蛋白質(zhì)工程課件

第二專題第三章蛋白質(zhì)工程

第二專題1

引言

1978年，美國Hutchison用寡脫氧核糖核苷酸作體外誘變劑，成功地實(shí)現(xiàn)了定位突變試驗(yàn)，培育出多種具有生物學(xué)特性的突變株。1981年，美國Gene公司厄爾默(K．U1mer)將此定位突變試驗(yàn)冠以“蛋白質(zhì)工程”。經(jīng)過多年的發(fā)展，蛋白質(zhì)工程已經(jīng)成為生命科學(xué)中的一個重要分支。

引言2

蛋白質(zhì)工程的定義：通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動力學(xué)的研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等方面的信息，在此基礎(chǔ)上對編碼該蛋白的基因進(jìn)行有目的的設(shè)計(jì)改造，并通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終將其投入實(shí)際應(yīng)用。蛋白質(zhì)工程是在基因重組技術(shù)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)之上，融合了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動力學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等多學(xué)科而發(fā)展起來的新興研究領(lǐng)域。蛋白質(zhì)工程的定義：通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)3

蛋白質(zhì)工程內(nèi)容主要有兩個方面：（1）根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；（2）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新蛋白質(zhì)，這也是蛋白質(zhì)工程最根本的目標(biāo)之一。蛋白質(zhì)工程內(nèi)容主要有兩個方面：（1）根據(jù)需要合成4第一節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。一、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)有4個嚴(yán)格的層次，即蛋白質(zhì)的一級至四級結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）是指多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序。

第一節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析5圖3-1胰島素一級結(jié)構(gòu)及不同動物胰島素A鏈的差異圖3-1胰島素一級結(jié)構(gòu)及不同動物胰島素A鏈的差異6線性多肽鏈在空間折疊成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)或構(gòu)象。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)包括：二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）是指多肽鏈主鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象），主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等幾種形式(見圖3-2至圖3-4)。線性多肽鏈在空間折疊成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)7圖3-2四種不同的α-螺旋圖3-2四種不同的α-螺旋8圖3-3反向β-折疊圖3-3反向β-折疊9圖3-4RNase的某些二級結(jié)構(gòu)α-螺旋無規(guī)卷曲β-轉(zhuǎn)角β-折疊圖3-4RNase的某些二級結(jié)構(gòu)α-螺旋無規(guī)卷曲β-轉(zhuǎn)角10

超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）和結(jié)構(gòu)域（domain）是介于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間的空間結(jié)構(gòu)。

超二級結(jié)構(gòu)是指相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，排列形成規(guī)則的、在空間結(jié)構(gòu)上能夠辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體，并充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件（blockbuilding），其基本形式有αα、βαβ和βββ等(見圖3-5至圖3-7)。超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystruc11圖3-5細(xì)胞色素C的αα結(jié)構(gòu)圖3-6纖溶酶原的βββ結(jié)構(gòu)圖3-5細(xì)胞色素C的αα結(jié)構(gòu)圖3-6纖溶酶原12圖3-7細(xì)胞核抗原的βαβ結(jié)構(gòu)圖3-7細(xì)胞核抗原的βαβ結(jié)構(gòu)13

結(jié)構(gòu)域是在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的，通常由50-300個氨基酸殘基組成，其特點(diǎn)是在三維空間可以明顯區(qū)分和相對獨(dú)立，并且具有一定的生物學(xué)功能。

模體或基序（motif）是結(jié)構(gòu)域的亞單位，通常由2～3個二級結(jié)構(gòu)單位組成，一般為α螺旋、β折疊和環(huán)（loop）(見圖3-8)。較大的蛋白質(zhì)分子一般含有兩個以上的結(jié)構(gòu)域，其間以柔性的鉸鏈（hinge）相連，以便相對運(yùn)動。結(jié)構(gòu)域是在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的，通常由50-3014圖3-8Zn2+模體圖3-8Zn2+模體15

