遺傳重組課件

第七章基因重組1?第七章基因重組1?第一節(jié)基因重組概述一、遺傳重組的概念重組：已存在的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生新組合的過程；分子間或染色體間重組：通過混合離散染色體產(chǎn)生新的組合。如孟德爾遺傳學中非同源染色體的自由組合等現(xiàn)象；分子內(nèi)或染色體內(nèi)重組：指由于不同DNA鏈的剪切和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換和重新組合形成新的DNA分子的過程。2?第一節(jié)基因重組概述一、遺傳重組的概念2?二、分子內(nèi)重組類型同源重組：發(fā)生在同源序列間。調(diào)節(jié)蛋白(如大腸桿菌RecA蛋白)不是序列專一性的，而是同源依賴的。真核生物有絲分裂、減數(shù)分裂過程中廣泛存在；位點特異性重組：供體和受體分子重組部分通常有一短的同源序列。位點特異性重組酶識別該特異位點，調(diào)節(jié)這一過程需要多種蛋白的協(xié)調(diào)作用；3?二、分子內(nèi)重組類型同源重組：發(fā)生在同源序列間。調(diào)節(jié)蛋白(如大轉(zhuǎn)座重組：不需要同源序列。調(diào)節(jié)這一過程的蛋白(轉(zhuǎn)座酶、整合酶)識別重組分子中短特異性序列；異常重組(illegitimaterecombination)：發(fā)生于非同源序列之間，是細胞異常作用的結(jié)果。包括復制中不正常末端連接，鏈滑動或成環(huán)。人工重組：體外使用純化的酶和底物進行的DNA連接。4?轉(zhuǎn)座重組：不需要同源序列。調(diào)節(jié)這一過程的蛋白(轉(zhuǎn)座酶、整合酶大腸桿菌四種遺傳重組的一般特征類型同源序列RecA蛋白序列特異性酶同源重組需要需要不需要位點特異性重組需特定短序列不需要需要轉(zhuǎn)座重組不需要不需要需要異常重組不需要不需要？5?大腸桿菌四種遺傳重組的一般特征類型同源序列RecA蛋白序列特第二節(jié)同源重組

(homologousrecombination)6?第二節(jié)同源重組

(homologousrecombin一、同源重組的基本特征同源重組是同源依賴的，不是序列依賴的；重組時兩條同源鏈經(jīng)過斷裂和重接，形成新的雙鏈分子；交換位點可發(fā)生在同源區(qū)任何位置上；交換位點上，兩個雙鏈分子的各一條鏈進行堿基配對，產(chǎn)生不同DNA雙鏈之間的連接區(qū)或聯(lián)會點；依靠recA的重組產(chǎn)生一個四條鏈的Holliday中間體。7?一、同源重組的基本特征同源重組是同源依賴的，不是序列依賴的；二、同源重組的兩個基本功能遺傳混合DNA修復8?二、同源重組的兩個基本功能遺傳混合8?Holliday模型：重組發(fā)生在異源雙鏈間，涉及DNA鏈的打斷和重新連接產(chǎn)生新的分子；Meselson-Radding模型：DNA雙鏈斷裂引發(fā)重組，在DNA修復中重組發(fā)生。三、同源重組模型9?Holliday模型：重組發(fā)生在異源雙鏈間，涉及DNA鏈的打1、同源重組與減數(shù)分裂Recombinationoccursduringthefirstmeioticprophase.Thestagesofprophasearedefinedbytheappearanceofthechromosomes,eachofwhichconsistsoftworeplicas(sisterchromatids).Themolecularinteractionsofanyindividualcrossing-overeventinvolvetwoofthefourduplexDNAs.

