培養(yǎng)基及其配制學(xué)時(shí)課件

第二章

培養(yǎng)基及其配制講授：張麗瓊第二章培養(yǎng)基及其配制講授：張麗瓊第二章培養(yǎng)基及其配制學(xué)時(shí)課件培養(yǎng)基及其作用：是向植物細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)的場(chǎng)所。其作用是向植物細(xì)胞提供所需的各種營(yíng)養(yǎng)；調(diào)節(jié)滲透壓、酸堿度；供給水分。固體培養(yǎng)基還起著支撐作用。培養(yǎng)基及其作用：是向植物細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)的場(chǎng)所。其培養(yǎng)基的種類(lèi)培養(yǎng)基的成分及作用常用培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的配制

本章主要內(nèi)容培養(yǎng)基的種類(lèi)本章主要內(nèi)容◆培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基◆培養(yǎng)過(guò)程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基◆其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基

◆營(yíng)養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類(lèi)◆培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類(lèi)二、培養(yǎng)基的成分及作用

植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等點(diǎn)化學(xué)方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。二、培養(yǎng)基的成分及作用植物體內(nèi)至少含有幾十種其它添加物固化劑植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基組成無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分+有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分=基本培養(yǎng)基其它添加物固化劑植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營(yíng)養(yǎng)元素的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史。B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專(zhuān)一的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充該元素來(lái)預(yù)防和恢復(fù)。C、該元素在植物營(yíng)養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果。Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營(yíng)養(yǎng)元素國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素有16（17）種：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素有16（17）種：根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為※大量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S9種※微量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kg

Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl7種按照國(guó)際植物生理協(xié)會(huì)的建議：所需濃度>0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度<0.5mmol/L的元素為微量元素根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為按照國(guó)際植物生理協(xié)會(huì)的1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位置。供應(yīng)的氮化物有硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀等。有時(shí)，也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。

P是是生物膜、核苷酸（如ATP）、核酸的重要組成部分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K對(duì)碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCl、KNO3等鹽類(lèi)提供。1、大量元素Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO4·7H2O提供。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。常以CaCl2·2H2O提供。Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有2、微量元素

在微量元素中，鐵的作用最大：

◆一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成分。

◆葉綠素形成的必要條件

◆在制做培養(yǎng)基時(shí)常用FeSO4·7H2O和Ｎa2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物可防止鐵的沉淀。2、微量元素

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類(lèi)運(yùn)輸有著密切的關(guān)系

銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長(zhǎng)

錳參與植物的光合、呼吸代謝

鉬參與氮素的代謝

氯是光合作用水光解的活化劑微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。硼與蛋白質(zhì)合成、糖類(lèi)運(yùn)輸有著密切的關(guān)系這些整株植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)于植物組織培養(yǎng)來(lái)說(shuō)也是必需的。當(dāng)某些營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)。這些整株植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)

缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。桃樹(shù)

缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加缺銅癥狀：新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變成深褐色，引起落葉。枝頂端生長(zhǎng)不良，其下部的芽開(kāi)始生長(zhǎng)，形成叢生的細(xì)枝。菊花缺銅癥狀：菊花缺錳典型癥狀：葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開(kāi)始。菜豆缺錳典型癥狀：菜豆缺鉬典型癥狀：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。白菜缺鉬典型癥狀：白菜缺硼典型癥狀：受精不良,籽粒減少，“花而不實(shí)”，“蕾而不花”；根尖、莖尖的生長(zhǎng)點(diǎn)停止生長(zhǎng)，而形成簇生狀；常引起各種腐爛病。馬鈴薯缺硼典型癥狀：馬鈴薯3、有機(jī)化合物：培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱(chēng)為基本培養(yǎng)基。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長(zhǎng)。常加入的有機(jī)成分主要有以下幾類(lèi)：

(1)

碳水化合物：碳源物質(zhì)包括糖類(lèi)物質(zhì)、醇類(lèi)物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類(lèi)物質(zhì)最重要。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。糖類(lèi)物質(zhì)特點(diǎn)：

◆具有熱易變的性質(zhì)◆利于吸收和利用

◆使用濃度一般在2%—5%

◆提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓3、有機(jī)化合物：培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱(chēng)為基（2）維生素類(lèi)

◆以各種輔酶的形式存在

◆參與多種代謝活動(dòng)

