PDA培養(yǎng)基上，直至純化為單一菌落為止，采用PDA試管3.2.1.5菌種的保藏將純化完全的菌株接種至PDA試管斜面培養(yǎng)基中，28℃暗室恒溫培養(yǎng)，待斜面菌體生長豐滿后，放入冰箱，4℃保存，3.2.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測3.2.2.1菌株的小樣培養(yǎng)液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB），100ml三角瓶裝液量30ml，高壓滅菌后，冷卻備用。將要培養(yǎng)的菌株轉移至PDA平板上，28℃暗室恒溫培養(yǎng)至一定菌落。用7mm無菌打孔器將培養(yǎng)純化完全的菌落打取相同大小的菌餅接種于培養(yǎng)液中，每一菌株接種3瓶，以驗證其重復性。28℃,120r/min培養(yǎng)96小時后，作為發(fā)酵液種子小樣。移液管吸取相同體積的發(fā)酵液種子小樣轉接至裝液量為50ml的150ml三角瓶中，3.2.2.2內(nèi)生菌發(fā)酵液的提取處理將發(fā)酵好的內(nèi)生菌發(fā)酵液離心(10000r/min)10min（上清液呢），過濾，濃縮，加甲醇溶解，定容至5ml，0.45μm微孔濾膜過濾，置進樣小瓶中備用。3.2.2.3薄層色譜法(TLC)檢測綠原酸將處理后的發(fā)酵提取液適當濃縮作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2010年中國藥典附錄ⅥB）實驗，吸取供試品試液10-20μl,對照品溶液10μl，分別點于同一硅膠H薄層板上；以乙酸丁酯：甲酸：水=7：2.5：2.5的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，F(xiàn)eCl3顯色劑顯色。3.2.2.4高效液相色譜法(HPLC)檢測綠原酸參照《2010版藥典》進行測定，色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈：0.4%磷酸溶液（13：87）為流動相；流速1ml/min；柱溫25℃；檢測波長327nm；進樣量10μ3.2.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定3.2.3.1傳統(tǒng)鑒定方法本實驗對于內(nèi)生真菌進行了初步的的形態(tài)鑒定，主要通過觀察其孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結構、產(chǎn)孢方式等來進行，目前主要對其進行形態(tài)學鑒定，方法如下：挑取純化的真菌菌絲，分別接種于PDA和察氏培養(yǎng)基上，采用3點接種法培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面特征；采用插片培養(yǎng)法對孢子進行顯微觀察。參照《真菌鑒定手冊》進行鑒定，可將內(nèi)生菌初步鑒定到屬水平。如果更加準確的鑒定需要做分子生物方面的研究，由于時間的限制，未對菌株做分子生物學方面的實驗。3.2.3.2分子生物學鑒定方法傳統(tǒng)的內(nèi)生菌鑒定方法過于繁瑣和復雜，而微生物的形態(tài)學特征和生理生化特征是有其內(nèi)部的核酸分子所決定的，因此對篩選得到的菌株，通過對內(nèi)生菌ITSrDNA序列的分析進行鑒定，并利用DNAman軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定內(nèi)生菌已經(jīng)成為菌種鑒定的主要方法。3.2.4二次發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 3.2.4.1固體基本培養(yǎng)基的選擇將菌株B-4-15接種于PDA平板上，28℃，倒置培養(yǎng)，待菌落生長為培養(yǎng)皿1/3時，用無菌打孔器沿著菌落邊緣打取相同大小的菌餅，直徑為5mm，分別轉接至各種供試固體培養(yǎng)基上。置恒溫培養(yǎng)箱中，28℃，倒置培養(yǎng)。以菌落的生長速度及長勢為指標，選擇最適合于菌株生長的固體培養(yǎng)基。3.2.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇制備菌株種子液，并以10%接種量接入到下列液體培養(yǎng)基中：玉米粉葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，28℃,120r/min搖床培養(yǎng)至菌球分散均勻。培養(yǎng)結束后，測定菌株B-4-15的菌絲干重；將發(fā)酵液進行提取，利用高效液相測定綠原酸含量，從而確定最佳液體培養(yǎng)基。3.2.4.3發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化碳源的選擇以選擇出的最適液體培養(yǎng)基為測定碳源的基本培養(yǎng)基，分別以以下碳源代替培養(yǎng)基中的碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖。培養(yǎng)條件及測定方法同液體培養(yǎng)基的選擇一致。