細線期合線期粗線期雙線期終變期10?1、同源重組與減數(shù)分裂Recombinationoccur2、Holliday重組模型1）兩個具同源序列的DNA雙螺旋分子排列在一起(1)；2）切斷：核酸酶和RecBC蛋白復合體作用下在一對姐妹染色單體產(chǎn)生切口，切口發(fā)生在約相隔4kb就有一個的chi（GCTGCTGG）序列(2)；3）侵入：含有5’端切口的單鏈DNA被RecA蛋白包裹形成RecA-ssDNA細絲，這些相互細絲交換并尋找相對的DNA雙螺旋上的相應(yīng)序列(3)；11?2、Holliday重組模型1）兩個具同源序列的DNA雙螺旋4）Holliday中間體：切口封閉形成Holliday中間體(4,5)；5）分支遷移：兩條DNA分子間的交叉點可以沿DNA移動；移動實際上是兩條DNA分子間交叉的同源單鏈互相置換的結(jié)果(6);6）Holliday中間體旋轉(zhuǎn)變構(gòu)(8&9)；12?4）Holliday中間體：切口封閉形成Holliday中間7）Holliday中間體拆分（二次切斷），可以有兩種情況：Holliday中間體二次切割發(fā)生在原斷裂的兩條單鏈上，稱為非交換型重組，雙鏈中存在異源區(qū)域(圖10,11,12)；Holliday中間體二次切割發(fā)生在另外兩條單鏈上，稱為交換型重組(圖10’,11’,12’)。13?7）Holliday中間體拆分（二次切斷），可以有兩種情況：Holliday模型1.聯(lián)會：同源雙鏈配對；2.切刻：聯(lián)會兩分子中各發(fā)生一個單鏈斷裂；3.鏈交換：斷裂單鏈進行重新堿基配對交換，形成Holliday構(gòu)型；4.分支移動：使Holliday構(gòu)型交叉點移位；5.產(chǎn)生二次切刻；6.切刻封閉產(chǎn)生重組分子。14?Holliday模型1.聯(lián)會：同源雙鏈配對；14?3、Meselson-Radding雙鏈斷裂模型