◆對(duì)生長(zhǎng)，分化等有很好的促進(jìn)作用

◆主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素

◆常用維生素有VB1和VB6

VB1(鹽酸硫胺素)：對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用。

VB6(鹽酸吡哆醇)：能促進(jìn)根的生長(zhǎng)。

VPP(煙酸)：與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。

VC(抗壞血酸)：有防止組織變褐的作用。（2）維生素類(lèi)（3）肌醇又叫環(huán)己六醇，在糖類(lèi)的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。用于構(gòu)建細(xì)胞壁。參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動(dòng)。促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用。使用肌醇能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用。（3）肌醇（4）氨基酸

◆蛋白質(zhì)的組成成分

◆有機(jī)氮源

◆可直接被細(xì)胞吸收利用

◆培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸。有時(shí)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。（4）氨基酸（5）天然復(fù)合物

◆促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長(zhǎng)

◆成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。

◆天然營(yíng)養(yǎng)混合物，對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用。如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物①椰乳：它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用②香蕉：主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。③馬鈴薯：添加后可得到健壯的植株。④水解酪蛋白：為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸。⑤其它：酵母提取液、麥芽提取液等。（5）天然復(fù)合物4、培養(yǎng)材料的支持物（1）瓊脂在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。固體培養(yǎng)基利于組織置于培養(yǎng)基表面。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)?！羰鞘褂米钇毡榈哪虅粲昧恳话阍?—10g/L之間◆顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。4、培養(yǎng)材料的支持物（2）其它：有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)材料沒(méi)有影響或影響較小。（2）其它：有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害5、活性炭活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中分泌的酚、醌類(lèi)物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5－羥甲基糖醛?！粑脚囵B(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)

◆抑制外植體褐變

◆防止玻璃苗的產(chǎn)生

◆促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化

◆促進(jìn)生根缺點(diǎn)：

◆沒(méi)有選擇性活性炭5、活性炭活性炭莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于VC和半胱氨酸。在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長(zhǎng)。活性炭在生根時(shí)有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)。

莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化在使用活性炭時(shí)，要注意其吸附有害物質(zhì)和吸附生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的二重性，尤其是當(dāng)較高的活性炭足以能抵消生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的作用時(shí)，應(yīng)注意調(diào)整好活性炭與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物等培養(yǎng)基成分的用量，使其皆能發(fā)揮作用。在使用時(shí)要有其量的意識(shí)，使活性炭發(fā)揮其積極作用。

在使用活性炭時(shí)，要注意其吸附有害物質(zhì)和吸附生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的二重性6、抗生素抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20mg/l之間。添加抗生物質(zhì)可防止外植體內(nèi)生菌造成的污染。6、抗生素7、植物激素：在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。7、植物激素：在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)（1）生長(zhǎng)素類(lèi)：◆促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂

◆促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長(zhǎng)休眠、頂端優(yōu)勢(shì)、單性結(jié)實(shí)

◆誘導(dǎo)愈傷組織形成

◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好

◆常用的生長(zhǎng)素：

IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)（1）生長(zhǎng)素類(lèi)：IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，其活力較低,是生長(zhǎng)素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，NAA(萘乙酸)

在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比IAA高出3～4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。

IBA(吲哚丁酸)是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2,4-D（2,4－二氯苯氧乙酸）起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。NAA(萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能生長(zhǎng)素作用強(qiáng)弱順序：IAANAAIBA2,4-D強(qiáng)弱2，4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，IBA和NAA常用于生根生長(zhǎng)素作用強(qiáng)弱順序：IAANAAIBA2,4-D強(qiáng)弱2，4-

生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量95％酒精助溶。2,4-D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。生長(zhǎng)素常配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量95％酒精助溶（2）細(xì)胞分裂素類(lèi)這類(lèi)激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6－芐基氨基嘌呤)、Kt(激動(dòng)素)、ZT(玉米素)等。其中ZT活性最強(qiáng)，但非常昂貴。常用的是6-BA。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有以下作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)。誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。用于離體成花的調(diào)控。延緩組織的衰老并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成。

因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。

溶于0.5—1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中。（2）細(xì)胞分裂素類(lèi)（3）赤霉素類(lèi)和脫落酸

A、赤霉素類(lèi)

◆組織培養(yǎng)中不常使用

◆加速細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)

◆促進(jìn)細(xì)胞的分裂

◆主要是GA3

B、脫落酸

◆抑制細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)

◆促進(jìn)脫落和衰老

◆促進(jìn)休眠和提高抗逆能力（3）赤霉素類(lèi)和脫落酸赤霉素(GA)：培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于刺激在培養(yǎng)中形成的不定胚發(fā)育成小植株，促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。