三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）是指整條多肽鏈的三維結(jié)構(gòu)，包括骨架和側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排列。如果蛋白質(zhì)分子僅由一條多肽鏈組成，三級結(jié)構(gòu)就是它的最高結(jié)構(gòu)層次（見圖3-9）。三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）是指16圖3-9胰島素的三級結(jié)構(gòu)圖3-9胰島素的三級結(jié)構(gòu)17

四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）是指在亞基和亞基之間通過疏水作用等次級鍵結(jié)合成為有序排列的特定的空間結(jié)構(gòu)。

亞基通常由一條多肽鏈組成，有時(shí)含兩條以上的多肽鏈，單獨(dú)存在時(shí)一般沒有生物活性（見圖3-10）。四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）18圖3-10血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)圖3-10血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)19二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定1.一級結(jié)構(gòu)測定

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定又稱蛋白質(zhì)順序分析，其基本方法是：（1）應(yīng)用化學(xué)裂解法和蛋白酶水解法將多肽鏈專一性裂解；（2）逐一測定每個純化的小肽段的順序；（3）根據(jù)肽段氨基酸順序中的重疊區(qū)確定小肽段的排列次序；（4）完成整條多肽鏈的順序分析。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定20盡管蛋白質(zhì)順序分析已經(jīng)自動化，但仍然耗時(shí)、復(fù)雜并且昂貴。

重組DNA技術(shù)出現(xiàn)后，人們可以從cDNA或基因序列直接推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸順序，速度快且經(jīng)濟(jì)，已成為最常用的測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的方法。盡管蛋白質(zhì)順序分析已經(jīng)自動化，但仍然耗時(shí)、復(fù)雜并且昂212.蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定根據(jù)蛋白質(zhì)的狀態(tài)，測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法分為兩大類：（1）應(yīng)用X射線晶體衍射圖譜法和中子衍射法測定晶體中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象；（2）應(yīng)用核磁共振法（NMR）、園二色性光譜法、激光拉曼光譜法、熒光光譜法、紫外差光譜法和氫同位素交換法等測定溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象。2.蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定22利用X射線晶體衍射法測定蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，結(jié)果比較可靠。但是，與溶液中的構(gòu)象相比，蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象是靜態(tài)的。所以，利用蛋白質(zhì)晶體不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象。而且，很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大單晶。另外，X射線晶體衍射的工作流程較長（見圖3-11）。利用X射線晶體衍射法測定蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，結(jié)果比較可23圖3-11X射線晶體衍射的基本原理圖3-11X射線晶體衍射的基本原理24

核磁共振（縮寫NMR）是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用下，核自旋能級發(fā)生塞曼分裂(Zeemansplitting)，共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過程。近年來，NMR法測定小蛋白的三維結(jié)構(gòu)得到了成功的應(yīng)用。NMR法不需要制備蛋白質(zhì)晶體，但這種方法僅限于分析長度不超過150個氨基酸殘基的小蛋白（見圖3-12）。核磁共振（縮寫NMR）是指核磁矩不為零的核，在外磁場25圖3-12NMR測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基本過程圖3-12NMR測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基本過程26第二節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)很大程度上決定了蛋白質(zhì)的功能，因此如何獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并對之基序分析研究是現(xiàn)代分子生物學(xué)的重要課題。目前應(yīng)用X射線晶體衍射法和NMR法已測定出1萬多種蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，但與已測得的30多萬蛋白質(zhì)序列相比，還有很大的差距，大大地影響了人們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究。第二節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測27因此發(fā)展一種不依賴實(shí)驗(yàn)而又有一定準(zhǔn)確性的理論蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法顯得格外重要，近年來在這個方面取得了很多重要的成果。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理論預(yù)測方法都是建立在氨基酸的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的理論基礎(chǔ)上，大致分為以下三類。因此發(fā)展一種不依賴實(shí)驗(yàn)而又有一定準(zhǔn)確性的理論蛋28一、比較建模法(comparativemodelingmethod)

比較建模法是基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)知識的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，又稱為同源結(jié)構(gòu)預(yù)測，是根據(jù)大量已知的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)來預(yù)測序列已知而結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