氮源的選擇以選擇出的最適液體培養(yǎng)基為測定氮源的基本培養(yǎng)基，供試氮源分別為硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、尿素，培養(yǎng)條件及測定方法同液體基本培養(yǎng)基的選擇一致。溫度的選擇已選擇出的最適液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別在26℃、28℃、30℃、32℃的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件及測定同上。3.2.4.4發(fā)酵條件的正交試驗發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化只能客觀評價培養(yǎng)基中各成分所起的作用，而對于培養(yǎng)基整體而言還需要做下一步的實驗工作，接下來會以菌株中綠原酸含量為指標，進行發(fā)酵條件的正交實驗，優(yōu)選最佳的碳源、氮源濃度和最佳培養(yǎng)溫度。以上述試驗選擇的碳源、氮源、溫度、pH值這4個因素分別選取3個水平，進行L9(34)正交試驗，在最適溫度下進一步優(yōu)化發(fā)酵試驗，正交試驗各因素及水平見表1：表2正交試驗因素水平因素水平123A碳源濃度1.5%2%2.5%B氮源濃度0.2%0.25%0.3%CpH6.5%7.0%7.5%D溫度2628303.2.5金銀花內(nèi)生真菌的抑菌實驗將3株內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落生長為培養(yǎng)皿1/3，7mm打孔器打取菌餅轉接至PDB培養(yǎng)液中發(fā)酵，搖床120r/min，28℃抑菌活性測試采用紙片擴散法：將金銀花內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物分別配成1mg/mL的甲醇溶液，然后去50μL的各菌株次生代謝產(chǎn)物溶于小濾紙片，使其充分吸收，平方與分別含有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的瓊脂水培養(yǎng)基上，每株真菌對3中測試菌分別作3個重復，金銀花提取液作為陽性對照。將制好的培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)24小時后觀察，測定其抑菌圈大小。4結果與分析4.1菌株篩選的結果將金銀花不同組織部位（根、莖、葉、花）先在自來水下沖洗干凈，去除表面的泥土與灰塵，無菌濾紙吸干表面水分，然后按照以上程序進行表面消毒。表3金銀花不同組織的內(nèi)生真菌種類及分布部位菌株數(shù)（株）涉及屬的數(shù)目（株）占總菌株數(shù)的比例涉及屬占總屬數(shù)的比例根21426.58%44.44%莖25731.65%77.78%葉17421.52%44.44%花13516.46%55.56%總計799100%100%通過對金銀花內(nèi)生真菌的分離，共得到內(nèi)生真菌79株，其中從金銀花根部分離得到21株，約占26.58%；從莖部分離得到25株，約占31.65%；從葉片中分離得到17株，約占21.52%；花蕾中分離得到13株，約占16.46%。由此可知金銀花莖中內(nèi)生真菌種類豐富，其次為根和莖，花中內(nèi)生真菌數(shù)量最少。本實驗表明了在健康的金銀花組織中存在著豐富的內(nèi)生真菌，而其種類與數(shù)量則與其分離部位有關。4.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測結果4.2.1薄層色譜法(TLC)檢測采用薄層色譜法進行初選，篩選出的三個菌株的次生代謝產(chǎn)物疑似綠原酸，三株菌株與綠原酸對照品具有相同的Rf值，且Rf值在0.5左右。薄層層析圖譜如下：圖1三株菌株發(fā)酵液薄層色譜圖A:A-3-24，B:B-4-15，C:B-4-31,D:綠原酸對照品，E：金銀花提取液Rf值：A:0.451,B:0.452,C:0.449,D:0.449,E:0.4524.2.2高效液相色譜法(HPLC)檢測采用高效液相色譜法進一步確認：三株內(nèi)生真菌A-3-24，B-4-15，B-4-31與綠原酸對照品保留時間相近，均在7.915min左右。三株菌株發(fā)酵液與綠原酸品液相色圖譜如下：7.915min7.915min圖2綠原酸標準品發(fā)酵液液相色譜圖6號峰，保留時間為7.915min。峰面積為2148992.77.915min7.915min圖3菌株A-3-24發(fā)酵液液相色譜圖15號峰，保留時間為7.915min。峰面積為257018.07.933min7.933min圖4菌株B-4-15發(fā)酵液液相色譜圖14號峰，保留時間為7.933min。峰面積為160309.27.928min7.928min圖5菌株B-4-31發(fā)酵液液相色譜圖12號峰，保留時間7.928min。峰面積為165023.6標準曲線的繪制：通過改變進樣體積，得到不同進樣量X下的峰面積Y，進而繪制標準曲線：Y=222428x-88456,R2=0.9992。