赤霉素溶于酒精，配制時(shí)少量可用95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70～100％失效，應(yīng)當(dāng)采用過(guò)濾滅菌法加入。赤霉素(GA)：培養(yǎng)基中添加的是GA38、抗氧化物：植物組織在切割時(shí)會(huì)溢泌一些酚類(lèi)物質(zhì)，接觸空氣中的氧氣后，自動(dòng)氧化或由酶類(lèi)催化氧化為相應(yīng)的醌類(lèi)，產(chǎn)生可見(jiàn)的茶色、褐色以致黑色，這就是酚污染。這些物質(zhì)滲出細(xì)胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長(zhǎng)停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。8、抗氧化物：植物組織在切割時(shí)會(huì)溢泌一些酚類(lèi)物質(zhì)，接觸空氣中抗酚類(lèi)氧化常用的藥劑有半胱氨酸及Vc，可用50～200mg/l的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過(guò)濾滅菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。其它抗氧化劑有二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、抗壞血酸及二乙基二硫氨基甲酸酯等?？狗宇?lèi)氧化常用的藥劑有半胱氨酸及Vc，可用50～200mg/9、水作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是雙蒸水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。9、水三、常用培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)（一）幾種常用培養(yǎng)基的配方

組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基有：MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。三、常用培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)（一）幾種常用培養(yǎng)基的配方1、MS培養(yǎng)基

◆無(wú)機(jī)鹽濃度高◆高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽◆含有一定數(shù)量的銨鹽◆營(yíng)養(yǎng)豐富◆不需要添加更多的有機(jī)附加物（二）、幾種常見(jiàn)培養(yǎng)基的特點(diǎn)1、MS培養(yǎng)基（二）、幾種常見(jiàn)培養(yǎng)基的特點(diǎn)2、White培養(yǎng)基

◆1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)

◆

1963年作了改良，提高M(jìn)gSO4的濃度和增加硼元素

◆無(wú)機(jī)鹽濃度較低◆使用廣泛◆在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果2、White培養(yǎng)基3、B5培養(yǎng)基

◆1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)◆含有較低的銨鹽

◆較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素3、B5培養(yǎng)基4、N6培養(yǎng)基◆1974年朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)◆成分較簡(jiǎn)單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他禾谷類(lèi)植物的花粉和花藥培養(yǎng)。4、N6培養(yǎng)基AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出現(xiàn)濃度：1-10mg/L抗生素：種類(lèi)：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。作用：可防止外植體內(nèi)生菌污染。濃度：5—20mg/L。AgNO3:培養(yǎng)基＝基本培養(yǎng)基＋植物激素

培養(yǎng)基的選擇在實(shí)質(zhì)上講就是設(shè)計(jì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與激素（種類(lèi)、用量）的最佳組合。四、培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基＝基本培養(yǎng)基＋植物激素四、培養(yǎng)基的選擇篩選培養(yǎng)基常用的試驗(yàn)方法：

單因子試驗(yàn)

多因子試驗(yàn)

逐步添加和逐步排除試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基常用的試驗(yàn)方法：1、單因子試驗(yàn)只變動(dòng)一個(gè)因子，通過(guò)試驗(yàn)找出該因子的影響及影響程度。如：

MS+BA2+NAA

（0.1、0.5、1.0mg/L）

MS+BA+NAA0.1（1.0、2.0、3.0mg/L）不能反映各種單因子成分之間的組合效果與相互影響

1、單因子試驗(yàn)2、多因子試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱(chēng)為多因子實(shí)驗(yàn)。

2、多因子試驗(yàn)2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合（單位：mg/L）

例如研究NAA和BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處理的完全試驗(yàn)。BA00.52.5510NAA0123450.56789102.511121314155.016171819201021222324252種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合（單位：mg/L）例如研究N3、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法：成功前-逐步添加（各種營(yíng)養(yǎng)成分）實(shí)驗(yàn)成功成功后-逐步排除（減少各種成分）縮小范圍在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)單方法。3、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法：科學(xué)安排研究順序

１.定基本培養(yǎng)基，激動(dòng)素２.改良基本培養(yǎng)基３.調(diào)整蔗糖、瓊脂用量４.改變pH值５.探討培養(yǎng)的環(huán)境條件科學(xué)安排研究順序１.定基本培養(yǎng)基，激動(dòng)素1、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:①保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性②配制時(shí)的快速移?、郾阌诘蜏乇２亍Ｎ?、

培養(yǎng)基的配制1、母液(stocksolution)的配制和保存五、單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml?；炫浞ǎ簩最?lèi)營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱(chēng)量，分別溶解后再混合成母液。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類(lèi)等，一般配成比所需濃度高10～100倍的母液。