一、比較建模法(comparativemodelingm29按照目前的定義，若模型構(gòu)建蛋白質(zhì)的序列與模板序列經(jīng)比對（alignment）后,序列同源性（sequenceidentity）在40%（也有人認(rèn)為在35%）以上，則它們的結(jié)構(gòu)可能屬于同一家族，它們是同源蛋白（homology），可以用同源蛋白模型構(gòu)建的方法預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)。因?yàn)樗鼈兛赡苁怯赏环N蛋白質(zhì)分化而來，它們具有相似的空間結(jié)構(gòu)，相同或相近的功能。按照目前的定義，若模型構(gòu)建蛋白質(zhì)的序列與模板序列經(jīng)比30因此，若知道了同源蛋白家族中某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，就可以預(yù)測其它一些序列已知而結(jié)構(gòu)未知的同源蛋白的結(jié)構(gòu)，可以用同源模型構(gòu)建的方法預(yù)測未知蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此，若知道了同源蛋白家族中某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，31同源蛋白模型構(gòu)建（模建）的步驟：1.目標(biāo)蛋白序列與目標(biāo)序列的匹配應(yīng)用FASTA或BLAST搜索軟件，在PIR、SWISSPROT或GENEBANK等序列庫中按序列同源性挑選出一些同源性比較高的序列，然后把挑選出的序列與目標(biāo)序列基序多重匹配，得到模板結(jié)構(gòu)等價(jià)位點(diǎn)套的初始集合。同源蛋白模型構(gòu)建（模建）的步驟：322.根據(jù)模板結(jié)構(gòu)構(gòu)建目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)模型在已確定的模板結(jié)構(gòu)等價(jià)位點(diǎn)套的初始集合基礎(chǔ)上，旋轉(zhuǎn)每一個模板的結(jié)構(gòu)，使它們相互間的位置盡可能多地重疊在一起。不同兩個模板在空間中若符合一定的重疊距離標(biāo)準(zhǔn)，那它們相互之間的關(guān)系就是等價(jià)位點(diǎn)。許多這樣的等價(jià)位點(diǎn)構(gòu)成了等價(jià)位點(diǎn)套。2.根據(jù)模板結(jié)構(gòu)構(gòu)建目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)模型33疊合結(jié)束后，即得到了同源蛋白的結(jié)構(gòu)保守區(qū)（SCRs），以及相應(yīng)的基架結(jié)構(gòu)。模板結(jié)構(gòu)匹配后，一般還要用得到的同源體SCRs的第一條序列與目標(biāo)序列匹配，挑選出目標(biāo)序列上的高相擬區(qū)，定義為目標(biāo)蛋白的SCRs。

Homology、UQANTA/CHARM、COMPOSER和Collarextension等軟件和方法可以用于目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建。疊合結(jié)束后，即得到了同源蛋白的結(jié)構(gòu)保守區(qū)（SCRs）343.對模建結(jié)構(gòu)基序優(yōu)化和評估同源結(jié)構(gòu)模建（預(yù)測）得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，通常含有一些不合理的原子間接觸，需要對模型進(jìn)行分子力學(xué)和分子動力學(xué)優(yōu)化，消除模型中不合理的接觸。另外，模型中有些鍵長、鍵角和二面角也有可能不合理，也需要檢查評估。PROCHECK和PROSAII等軟件常用于完成這類工作。3.對模建結(jié)構(gòu)基序優(yōu)化和評估35二．反向折疊法

反向折疊法是近年來發(fā)展起來的一種比較新的方法。它可以應(yīng)用到?jīng)]有同源結(jié)構(gòu)的情況中，且不需要預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，即直接預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，從而可以繞過現(xiàn)階段二級結(jié)構(gòu)預(yù)測準(zhǔn)確性不超過65%的限度，是一種有潛力的預(yù)測方法。二．反向折疊法36

反向折疊法的主要原理是把未知蛋白的序列和已知的結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配，找出一種或幾種匹配最好的結(jié)構(gòu)作為未知蛋白質(zhì)的預(yù)測結(jié)構(gòu)。