表4標準曲線的繪制表5三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液綠原酸含量計算液相編號保留時間/min峰面積含量（μg/ml）標準品7.9152148992.776.8A-3-247.915257018.011.928B-4-157.933160309.28.588B-2-317.928165023.68.752其中，24，15，31號樣品與對照品保留時間基本一致，說明24，15，31號內(nèi)生真菌菌株的發(fā)酵液可能含有綠原酸類物質(zhì)。根據(jù)三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液液相分析，保留時間與對照品保留時間一致，可以看出三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液中含有綠原酸。4.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定結果4.3.1傳統(tǒng)鑒定方法4.3.1.1菌株形態(tài)學描述圖6A-3-24菌落形態(tài)圖7B-4-15菌落形態(tài)圖8B-4-31菌落形態(tài)表6三株內(nèi)生真菌生理形態(tài)描述菌株顏色菌絲培養(yǎng)基邊緣分泌物A-3-24黃色輻射狀生長結合牢固不整齊無B-4-15黃色干燥結合牢固整齊紅色液滴B-4-31淡綠色干燥，皺縮結合不牢固不整齊無色液滴4.3.1.2顯微形態(tài)鑒定通過對三株內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察，觀察其孢子形態(tài)，產(chǎn)孢方式，孢子囊及孢子柄等顯微形態(tài)來初步推測菌株的分類地位。三株內(nèi)生真菌的顯微形態(tài)如下：圖9菌株A-3-24鏡下特征(10×40)（孢子及孢子柄顯微形態(tài)）圖10菌株A-3-24鏡下特征(10×40)（孢子囊及孢子柄顯微形態(tài)）圖11菌株B-4-15鏡下特征(10×40)（孢子囊及孢子柄顯微特征）圖12菌株B-4-31鏡下特征(10×40)(孢子囊及孢子形態(tài))根據(jù)對三株內(nèi)生真菌鏡下顯微形態(tài)的觀察，初步鑒定結果如下：表7三株內(nèi)生真菌顯微形態(tài)描述菌株顯微特征孢子分生孢子梗真菌菌絲分類歸屬分離部位A-3-24圓形，孢子淺紅色孢子梗細長，無分支菌絲有分支，有隔毛霉屬葉片B-4-15圓形或類圓形，孢子單生分生孢子聚集在分生孢子梗頂端呈頭狀。菌絲有分支，無隔青霉屬花B-4-31孢子單生，顏色淡綠色分生孢子梗細長，有分支菌絲體細長，有分支曲霉屬花表8金銀花不同組織的內(nèi)生真菌種類及分布屬（Genus）根（Root）莖（Stem）葉（Leaf）花（Flos）總計（Total）毛霉屬（Mucor）01135青霉屬（Penicillium）983225鏈格孢屬（Alternaria）11013犁頭霉屬(Absidia)01001頭孢霉屬(Cephalosporieae)10203頭珠霉屬(Piptoaephalis)13004串珠霉屬(Monilia)01304叢梗孢屬(Moniliaceae)11125曲霉屬（Asqergillus）03014未確定(Unknown)877325總計（Total）21251713794.4二次發(fā)酵條件的優(yōu)化結果4.4.1固體基本培養(yǎng)基的選擇結果圖13三種培養(yǎng)基生長曲線（以菌落直徑為指標）由圖13可以看出，前幾天菌株B-4-15在PDA培養(yǎng)基上菌落的長勢略好于豆芽汁與玉米粉培養(yǎng)基，第四天后PDA培養(yǎng)基生長的長勢漸緩，菌落邊緣整齊。而在豆芽汁與玉米粉培養(yǎng)基上卻生長迅速，第6天時已經(jīng)長滿全皿，測量結果不能準確反映菌株的生長差異，故本實驗并未對菌株后期的生長進行測定。4.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇通過改變進樣量體積，得到不同進樣量X下的峰面積Y，進而繪制標準曲線：圖14B-4-15在玉米粉葡萄糖培養(yǎng)基中的生長曲線及綠原酸含量圖15B-4-15在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中的生長曲線及綠原酸含量圖16B-4-15在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基中的生長曲線及綠原酸含量比較菌株B-4-15在不同培養(yǎng)基中的生長曲線及產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量，可知，在不同發(fā)酵液中B-4-15的綠原酸產(chǎn)量和生長量都不相同。菌株B-4-15在這些培養(yǎng)基中產(chǎn)生的菌絲體最大干重次序為：馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基>豆芽汁培養(yǎng)基>玉米粉培養(yǎng)基。綠原酸產(chǎn)量在馬鈴薯培養(yǎng)基中產(chǎn)量最大，且在第5天后綠原酸含量降低，而在玉米粉中綠原酸最低。故選擇馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基作為最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基，最佳提取時間為第5天。