母液的配制方法：?jiǎn)闻浞ǎ簩⑴囵B(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般配制培養(yǎng)基時(shí)，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即配成：大量元素10倍液，定容至1000ml；微量元素100倍液，定容至1000ml；鐵鹽100倍液，定容至1000ml；維生素1mg/l，定容至100ml；激素1mg/l，定容至50～100ml。配制培養(yǎng)基時(shí)，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即配成：

配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ｃa2＋和SO42－，Ｃa2＋、Ｍg2＋和PO43－一起溶解后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時(shí)要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純。藥品的稱(chēng)量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如

一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類(lèi)可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、

ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制母液名稱(chēng)藥品名稱(chēng)

大量元素（MSI）

NH4NO3KNO3CaCl·2H2OMgSO4·7H2OKH2PO4微量元素（MSII）MnSO4·H2OZnSO4·7H2OCoCl·6H2OCuSO4·5H2OH3BO3Na2MO4·2H2OKI鐵鹽（MSIII）FeSO4·7H2ONa2-EDTA·2H2O有機(jī)物（MSIV）煙酸(Vpp)鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸肌醇（MSV）肌醇ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制母液名稱(chēng)藥品名稱(chēng)NH4NO3KMS母液配制：MSI 大量元素20X MSII 微量元素200X MSIII 鐵鹽 200X MSIV 有機(jī)物 200X MSV 肌醇 200X

激素 0.1mg/mlMS母液配制：MSⅠ(大量元素)配方用量mg/L20X（mg）稱(chēng)量1.NH4NO316503300033g2.KNO319003800038g3.CaCl2·2H2O44088008.8g4.MgSO4

·7H2O37074007.4g5.KH2PO417034003.4g將1、2、4、5稱(chēng)好放入燒杯分別溶解混合，將3最后混合，再定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用500mL甲1、2、4、5500mL乙3＋

定容貼標(biāo)簽1L

MSIX202013.9.26HXH注：Ca2+和S042-混合后易沉淀。MSⅠ(大量元素)配方用量mg/L20X（mg）稱(chēng)量1.NHMSⅡ(微量元素)配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)1.KI0.831660.1662.H3BO46.212401.243.MnSO4·4H2O22.344604.464.ZnSO4·7H2O8.617201.725.Na2MoO4·2H2O0.25500.056.CuSO4·5H2O0.02550.0057.CoCl2·6H2O0.02550.005將1～7稱(chēng)好放入燒杯分別溶解混合，定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用1000mL1～7

定容貼標(biāo)簽1L

MSIIX2002013.9.26HXHMSⅡ(微量元素)配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(gMSⅢ(鐵鹽)配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)1.FeSO4·7H2O27.855605.562.Na2·EDTA·2H2O37.374607.46將1稱(chēng)好放入燒杯甲溶解，將2放入燒杯乙溶解，再混合定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用1L500mL甲1500mL乙2＋混合定容貼標(biāo)簽

MSIX2002013.9.26HXHMSⅢ(鐵鹽)配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)1MSⅣ(有機(jī)物)配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)1.煙酸0.51000.12.鹽酸吡哆醇0.51000.13.鹽酸硫胺素0.1200.024.甘氨酸24000.4將1、2、3、4稱(chēng)好放入燒杯分別溶解混合，定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用1000mL1～4

定容貼標(biāo)簽1L

MSIVX2002013.9.26HXHMSⅣ(有機(jī)物)配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)MSⅤ配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)1.肌醇1002000020將肌醇稱(chēng)好放入燒杯溶解定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用1000mL1溶解定容貼標(biāo)簽1L

MSVX2002013.9.26HXHMSⅤ配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)1.肌醇10母液配制時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)：①母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存（4℃），用時(shí)再按比例稀釋。②其中III、IV、以及激素類(lèi)物質(zhì)應(yīng)以棕色瓶盛裝。③母液使用前搖動(dòng)瓶子，如有沉淀、絮狀物、微生物污染應(yīng)停止使用④取樣時(shí)移液管要對(duì)應(yīng)取樣，防止交叉污染母液配制時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)：化合物名稱(chēng)MS(1962)White(1943)N6(1974)B5(1968)Heller(1953)Nitsh(1972)Miller(1967)SH(1972)NH4NO31650