15?3、Meselson-Radding雙鏈斷裂模型15?4、環(huán)狀DNA同源重組過程1）雙鏈環(huán)狀DNA同源重組形成每條DNA分子首尾相連的8字型中間體；2）8字型中間體的拆分有兩種形式：一是產(chǎn)生兩個親體環(huán)狀DNA分子，但每個各含有一段異源雙鏈區(qū)；產(chǎn)生一個由兩個親體DNA分子首尾共價連接而成的二聚環(huán)。16?4、環(huán)狀DNA同源重組過程1）雙鏈環(huán)狀DNA同源重組形成每條5、同源重組模型的實驗驗證Holliday中間體的電鏡觀察：電鏡下可觀察到X174、大腸桿菌質(zhì)粒等的“8”字形結(jié)構(gòu)；用單一切點酶處理“8”字形分子，則形成具有兩對相同長度臂的型分子(b,c)，說明兩個分子通過同源區(qū)共價連接的。17?5、同源重組模型的實驗驗證Holliday中間體的電鏡觀察：四、細菌的重組1、轉(zhuǎn)化中的重組感受態(tài)細胞表面有一種DNA結(jié)合蛋白因子，特異性結(jié)合雙鏈DNA；在內(nèi)切核酸酶作用下，一條鏈被降解，另一條鏈被吸收到細胞質(zhì)內(nèi)；被吸收的單鏈DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成遮蔽復合物，保護單鏈DNA免受核酸酶的降解；“遮蔽”復合物把單鏈DNA帶至受體染色體，通過彼此的重組，單鏈DNA片段整合到染色體上，置換了宿主染色體的同源部分生成帶有錯配堿基對的雜合區(qū)；整合過程中產(chǎn)生的錯配通過修復機制進行修復。18?四、細菌的重組1、轉(zhuǎn)化中的重組18?轉(zhuǎn)化機制轉(zhuǎn)化過程中recA蛋白質(zhì)起著重要作用19?轉(zhuǎn)化機制轉(zhuǎn)化過程中recA蛋白質(zhì)起著重要作用19?2、細菌接合中的重組1）接合：細胞直接接觸，供體DNA通過專門的接合管轉(zhuǎn)移至受體細胞，過程由致育因子F質(zhì)粒來完成；2）接合重組過程F+細胞性纖毛與F細胞表面特異識別位點作用，形成接合管或接合橋；當接合發(fā)生在F+及F之間時，F(xiàn)質(zhì)粒編碼的特異內(nèi)切酶在oriT位點上打開缺口，F(xiàn)+DNA的一條單鏈留下復制恢復其雙鏈狀態(tài)，另一條進入受體細胞的單鏈以不連續(xù)方式合成互補鏈。染色體上一些特殊區(qū)域與F因子的某些部位有同源性，可以讓F因子插入，生成Hfr細胞；當Hfr與F結(jié)合時，Hfr染色體的轉(zhuǎn)移是以單鏈形式進行，并以單鏈形式通過一般重組與寄主染色體整合；F質(zhì)粒整合需要寄主重組系統(tǒng)RecA蛋白和RecBC蛋白。20?2、細菌接合中的重組1）接合：細胞直接接觸，供體DNA通過專F因子插入模型染色體上一些特殊區(qū)域與F因子的某些部位有同源性，可以讓F因子插入，生成Hfr細胞。21?F因子插入模型染色體上一些特殊區(qū)域與F因子的某些部位有同源性3、細菌轉(zhuǎn)導中的重組1）轉(zhuǎn)導：供體細胞基因通過噬菌體運載進入受體；普遍性轉(zhuǎn)導：被轉(zhuǎn)導DNA片段是隨機的；專一性轉(zhuǎn)導：轉(zhuǎn)移的染色體DNA是特定片段。