它的實(shí)現(xiàn)過程是總結(jié)出已知獨(dú)立的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模式做為未知結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配的模板，然后用經(jīng)過對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫的學(xué)習(xí)，總結(jié)出的可以區(qū)分正誤結(jié)構(gòu)的平均勢函數(shù)（MeanForceField），做為判別標(biāo)準(zhǔn)來選擇出最佳匹配方式。反向折疊法的主要原理是把未知蛋白的序列和已知的結(jié)構(gòu)進(jìn)37

這種方法的局限性在于它假設(shè)蛋白質(zhì)折疊類型是有限的，所以只有未知蛋白質(zhì)和已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相像的時(shí)候，才有可能預(yù)測出未知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。如未知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是現(xiàn)在還沒有出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)類型時(shí)，這種方法將不能被應(yīng)用。這種方法的局限性在于它假設(shè)蛋白質(zhì)折疊類型是有限38三．從頭預(yù)測法

從理論上說，從頭預(yù)測法是最為理想的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法。它要求方法本身可以只根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列來預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，但現(xiàn)在還不能完全得到這個要求。三．從頭預(yù)測法39從頭預(yù)測可以細(xì)分為：二級結(jié)構(gòu)預(yù)測首先從一級結(jié)構(gòu)預(yù)測出二級結(jié)構(gòu)，然后再把二級結(jié)構(gòu)堆積成三維結(jié)構(gòu)。由于目前對二級結(jié)構(gòu)中氨基酸的中遠(yuǎn)程相互作用不完全清楚，因此預(yù)測準(zhǔn)確率一般在65%以下。如果具有多種蛋白質(zhì)同源序列的三維結(jié)構(gòu)，在多重序列匹配比較的情況下，預(yù)測的準(zhǔn)確性可以達(dá)到88%以上。從頭預(yù)測可以細(xì)分為：40

Barton和Sander等人發(fā)現(xiàn)，在一個蛋白質(zhì)序列中總有約40%序列的預(yù)測可以有很好的可信度，其預(yù)測的準(zhǔn)確性都在80%以上。這些區(qū)域都是一些二級結(jié)構(gòu)序列比較保守的部分。這些結(jié)果給如何將現(xiàn)有二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果應(yīng)用到三維結(jié)構(gòu)預(yù)測提供了有益的啟示。Barton和Sander等人發(fā)現(xiàn)，在一個蛋白質(zhì)序列412.超二級結(jié)構(gòu)預(yù)測實(shí)際上是局部的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，主要應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法和向量投影方法，從蛋白質(zhì)序列出發(fā)，直接預(yù)測蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)，觀察此段氨基酸序列是否能形成某一種模式的超二級結(jié)構(gòu)。其中人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法預(yù)測的準(zhǔn)確率在75%～82%，向量投影方法預(yù)測的準(zhǔn)確率達(dá)到85%以上。2.超二級結(jié)構(gòu)預(yù)測423.結(jié)構(gòu)類型（structureclass）預(yù)測

該方法是預(yù)測未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)屬于何種類型，如全α類蛋白質(zhì)（主要由α-螺旋組成）、全β類蛋白質(zhì)（主要由β-折疊組成）、α/β類蛋白質(zhì)（由α-螺旋和β-折疊交替排列）或α＋β類蛋白質(zhì)（由分開的α-螺旋和β-折疊組成，其中β-折疊一般為平行結(jié)構(gòu)）。

3.結(jié)構(gòu)類型（structureclass）預(yù)測43

結(jié)構(gòu)類型預(yù)測除能了解大概的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊情況外，對二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測也有幫助。