4.4.3純化分離出的菌株發(fā)酵液形態(tài)圖17菌株A-3-24發(fā)酵液形態(tài)(菌球分散均勻，顏色黃色，大小適度)圖18菌株B-4-15發(fā)酵液形態(tài)（呈現(xiàn)出良好的發(fā)酵形態(tài)，孢子形成菌球后大小均勻，菌球四周稍帶菌毛）圖19菌株B-4-31發(fā)酵液形態(tài)（菌球白色，個體較大，分散較均勻）在菌株發(fā)酵實驗過程中，應在錐形瓶發(fā)酵液中加入幾小片碎玻璃，這樣在搖床不斷轉動過程中會使孢子分散均勻，從而使發(fā)酵液菌球均勻。4.4.4發(fā)酵條件的單因素比較對不同碳源、氮源、pH值及溫度的發(fā)酵液進行高效液相測定，得到不同進樣量X下的峰面積Y，繪制標準曲線：Y=539427x＋22782，R2=0.99964.4.4.1碳源的選擇通過改變馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中的碳源，比較B-4-15在培養(yǎng)基中的生長量和綠原酸含量的變化。圖20不同碳源對B-4-15產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響通過圖20可以得知，不同碳源對菌株B-4-15產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響不同，菌株在以蔗糖為碳源的發(fā)酵液中產(chǎn)生的菌絲體重及綠原酸含量最高，葡萄糖中最低，在淀粉及乳糖中產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的變化相近，因此選擇蔗糖為最佳碳源。4.4.4.2氮源的選擇圖21不同氮源對B-4-15產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響由圖21可知，菌株B-4-15在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌絲體的生長量最高，在綠原酸的產(chǎn)量方面，以添加蛋白胨的綠原酸含量最高，加入硝酸鈉和硝酸銨的最低，所以綜合考慮之下選擇蛋白胨為最佳氮源。4.4.4.3溫度的選擇圖22不同溫度對B-4-15產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響由圖22可以看出，溫度過高或者過低，都不利于菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長，所產(chǎn)生的菌絲體及綠原酸含量亦會降低，適當?shù)臏囟葎t會增加細胞的生長速率，促進菌株的次生代謝，綜上所述，本結果中顯示最適合菌絲體生長和綠原酸含量積累的溫度為28℃，故選擇28℃作為B-4-15的發(fā)酵溫度。表9發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化結果編號因素結果1碳源蔗糖2氮源蛋白胨3溫度284pH7.0通過對發(fā)酵條件的摸索，得到基本發(fā)酵培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，考慮到蔗糖價格便宜，且在實驗過程中與葡萄糖起到相同的實驗作用，故選擇主要碳源為蔗糖，主要氮源為蛋白胨，溫度選擇在28℃,p4.4.5發(fā)酵條件的正交試驗表10四因素三水平正交試驗試驗號ABCD菌絲干重綠原酸相對含量列號蔗糖蛋白胨pH值溫度mg/mLmg/ml111110.840.74212220.430.32313330.460.35421231.481.22522310.580.30623120.910.87731320.290.16832130.240.23933210.680.57K11.732.611.992.10K22.971.252.591.63K31.212.051.332.18K11.412.121.841.61K22.390.852.111.35K30.961.790.811.80表11發(fā)酵條件對菌絲干重影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖0.60320.30211.601*蛋白胨0.30820.1545.926--pH值0.22220.1114.268--溫度0.05220.026表12發(fā)酵條件對綠原酸產(chǎn)量影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖0.36520.17810.476*蛋白胨0.28920.1458.509--pH值0.31420.1579.222*溫度0.03420.017由表10、11、12可知，9個正交試驗中，以A2B1C2D3為最佳組合，即蔗糖2.0%,蛋白胨0.2%，pH值7.0，溫度30通過比較單因素實驗優(yōu)化后的結果，采用最佳組合為馬鈴薯培養(yǎng)基，其中加入蔗糖2.0%，蛋白胨0.2%,pH值7.0，培養(yǎng)溫度為30℃的條件。初始培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，自然pH值