2）轉(zhuǎn)導重組的一般特征轉(zhuǎn)導遺傳重組都在雙鏈DNA片段和完整DNA分子間發(fā)生；轉(zhuǎn)導的重組過程與兩個完整DNA分子的重組相類似，起始于單鏈侵入和取代；轉(zhuǎn)導也需要RecA和RecBC蛋白質(zhì)。22?3、細菌轉(zhuǎn)導中的重組1）轉(zhuǎn)導：供體細胞基因通過噬菌體運載進入五、同源重組過程的酶學1、RecA蛋白又稱做重組酶，分子量約38kD，由recA基因編碼，為含4個亞基的四聚體；2、RecA是同源重組最重要的蛋白，主要功能是促進DNA分子同源聯(lián)會和DNA分子間的單鏈交換。（一）RecA蛋白質(zhì)23?五、同源重組過程的酶學1、RecA蛋白又稱做重組酶，分子量約3、與重組有關(guān)的活性單鏈DNA結(jié)合活性：形成的復合物是DNA單鏈交換中的活性形式；雙鏈DNA結(jié)合活性：依賴于ATP，RecA與雙鏈DNA結(jié)合導致解鏈，并最終促使RecA與單鏈DNA的結(jié)合；NTP酶活性：單鏈或雙鏈DNA存在時，該蛋白可水解NTP并與DNA結(jié)合；但只有ATP水解才能促進聯(lián)會；促進互補單鏈復性的能力。24?3、與重組有關(guān)的活性單鏈DNA結(jié)合活性：形成的復合物是DNA4、RecA蛋白的作用方式RecA蛋白首先與單鏈DNA結(jié)合（約每分子可結(jié)合５個核苷酸），形成一條DNA－蛋白質(zhì)細絲（需消耗ATP），RecA蛋白即被活化；活化的RecA將雙螺旋解旋和分離，同時試圖將其結(jié)合的單鏈與被解旋區(qū)域退火，如此繼續(xù)，直到找到互補順序。一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供應(yīng)的能量就會繼續(xù)驅(qū)使配對反應(yīng)趨于完成，其方向是５’→３’（單鏈部分）。新的雜交雙鏈形成時，RecA蛋白即從原來的單鏈掉下來。

25?4、RecA蛋白的作用方式RecA蛋白首先與單鏈DNA結(jié)合（26?26?RecA蛋白促進的各類DNA分子間的聯(lián)會參與聯(lián)會的DNA分子可以是多種不同的形態(tài)分子的組合；但無論那種組合，其中一個分子是單鏈分子，或者有足夠長度的單鏈區(qū)。27?RecA蛋白促進的各類DNA分子間的聯(lián)會參與聯(lián)會的DNA分子（二）RecBCD蛋白質(zhì)1、RecBCD酶由recB、recC、recD基因編碼。2、RecBCD酶的活性作用于單、雙鏈DNA的外切酶活性，因此又稱做核酸外切酶V，依賴于ATP；線形DNA的解旋酶活性；序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性。28?（二）RecBCD蛋白質(zhì)1、RecBCD酶由recB、recRecBCD酶在含有游離雙螺旋端的DNA分子上起始其解旋作用。它結(jié)合在雙螺旋游離端，利用ATP的能量沿雙螺旋前進，經(jīng)過處DNA解旋又復旋。RecBCD酶在Chi位點上促進重組作用。Chi核苷酸順序是5’GCTGGTGG3’，是重組頻率較高的部位。當解旋的DNA鏈上有Chi位點時，RecBCD酶出現(xiàn)特異的核酸酶活性，將靠近Chi處（約離Chi4-6堿基處）的單鏈切斷。