7201000

KNO319008028302527.5

95010002500(NH4)2SO4

463134

NaNO3

600

KCl

65

750

65

CaCl22H2O440

16615075166

200Ca(NO3)24H2O

300

347

MgSO47H2O370720185246.525018535400Na2SO4

200

KH2PO4170

400

68300

K2HPO4

300FeSO47H2O27.8

27.8

27.85

15Na2-EDTA37.3

37.3

37.75

20Na-Fe-EDTA

28

32

FeCl36H2O

1

Fe(SO4)3

2.5

MnSO44H2O22.374.4100.01254.4

ZnSO47H2O8.631.521101.5

Zn(螯合體)

0.03

10NiCl26H2O

1.0CoCl26H2O0.025

0.025

0.025

CuSO45H2O0.025

0.0250.03

AlCl3

0.03

MoO3

0.25

Na2MoO42H2O0.25

0.25

TiO2

0.81.0KI0.830.750.80.750.01101.65.0H3BO36.21.51.631

NaH2PO4H2O

16.5

150125

煙酸0.50.50.51

5.0鹽酸吡哆素（VB6）0.50.10.511.0

5.0鹽酸硫胺素（VB1）0.10.1110

0.5肌醇100

100

100

100甘氨酸232

蔗糖3000020000500002000020000200003000030000瓊脂10000100001000010000

pH值5.85.65.85.85.85.8

5.9化合物名稱(chēng)MSWhiteN6B5HellerNitshMil2、培養(yǎng)基的配制：MS＋BA2＋NAA0.2＋糖3.0％＋瓊脂0.7％pH=5.8

MS： MSI50ml MSII5ml MSIII5ml MSIV5ml MSV5ml BA： 20ml;NAA：2ml

糖： 30g;瓊脂：7gV貯備液用量＝V配制/濃縮倍數(shù)V激素貯備液＝C激素*V配制/0.1mg/ml2、培養(yǎng)基的配制：V貯備液用量＝V配制/濃縮倍數(shù)第二章培養(yǎng)基及其配制學(xué)時(shí)課件第二章培養(yǎng)基及其配制學(xué)時(shí)課件第二章

培養(yǎng)基及其配制講授：張麗瓊第二章培養(yǎng)基及其配制講授：張麗瓊第二章培養(yǎng)基及其配制學(xué)時(shí)課件培養(yǎng)基及其作用：是向植物細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)的場(chǎng)所。其作用是向植物細(xì)胞提供所需的各種營(yíng)養(yǎng)；調(diào)節(jié)滲透壓、酸堿度；供給水分。固體培養(yǎng)基還起著支撐作用。培養(yǎng)基及其作用：是向植物細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)的場(chǎng)所。其培養(yǎng)基的種類(lèi)培養(yǎng)基的成分及作用常用培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的配制

本章主要內(nèi)容培養(yǎng)基的種類(lèi)本章主要內(nèi)容◆培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基◆培養(yǎng)過(guò)程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基◆其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基

◆營(yíng)養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類(lèi)◆培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類(lèi)二、培養(yǎng)基的成分及作用

植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等點(diǎn)化學(xué)方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。二、培養(yǎng)基的成分及作用植物體內(nèi)至少含有幾十種其它添加物固化劑植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基組成無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分+有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分=基本培養(yǎng)基其它添加物固化劑植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營(yíng)養(yǎng)元素的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史。B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專(zhuān)一的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充該元素來(lái)預(yù)防和恢復(fù)。C、該元素在植物營(yíng)養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果。Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營(yíng)養(yǎng)元素國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素有16（17）種：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素有16（17）種：根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為※大量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S9種※微量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kg

Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl7種按照國(guó)際植物生理協(xié)會(huì)的建議：所需濃度>0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度<0.5mmol/L的元素為微量元素根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為按照國(guó)際植物生理協(xié)會(huì)的1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位置。供應(yīng)的氮化物有硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀等。有時(shí)，也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。

P是是生物膜、核苷酸（如ATP）、核酸的重要組成部分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K對(duì)碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCl、KNO3等鹽類(lèi)提供。1、大量元素Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO4·7H2O提供。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。常以CaCl2·2H2O提供。Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有2、微量元素

在微量元素中，鐵的作用最大：

◆一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成分。

◆葉綠素形成的必要條件

◆在制做培養(yǎng)基時(shí)常用FeSO4·7H2O和Ｎa2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物可防止鐵的沉淀。2、微量元素

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類(lèi)運(yùn)輸有著密切的關(guān)系

銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長(zhǎng)