方法主要有光譜數(shù)據(jù)預(yù)測、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測和Mahalanobis距離預(yù)測等，后者的準(zhǔn)確率較前兩者為高，可達(dá)94.7%。結(jié)構(gòu)類型預(yù)測除能了解大概的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊情況外，對二444.三維結(jié)構(gòu)預(yù)測是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的最終目標(biāo)。主要有兩個方面：（1）根據(jù)二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)類型和折疊類型預(yù)測的結(jié)果，結(jié)合結(jié)構(gòu)間的立體化學(xué)性質(zhì)、親疏水性質(zhì)、氫鍵以及靜電相互作用，把可信度較高的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步組裝，搭建出最后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由于該方法主要依賴于前面的預(yù)測結(jié)果，所以受到的限制很多。4.三維結(jié)構(gòu)預(yù)測45（2）不依賴二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，直接預(yù)測三維結(jié)構(gòu)。主要方法是有效收集構(gòu)象空間和區(qū)分天然結(jié)構(gòu)和錯誤結(jié)構(gòu)。根據(jù)對天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測一定氨基酸序列的肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。（2）不依賴二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，直接預(yù)測三維結(jié)構(gòu)。主要方法是46通過基因重組等實(shí)驗(yàn)可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；也可以通過分子動力學(xué)、分子熱力學(xué)等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時(shí)存在兩個原子等基本原則分析計(jì)算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，但可預(yù)見將來能建立一套完整的理論來解釋結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，用以設(shè)計(jì)、預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。通過基因重組等實(shí)驗(yàn)可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之47第三節(jié)蛋白質(zhì)的創(chuàng)造和改造

蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)是蛋白質(zhì)工程的一個重要方面。

設(shè)計(jì)分成三類：一是小范圍改造，就是對已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個殘基的替換，來研究和改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能；二是較大程度的改造，是對來源于不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝，期望轉(zhuǎn)移相應(yīng)的功能；三是蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)。

第三節(jié)蛋白質(zhì)的創(chuàng)造和改造48

所謂蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)就是給定一個目標(biāo)三維結(jié)構(gòu)，要求找出與已知順序無明顯同源，能折疊成目標(biāo)結(jié)構(gòu)的氨基酸順序來。

蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測恰恰相反，后者是從順序出發(fā)，預(yù)測其所折疊成的三維結(jié)構(gòu)。所謂蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)就是給定一個目標(biāo)三維結(jié)構(gòu)，49一、定點(diǎn)突變蛋白質(zhì)中的氨基酸是由基因中的三聯(lián)密碼決定的，只要改變其中的一個或兩個就可以改變氨基酸。通常是改變某個位置的氨基酸，以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或催化特性。例如將t-PAAsn117替換為Glu117，從而除去一個原有的糖基化位點(diǎn)。由于該處原有的糖鏈能促進(jìn)t-PA從血漿清除，因此點(diǎn)突變后能夠降低t-PA的血漿清除率，延長血漿半衰期。一、定點(diǎn)突變50二、盒式突變

1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)—盒式突變，一次可以在一個位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析。利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側(cè)添加兩個原載體和基因上沒有的內(nèi)切酶切點(diǎn)，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。二、盒式突變51三、蛋白質(zhì)融合將編碼一種蛋白的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新融合蛋白。這種方法可以將不同蛋白質(zhì)的特性集中在一種蛋白質(zhì)上，顯著地改變蛋白質(zhì)的特性?，F(xiàn)在研究較多的所謂“嵌合抗體”和“人源化抗體”等，就是采用的這種方法。三、蛋白質(zhì)融合52四、蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計(jì)成功地從頭設(shè)計(jì)一個蛋白質(zhì)或活性位點(diǎn)需要正確理解所有有關(guān)的相互作用，理論的正確與否與設(shè)計(jì)成功與否直接相關(guān)。由于設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)是由一個算法采用一組描述相互作用的參數(shù)而產(chǎn)生，因此在設(shè)計(jì)參數(shù)和蛋白質(zhì)特性之間可以建立直接的實(shí)驗(yàn)聯(lián)系。四、蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計(jì)531．設(shè)計(jì)策略設(shè)計(jì)的一般策略是“設(shè)計(jì)循環(huán)”,是理論設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證交互進(jìn)行，逐步發(fā)展。