3、RecBCD的功能29?RecBCD酶在含有游離雙螺旋端的DNA分子上起始其解旋作用30?30?31?31?（三）RecE和RecF蛋白質(zhì)recA突變株的重組頻率為10-6

，recA、recBC-突變株的重組頻率為10-2，殘存的重組活力依賴于RecF途徑；recE基因編碼外切核酸酶VIII，能提高RecF途徑的重組效率；該酶對單鏈DNA只有少量活性，對雙鏈DNA活力較高，無內(nèi)切核酸酶活力，是一種不依賴于ATP的核酸酶。大腸桿菌同源重組有兩條途徑：主要是RecBCD途徑，次要途徑為RecF。32?（三）RecE和RecF蛋白質(zhì)recA突變株的重組頻率為1第三節(jié)位點特異性重組

(site-specificrecombination)33?第三節(jié)位點特異性重組

(site-specificre一、位點特異性重組的一般特點發(fā)生在兩對DNA分子特定位點間，是涉及一段互補堿基的配對和交換的重組過程；不依賴于DNA順序同源性（雖然亦可有很短的同源序列），而依賴于能與某些酶相結(jié)合的DNA序列的存在。整合作用有兩個特點：交換是可逆的，原先存在的DNA順序全部被保存，無丟失；交換的DNA間有一段很短的同源序列，重組交換須通過其中的一個特定的核苷酸。34?一、位點特異性重組的一般特點發(fā)生在兩對DNA分子特定位點間，二、噬菌體的整合1、位點特征附著位點（att）：細菌和噬菌體間發(fā)生重組和切除的特異性位點，細菌染色體上的為attB，噬菌體上為attP；attB由順序O及旁側(cè)順序B及B’組成（BOB’位點），attP由POP’組成（POP’位點）；O序列（core順序）為attB和attP共有，是重組發(fā)生的位點，由15個核苷酸對組成：5′GCTTTTTTATACTAA3′3′CGAAAAAATATGATT5′35?二、噬菌體的整合1、位點特征35?2、位點特異性重組中的酶整合酶（Int）：由噬菌體int基因編碼的DNA結(jié)合蛋白，能識別attP及attB位點；負責使BOB’與POP’位點“聯(lián)會”；整合酶同時是拓撲異構(gòu)酶I，負責4條DNA鏈的斷裂、互換和重接。整合寄主因子（IHF）：包括兩個不同的亞基，由寄主基因himA和himD編碼，IHF與Int相互作用；切除酶（Xis）：與Int結(jié)合形成復合體，能與BOP’和POB’結(jié)合并催化二者間的重組，由噬菌體xis基因編碼；蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)刺激因子（FIS）：參與原噬菌體的切除反應(yīng)，由寄主基因編碼。36?2、位點特異性重組中的酶整合酶（Int）：由噬菌體int基因3、噬菌體DNA的重組——整合與切除1）整合過程Int與IHF與att位點結(jié)合；attP及attB配對；att位點共同順序內(nèi)準確斷裂、重組，重新連接；整合后在兩旁形成兩個重組att位點BOP’及POB’，即attL及attR。2）切除反應(yīng)切離識別的是attL和attR；切除的酶類與整合不同；3）位點特異性重組有方向性37?3、噬菌體DNA的重組——整合與切除1）整合過程37?噬菌體整合的分子機制attP及attB配對，重組發(fā)生在各自核心O序列中；在Int和IHF的催化下，兩個att位點核心序列參差斷裂，但斷裂位點完全一致，產(chǎn)生相同的7個核苷酸的粘性末端；復合發(fā)生在兩個不同的att位點核心序列之間，整合后在兩旁形成兩個重組att位點BOP’及POB’。38?噬菌體整合的分子機制attP及attB配對，重組發(fā)生在各自ＥＮＤ39?ＥＮＤ39?生活中的辛苦阻撓不了我對生活的熱愛。1月-231月-23Monday,January2,2023人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。21:53:0221:53:0221:531/2/20239:53:02PM做一枚螺絲釘，那里需要那里上。1月-2321:53:0221:53Jan-2302-Jan-23日復一日的努力只為成就美好的明天。21:53:0221:53:0221:53Monday,January2,2023安全放在第一位，防微杜漸。1月-231月-2321:53:0221:53:02January2,2023加強自身建設(shè)，增強個人的休養(yǎng)。2023年1月2日9:53下午1月-231月-23精益求精，追求卓越，因為相信而偉大。02一月20239:53:02下午21:53:021月-23讓自己更加強大，更加專業(yè)，這才能讓自己更好。一月239:53下午1月-2321:53January2,2023這些年的努力就為了得到相應(yīng)的回報。2023/1/221:53:0221:53:0202January2023科學，你是國力的靈魂；同時又是社會發(fā)展的標志。9:53:02下午9:53下午21:53:021月-23每天都是美好的一天，新的一天開啟。1月-231月-2321:5321:53:0221:53:02Jan-23相信命運，讓自己成長，慢慢的長大。2023/1/221:53:02Monday,January2,2023愛情，親情，友情，讓人無法割舍。1月-232023/1/221:53:021月-23謝謝大家！生活中的辛苦阻撓不了我對生活的熱愛。12月-2212月-22第七章基因重組41?第七章基因重組1?第一節(jié)基因重組概述一、遺傳重組的概念重組：已存在的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生新組合的過程；分子間或染色體間重組：通過混合離散染色體產(chǎn)生新的組合。如孟德爾遺傳學中非同源染色體的自由組合等現(xiàn)象；分子內(nèi)或染色體內(nèi)重組：指由于不同DNA鏈的剪切和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換和重新組合形成新的DNA分子的過程。42?第一節(jié)基因重組概述一、遺傳重組的概念2?二、分子內(nèi)重組類型同源重組：發(fā)生在同源序列間。調(diào)節(jié)蛋白(如大腸桿菌RecA蛋白)不是序列專一性的，而是同源依賴的。真核生物有絲分裂、減數(shù)分裂過程中廣泛存在；位點特異性重組：供體和受體分子重組部分通常有一短的同源序列。位點特異性重組酶識別該特異位點，調(diào)節(jié)這一過程需要多種蛋白的協(xié)調(diào)作用；43?二、分子內(nèi)重組類型同源重組：發(fā)生在同源序列間。調(diào)節(jié)蛋白(如大轉(zhuǎn)座重組：不需要同源序列。調(diào)節(jié)這一過程的蛋白(轉(zhuǎn)座酶、整合酶)識別重組分子中短特異性序列；異常重組(illegitimaterecombination)：發(fā)生于非同源序列之間，是細胞異常作用的結(jié)果。包括復制中不正常末端連接，鏈滑動或成環(huán)。人工重組：體外使用純化的酶和底物進行的DNA連接。44?轉(zhuǎn)座重組：不需要同源序列。調(diào)節(jié)這一過程的蛋白(轉(zhuǎn)座酶、整合酶大腸桿菌四種遺傳重組的一般特征類型同源序列RecA蛋白序列特異性酶同源重組需要需要不需要位點特異性重組需特定短序列不需要需要轉(zhuǎn)座重組不需要不需要需要異常重組不需要不需要？45?大腸桿菌四種遺傳重組的一般特征類型同源序列RecA蛋白序列特第二節(jié)同源重組