錳參與植物的光合、呼吸代謝

鉬參與氮素的代謝

氯是光合作用水光解的活化劑微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。硼與蛋白質(zhì)合成、糖類(lèi)運(yùn)輸有著密切的關(guān)系這些整株植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)于植物組織培養(yǎng)來(lái)說(shuō)也是必需的。當(dāng)某些營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)。這些整株植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)

缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。桃樹(shù)

缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加缺銅癥狀：新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變成深褐色，引起落葉。枝頂端生長(zhǎng)不良，其下部的芽開(kāi)始生長(zhǎng)，形成叢生的細(xì)枝。菊花缺銅癥狀：菊花缺錳典型癥狀：葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開(kāi)始。菜豆缺錳典型癥狀：菜豆缺鉬典型癥狀：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。白菜缺鉬典型癥狀：白菜缺硼典型癥狀：受精不良,籽粒減少，“花而不實(shí)”，“蕾而不花”；根尖、莖尖的生長(zhǎng)點(diǎn)停止生長(zhǎng)，而形成簇生狀；常引起各種腐爛病。馬鈴薯缺硼典型癥狀：馬鈴薯3、有機(jī)化合物：培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱(chēng)為基本培養(yǎng)基。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長(zhǎng)。常加入的有機(jī)成分主要有以下幾類(lèi)：

(1)

碳水化合物：碳源物質(zhì)包括糖類(lèi)物質(zhì)、醇類(lèi)物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類(lèi)物質(zhì)最重要。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。糖類(lèi)物質(zhì)特點(diǎn)：

◆具有熱易變的性質(zhì)◆利于吸收和利用

◆使用濃度一般在2%—5%

◆提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓3、有機(jī)化合物：培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱(chēng)為基（2）維生素類(lèi)

◆以各種輔酶的形式存在

◆參與多種代謝活動(dòng)

◆對(duì)生長(zhǎng)，分化等有很好的促進(jìn)作用

◆主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素

◆常用維生素有VB1和VB6

VB1(鹽酸硫胺素)：對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用。

VB6(鹽酸吡哆醇)：能促進(jìn)根的生長(zhǎng)。

VPP(煙酸)：與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。

VC(抗壞血酸)：有防止組織變褐的作用。（2）維生素類(lèi)（3）肌醇又叫環(huán)己六醇，在糖類(lèi)的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。用于構(gòu)建細(xì)胞壁。參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動(dòng)。促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用。使用肌醇能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用。（3）肌醇（4）氨基酸

◆蛋白質(zhì)的組成成分

◆有機(jī)氮源

◆可直接被細(xì)胞吸收利用

◆培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸。有時(shí)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。（4）氨基酸（5）天然復(fù)合物

◆促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長(zhǎng)

◆成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。

◆天然營(yíng)養(yǎng)混合物，對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用。如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物①椰乳：它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用②香蕉：主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。③馬鈴薯：添加后可得到健壯的植株。④水解酪蛋白：為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸。⑤其它：酵母提取液、麥芽提取液等。（5）天然復(fù)合物4、培養(yǎng)材料的支持物（1）瓊脂在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。固體培養(yǎng)基利于組織置于培養(yǎng)基表面。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)?！羰鞘褂米钇毡榈哪虅粲昧恳话阍?—10g/L之間◆顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。4、培養(yǎng)材料的支持物（2）其它：有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)材料沒(méi)有影響或影響較小。（2）其它：有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害5、活性炭活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中分泌的酚、醌類(lèi)物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5－羥甲基糖醛?！粑脚囵B(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)

◆抑制外植體褐變

◆防止玻璃苗的產(chǎn)生

◆促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化

◆促進(jìn)生根缺點(diǎn)：

◆沒(méi)有選擇性活性炭5、活性炭活性炭莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于VC和半胱氨酸。在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長(zhǎng)?；钚蕴吭谏鶗r(shí)有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)。

莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化在使用活性炭時(shí)，要注意其吸附有害物質(zhì)和吸附生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的二重性，尤其是當(dāng)較高的活性炭足以能抵消生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的作用時(shí)，應(yīng)注意調(diào)整好活性炭與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物等培養(yǎng)基成分的用量，使其皆能發(fā)揮作用。在使用時(shí)要有其量的意識(shí)，使活性炭發(fā)揮其積極作用。

在使用活性炭時(shí)，要注意其吸附有害物質(zhì)和吸附生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的二重性6、抗生素抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20mg/l之間。添加抗生物質(zhì)可防止外植體內(nèi)生菌造成的污染。6、抗生素7、植物激素：在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。7、植物激素：在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)（1）生長(zhǎng)素類(lèi)：◆促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂

◆促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長(zhǎng)休眠、頂端優(yōu)勢(shì)、單性結(jié)實(shí)

◆誘導(dǎo)愈傷組織形成

◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好

◆常用的生長(zhǎng)素：

IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)（1）生長(zhǎng)素類(lèi)：IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，其活力較低,是生長(zhǎng)素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，NAA(萘乙酸)

在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比IAA高出3～4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。

IBA(吲哚丁酸)是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2,4-D（2,4－二氯苯氧乙酸）起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。NAA(萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能生長(zhǎng)素作用強(qiáng)弱順序：IAANAAIBA2,4-D強(qiáng)弱2，4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，IBA和NAA常用于生根生長(zhǎng)素作用強(qiáng)弱順序：IAANAAIBA2,4-D強(qiáng)弱2，4-

生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量95％酒精助溶。2,4-D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。生長(zhǎng)素常配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量95％酒精助溶（2）細(xì)胞分裂素類(lèi)這類(lèi)激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6－芐基氨基嘌呤)、Kt(激動(dòng)素)、ZT(玉米素)等。其中ZT活性最強(qiáng)，但非常昂貴。常用的是6-BA。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有以下作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)。誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。用于離體成花的調(diào)控。延緩組織的衰老并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成。

因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。

溶于0.5—1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中。（2）細(xì)胞分裂素類(lèi)（3）赤霉素類(lèi)和脫落酸

A、赤霉素類(lèi)

◆組織培養(yǎng)中不常使用

◆加速細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)

◆促進(jìn)細(xì)胞的分裂

◆主要是GA3

B、脫落酸

◆抑制細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)

◆促進(jìn)脫落和衰老

◆促進(jìn)休眠和提高抗逆能力（3）赤霉素類(lèi)和脫落酸赤霉素(GA)：培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于刺激在培養(yǎng)中形成的不定胚發(fā)育成小植株，促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。

赤霉素溶于酒精，配制時(shí)少量可用95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70～100％失效，應(yīng)當(dāng)采用過(guò)濾滅菌法加入。赤霉素(GA)：培養(yǎng)基中添加的是GA38、抗氧化物：植物組織在切割時(shí)會(huì)溢泌一些酚類(lèi)物質(zhì)，接觸空氣中的氧氣后，自動(dòng)氧化或由酶類(lèi)催化氧化為相應(yīng)的醌類(lèi)，產(chǎn)生可見(jiàn)的茶色、褐色以致黑色，這就是酚污染。這些物質(zhì)滲出細(xì)胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長(zhǎng)停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。8、抗氧化物：植物組織在切割時(shí)會(huì)溢泌一些酚類(lèi)物質(zhì)，接觸空氣中抗酚類(lèi)氧化常用的藥劑有半胱氨酸及Vc，可用50～200mg/l的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過(guò)濾滅菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。其它抗氧化劑有二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、抗壞血酸及二乙基二硫氨基甲酸酯等。抗酚類(lèi)氧化常用的藥劑有半胱氨酸及Vc，可用50～200mg/9、水作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是雙蒸水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。9、水三、常用培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)（一）幾種常用培養(yǎng)基的配方

組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基有：MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。三、常用培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)（一）幾種常用培養(yǎng)基的配方1、MS培養(yǎng)基

◆無(wú)機(jī)鹽濃度高◆高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽◆含有一定數(shù)量的銨鹽◆營(yíng)養(yǎng)豐富◆不需要添加更多的有機(jī)附加物（二）、幾種常見(jiàn)培養(yǎng)基的特點(diǎn)1、MS培養(yǎng)基（二）、幾種常見(jiàn)培養(yǎng)基的特點(diǎn)2、White培養(yǎng)基

◆1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)

◆

1963年作了改良，提高M(jìn)gSO4的濃度和增加硼元素

◆無(wú)機(jī)鹽濃度較低◆使用廣泛◆在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果2、White培養(yǎng)基3、B5培養(yǎng)基

◆1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)◆含有較低的銨鹽

◆較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素3、B5培養(yǎng)基4、N6培養(yǎng)基◆1974年朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)◆成分較簡(jiǎn)單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他禾谷類(lèi)植物的花粉和花藥培養(yǎng)。4、N6培養(yǎng)基AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出現(xiàn)濃度：1-10mg/L抗生素：種類(lèi)：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。作用：可防止外植體內(nèi)生菌污染。濃度：5—20mg/L。AgNO3:培養(yǎng)基＝基本培養(yǎng)基＋植物激素