(homologousrecombination)46?第二節(jié)同源重組

(homologousrecombin一、同源重組的基本特征同源重組是同源依賴的，不是序列依賴的；重組時兩條同源鏈經(jīng)過斷裂和重接，形成新的雙鏈分子；交換位點可發(fā)生在同源區(qū)任何位置上；交換位點上，兩個雙鏈分子的各一條鏈進行堿基配對，產(chǎn)生不同DNA雙鏈之間的連接區(qū)或聯(lián)會點；依靠recA的重組產(chǎn)生一個四條鏈的Holliday中間體。47?一、同源重組的基本特征同源重組是同源依賴的，不是序列依賴的；二、同源重組的兩個基本功能遺傳混合DNA修復48?二、同源重組的兩個基本功能遺傳混合8?Holliday模型：重組發(fā)生在異源雙鏈間，涉及DNA鏈的打斷和重新連接產(chǎn)生新的分子；Meselson-Radding模型：DNA雙鏈斷裂引發(fā)重組，在DNA修復中重組發(fā)生。三、同源重組模型49?Holliday模型：重組發(fā)生在異源雙鏈間，涉及DNA鏈的打1、同源重組與減數(shù)分裂Recombinationoccursduringthefirstmeioticprophase.Thestagesofprophasearedefinedbytheappearanceofthechromosomes,eachofwhichconsistsoftworeplicas(sisterchromatids).Themolecularinteractionsofanyindividualcrossing-overeventinvolvetwoofthefourduplexDNAs.

細線期合線期粗線期雙線期終變期50?1、同源重組與減數(shù)分裂Recombinationoccur2、Holliday重組模型1）兩個具同源序列的DNA雙螺旋分子排列在一起(1)；2）切斷：核酸酶和RecBC蛋白復合體作用下在一對姐妹染色單體產(chǎn)生切口，切口發(fā)生在約相隔4kb就有一個的chi（GCTGCTGG）序列(2)；3）侵入：含有5’端切口的單鏈DNA被RecA蛋白包裹形成RecA-ssDNA細絲，這些相互細絲交換并尋找相對的DNA雙螺旋上的相應(yīng)序列(3)；51?2、Holliday重組模型1）兩個具同源序列的DNA雙螺旋4）Holliday中間體：切口封閉形成Holliday中間體(4,5)；5）分支遷移：兩條DNA分子間的交叉點可以沿DNA移動；移動實際上是兩條DNA分子間交叉的同源單鏈互相置換的結(jié)果(6);6）Holliday中間體旋轉(zhuǎn)變構(gòu)(8&9)；52?4）Holliday中間體：切口封閉形成Holliday中間7）Holliday中間體拆分（二次切斷），可以有兩種情況：Holliday中間體二次切割發(fā)生在原斷裂的兩條單鏈上，稱為非交換型重組，雙鏈中存在異源區(qū)域(圖10,11,12)；Holliday中間體二次切割發(fā)生在另外兩條單鏈上，稱為交換型重組(圖10’,11’,12’)。53?7）Holliday中間體拆分（二次切斷），可以有兩種情況：Holliday模型1.聯(lián)會：同源雙鏈配對；2.切刻：聯(lián)會兩分子中各發(fā)生一個單鏈斷裂；3.鏈交換：斷裂單鏈進行重新堿基配對交換，形成Holliday構(gòu)型；4.分支移動：使Holliday構(gòu)型交叉點移位；5.產(chǎn)生二次切刻；6.切刻封閉產(chǎn)生重組分子。54?Holliday模型1.聯(lián)會：同源雙鏈配對；14?3、Meselson-Radding雙鏈斷裂模型

55?3、Meselson-Radding雙鏈斷裂模型15?4、環(huán)狀DNA同源重組過程1）雙鏈環(huán)狀DNA同源重組形成每條DNA分子首尾相連的8字型中間體；2）8字型中間體的拆分有兩種形式：一是產(chǎn)生兩個親體環(huán)狀DNA分子，但每個各含有一段異源雙鏈區(qū)；產(chǎn)生一個由兩個親體DNA分子首尾共價連接而成的二聚環(huán)。56?4、環(huán)狀DNA同源重組過程1）雙鏈環(huán)狀DNA同源重組形成每條5、同源重組模型的實驗驗證Holliday中間體的電鏡觀察：電鏡下可觀察到X174、大腸桿菌質(zhì)粒等的“8”字形結(jié)構(gòu)；用單一切點酶處理“8”字形分子，則形成具有兩對相同長度臂的型分子(b,c)，說明兩個分子通過同源區(qū)共價連接的。57?5、同源重組模型的實驗驗證Holliday中間體的電鏡觀察：四、細菌的重組1、轉(zhuǎn)化中的重組感受態(tài)細胞表面有一種DNA結(jié)合蛋白因子，特異性結(jié)合雙鏈DNA；在內(nèi)切核酸酶作用下，一條鏈被降解，另一條鏈被吸收到細胞質(zhì)內(nèi)；被吸收的單鏈DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成遮蔽復合物，保護單鏈DNA免受核酸酶的降解；“遮蔽”復合物把單鏈DNA帶至受體染色體，通過彼此的重組，單鏈DNA片段整合到染色體上，置換了宿主染色體的同源部分生成帶有錯配堿基對的雜合區(qū)；整合過程中產(chǎn)生的錯配通過修復機制進行修復。58?四、細菌的重組1、轉(zhuǎn)化中的重組18?轉(zhuǎn)化機制轉(zhuǎn)化過程中recA蛋白質(zhì)起著重要作用59?轉(zhuǎn)化機制轉(zhuǎn)化過程中recA蛋白質(zhì)起著重要作用19?2、細菌接合中的重組1）接合：細胞直接接觸，供體DNA通過專門的接合管轉(zhuǎn)移至受體細胞，過程由致育因子F質(zhì)粒來完成；2）接合重組過程F+細胞性纖毛與F細胞表面特異識別位點作用，形成接合管或接合橋；當接合發(fā)生在F+及F之間時，F(xiàn)質(zhì)粒編碼的特異內(nèi)切酶在oriT位點上打開缺口，F(xiàn)+DNA的一條單鏈留下復制恢復其雙鏈狀態(tài)，另一條進入受體細胞的單鏈以不連續(xù)方式合成互補鏈。染色體上一些特殊區(qū)域與F因子的某些部位有同源性，可以讓F因子插入，生成Hfr細胞；當Hfr與F結(jié)合時，Hfr染色體的轉(zhuǎn)移是以單鏈形式進行，并以單鏈形式通過一般重組與寄主染色體整合；F質(zhì)粒整合需要寄主重組系統(tǒng)RecA蛋白和RecBC蛋白。60?2、細菌接合中的重組1）接合：細胞直接接觸，供體DNA通過專F因子插入模型染色體上一些特殊區(qū)域與F因子的某些部位有同源性，可以讓F因子插入，生成Hfr細胞。61?F因子插入模型染色體上一些特殊區(qū)域與F因子的某些部位有同源性3、細菌轉(zhuǎn)導中的重組1）轉(zhuǎn)導：供體細胞基因通過噬菌體運載進入受體；普遍性轉(zhuǎn)導：被轉(zhuǎn)導DNA片段是隨機的；專一性轉(zhuǎn)導：轉(zhuǎn)移的染色體DNA是特定片段。2）轉(zhuǎn)導重組的一般特征轉(zhuǎn)導遺傳重組都在雙鏈DNA片段和完整DNA分子間發(fā)生；轉(zhuǎn)導的重組過程與兩個完整DNA分子的重組相類似，起始于單鏈侵入和取代；轉(zhuǎn)導也需要RecA和RecBC蛋白質(zhì)。62?3、細菌轉(zhuǎn)導中的重組1）轉(zhuǎn)導：供體細胞基因通過噬菌體運載進入五、同源重組過程的酶學1、RecA蛋白又稱做重組酶，分子量約38kD，由recA基因編碼，為含4個亞基的四聚體；2、RecA是同源重組最重要的蛋白，主要功能是促進DNA分子同源聯(lián)會和DNA分子間的單鏈交換。（一）RecA蛋白質(zhì)63?五、同源重組過程的酶學1、RecA蛋白又稱做重組酶，分子量約3、與重組有關(guān)的活性單鏈DNA結(jié)合活性：形成的復合物是DNA單鏈交換中的活性形式；雙鏈DNA結(jié)合活性：依賴于ATP，RecA與雙鏈DNA結(jié)合導致解鏈，并最終促使RecA與單鏈DNA的結(jié)合；NTP酶活性：單鏈或雙鏈DNA存在時，該蛋白可水解NTP并與DNA結(jié)合；但只有ATP水解才能促進聯(lián)會；促進互補單鏈復性的能力。64?3、與重組有關(guān)的活性單鏈DNA結(jié)合活性：形成的復合物是DNA4、RecA蛋白的作用方式RecA蛋白首先與單鏈DNA結(jié)合（約每分子可結(jié)合５個核苷酸），形成一條DNA－蛋白質(zhì)細絲（需消耗ATP），RecA蛋白即被活化；活化的RecA將雙螺旋解旋和分離，同時試圖將其結(jié)合的單鏈與被解旋區(qū)域退火，如此繼續(xù)，直到找到互補順序。一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供應(yīng)的能量就會繼續(xù)驅(qū)使配對反應(yīng)趨于完成，其方向是５’→３’（單鏈部分）。新的雜交雙鏈形成時，RecA蛋白即從原來的單鏈掉下來。