培養(yǎng)基的選擇在實(shí)質(zhì)上講就是設(shè)計(jì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與激素（種類(lèi)、用量）的最佳組合。四、培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基＝基本培養(yǎng)基＋植物激素四、培養(yǎng)基的選擇篩選培養(yǎng)基常用的試驗(yàn)方法：

單因子試驗(yàn)

多因子試驗(yàn)

逐步添加和逐步排除試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基常用的試驗(yàn)方法：1、單因子試驗(yàn)只變動(dòng)一個(gè)因子，通過(guò)試驗(yàn)找出該因子的影響及影響程度。如：

MS+BA2+NAA

（0.1、0.5、1.0mg/L）

MS+BA+NAA0.1（1.0、2.0、3.0mg/L）不能反映各種單因子成分之間的組合效果與相互影響

1、單因子試驗(yàn)2、多因子試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱(chēng)為多因子實(shí)驗(yàn)。

2、多因子試驗(yàn)2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合（單位：mg/L）

例如研究NAA和BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處理的完全試驗(yàn)。BA00.52.5510NAA0123450.56789102.511121314155.016171819201021222324252種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合（單位：mg/L）例如研究N3、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法：成功前-逐步添加（各種營(yíng)養(yǎng)成分）實(shí)驗(yàn)成功成功后-逐步排除（減少各種成分）縮小范圍在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)單方法。3、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法：科學(xué)安排研究順序

１.定基本培養(yǎng)基，激動(dòng)素２.改良基本培養(yǎng)基３.調(diào)整蔗糖、瓊脂用量４.改變pH值５.探討培養(yǎng)的環(huán)境條件科學(xué)安排研究順序１.定基本培養(yǎng)基，激動(dòng)素1、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:①保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性②配制時(shí)的快速移取③便于低溫保藏。五、

培養(yǎng)基的配制1、母液(stocksolution)的配制和保存五、單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml?；炫浞ǎ簩最?lèi)營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱(chēng)量，分別溶解后再混合成母液。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類(lèi)等，一般配成比所需濃度高10～100倍的母液。

母液的配制方法：?jiǎn)闻浞ǎ簩⑴囵B(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般配制培養(yǎng)基時(shí)，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即配成：大量元素10倍液，定容至1000ml；微量元素100倍液，定容至1000ml；鐵鹽100倍液，定容至1000ml；維生素1mg/l，定容至100ml；激素1mg/l，定容至50～100ml。配制培養(yǎng)基時(shí)，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即配成：

配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ｃa2＋和SO42－，Ｃa2＋、Ｍg2＋和PO43－一起溶解后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時(shí)要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純。藥品的稱(chēng)量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如

一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類(lèi)可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、

ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制母液名稱(chēng)藥品名稱(chēng)

大量元素（MSI）

NH4NO3KNO3CaCl·2H2OMgSO4·7H2OKH2PO4微量元素（MSII）MnSO4·H2OZnSO4·7H2OCoCl·6H2OCuSO4·5H2OH3BO3Na2MO4·2H2OKI鐵鹽（MSIII）FeSO4·7H2ONa2-EDTA·2H2O有機(jī)物（MSIV）煙酸(Vpp)鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸肌醇（MSV）肌醇ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制母液名稱(chēng)藥品名稱(chēng)NH4NO3KMS母液配制：MSI 大量元素20X MSII 微量元素200X MSIII 鐵鹽 200X MSIV 有機(jī)物 200X MSV 肌醇 200X

激素 0.1mg/mlMS母液配制：MSⅠ(大量元素)配方用量mg/L20X（mg）稱(chēng)量1.NH4NO316503300033g2.KNO319003800038g3.CaCl2·2H2O44088008.8g4.MgSO4

·7H2O37074007.4g5.KH2PO417034003.4g將1、2、4、5稱(chēng)好放入燒杯分別溶解混合，將3最后混合，再定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用500mL甲1、2、4、5500mL乙3＋

定容貼標(biāo)簽1L

MSIX202013.9.26HXH注：Ca2+和S042-混合后易沉淀。MSⅠ(大量元素)配方用量mg/L20X（mg）稱(chēng)量1.NHMSⅡ(微量元素)配方用量mg/L200X（mg）稱(chēng)量(g)1.KI0.831660.1662.H3BO46.212401.243.MnSO4·4H2O22.344604.464.ZnSO4·7H2O8.617201.725.Na2MoO4·2H2O0.25500.056.CuSO4·5H2O0.02550.0057.CoCl2·6H2O0.02550.005將1～7稱(chēng)好放入燒杯分別溶解混合，定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用1000mL1