65?4、RecA蛋白的作用方式RecA蛋白首先與單鏈DNA結(jié)合（66?26?RecA蛋白促進的各類DNA分子間的聯(lián)會參與聯(lián)會的DNA分子可以是多種不同的形態(tài)分子的組合；但無論那種組合，其中一個分子是單鏈分子，或者有足夠長度的單鏈區(qū)。67?RecA蛋白促進的各類DNA分子間的聯(lián)會參與聯(lián)會的DNA分子（二）RecBCD蛋白質(zhì)1、RecBCD酶由recB、recC、recD基因編碼。2、RecBCD酶的活性作用于單、雙鏈DNA的外切酶活性，因此又稱做核酸外切酶V，依賴于ATP；線形DNA的解旋酶活性；序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性。68?（二）RecBCD蛋白質(zhì)1、RecBCD酶由recB、recRecBCD酶在含有游離雙螺旋端的DNA分子上起始其解旋作用。它結(jié)合在雙螺旋游離端，利用ATP的能量沿雙螺旋前進，經(jīng)過處DNA解旋又復旋。RecBCD酶在Chi位點上促進重組作用。Chi核苷酸順序是5’GCTGGTGG3’，是重組頻率較高的部位。當解旋的DNA鏈上有Chi位點時，RecBCD酶出現(xiàn)特異的核酸酶活性，將靠近Chi處（約離Chi4-6堿基處）的單鏈切斷。

3、RecBCD的功能69?RecBCD酶在含有游離雙螺旋端的DNA分子上起始其解旋作用70?30?71?31?（三）RecE和RecF蛋白質(zhì)recA突變株的重組頻率為10-6

，recA、recBC-突變株的重組頻率為10-2，殘存的重組活力依賴于RecF途徑；recE基因編碼外切核酸酶VIII，能提高RecF途徑的重組效率；該酶對單鏈DNA只有少量活性，對雙鏈DNA活力較高，無內(nèi)切核酸酶活力，是一種不依賴于ATP的核酸酶。大腸桿菌同源重組有兩條途徑：主要是RecBCD途徑，次要途徑為RecF。72?（三）RecE和RecF蛋白質(zhì)recA突變株的重組頻率為1第三節(jié)位點特異性重組

(site-specificrecombination)73?第三節(jié)位點特異性重組

(site-specificre一、位點特異性重組的一般特點發(fā)生在兩對DNA分子特定位點間，是涉及一段互補堿基的配對和交換的重組過程；不依賴于DNA順序同源性（雖然亦可有很短的同源序列），而依賴于能與某些酶相結(jié)合的DNA序列的存在。整合作用有兩個特點：交換是可逆的，原先存在的DNA順序全部被保存，無丟失；交換的DNA間有一段很短的同源序列，重組交換須通過其中的一個特定的核苷酸。74?一、位點特異性重組的一般特點發(fā)生在兩對DNA分子特定位點間，二、噬菌體的整合1、位點特征附著位點（att）：細菌和噬菌體間發(fā)生重組和切除的特異性位點，細菌染色體上的為attB，噬菌體上為attP；attB由順序O及旁側(cè)順序B及B’組成（BOB’位點），attP由POP’組成（POP’位點）；O序列（core順序）為attB和attP共有，是重組發(fā)生的位點，由15個核苷酸對組成：5′GCTTTTTTATACTAA3′3′CGAAAAAATATGATT5′75?二、噬菌體的整合1、位點特征35?2、位點特異性重組中的酶整合酶（Int）：由噬菌體int基因編碼的DNA結(jié)合蛋白，能識別attP及attB位點；負責使BOB’與POP’位點“聯(lián)會”；整合酶同時是拓撲異構(gòu)