首先由一個算法，基于某些理論和研究結(jié)果，設(shè)計(jì)出初始分子模型；然后實(shí)際構(gòu)建這個分子，用各種手段分析它，尋找成功或失敗或不理想的原因，接著修改算法、參數(shù)、理論基礎(chǔ)、改進(jìn)模型，進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，如此循環(huán)反復(fù)。在這個過程中，復(fù)雜程度漸進(jìn)提高，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的理解也逐漸深刻豐富起來。1．設(shè)計(jì)策略542.考慮因素具體設(shè)計(jì)中要考慮的因素較多，例如要正確選擇二級結(jié)構(gòu)傾向性的殘基，正確布置適應(yīng)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的“二元模式”(Binarypattern)，正確選擇轉(zhuǎn)角、帽結(jié)構(gòu)以連接和終止螺旋，正確選擇適應(yīng)于堆積核心的疏水側(cè)鏈，另外還可以導(dǎo)入內(nèi)部的極性作用。主要有二元模式、二級結(jié)構(gòu)傾向性、互補(bǔ)堆積（complementarypacking）等。2.考慮因素55

所謂二元模式指的是氨基酸的親疏水性在編碼結(jié)構(gòu)中的作用。對殘基的親疏水性的考慮幾乎是設(shè)計(jì)中的唯一標(biāo)準(zhǔn)，是最重要的因素。天然蛋白質(zhì)折疊時(shí)總是盡可能將疏水殘基埋進(jìn)內(nèi)部，而將親水殘基暴露在表面。

二元模式的作用可能主要在二級結(jié)構(gòu)上發(fā)揮出來，二級結(jié)構(gòu)是具有周期性的，沿主鏈殘基的親疏水性也是有周期性的，并與二級結(jié)構(gòu)相適應(yīng)。所謂二元模式指的是氨基酸的親疏水性在編碼結(jié)構(gòu)中的作用56對已知結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)分析表明，各種氨基酸在不同的二級結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的頻率是不同的，就是說各種氨基酸形成不同二級結(jié)構(gòu)的傾向性是不同的，這就是所謂的二級結(jié)構(gòu)傾向性。設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)將合適的氨基酸安排在其傾向的二級結(jié)構(gòu)中。特定的序列還可以成為某種二級結(jié)構(gòu)的起始或終止信號。

對已知結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)分析表明，各種氨基酸在不同的二57設(shè)計(jì)中還要考慮到“互補(bǔ)堆積”。天然蛋白質(zhì)的核心中的側(cè)鏈相互鑲嵌地堆積在一起，幾乎不留出什么空間，這種作用既使疏水作用盡量的大，又不致于引起擁擠，這就是互補(bǔ)堆積。所以，對側(cè)鏈的大小外形都是有一定要求的。盡管大多數(shù)極性側(cè)鏈都是暴露在表面，而內(nèi)部還有一些極性側(cè)鏈構(gòu)成鹽橋或氫鍵網(wǎng)絡(luò)。這些內(nèi)部的鹽橋或氫鍵網(wǎng)絡(luò)并不是使蛋白質(zhì)穩(wěn)定而是建立了一種構(gòu)象特異性。設(shè)計(jì)中還要考慮到“互補(bǔ)堆積”。天然蛋白質(zhì)的核心58對已知結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部的極性殘基比在表面的極性殘基要保守得多。不少成功的設(shè)計(jì)工作都是內(nèi)部引入了有限的幾個極性殘基。成功的設(shè)計(jì)需要仔細(xì)地考慮各種因素，但是目前人們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并沒有完全理解，每一條經(jīng)驗(yàn)規(guī)律都存在著許多例外情況，所以有人也認(rèn)為過細(xì)的考慮純屬多慮了。對已知結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部的極性殘基比在表593.設(shè)計(jì)方法目前所有的算法都基于一種思路，首先選擇某種主鏈骨架作為目標(biāo)結(jié)構(gòu)，隨后固定骨架，尋找能夠折疊成這種結(jié)構(gòu)的氨基酸組合。這是蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)具體步驟的主要兩步，就是所謂“逆折疊”(inversefolding)方法。尋找目標(biāo)組合的直接想法是窮舉法，檢查合適大小范圍內(nèi)的每種組合，選出正確的組合。但實(shí)際上即使對設(shè)計(jì)一個小肽，窮舉法也幾乎是不可能的。3.設(shè)計(jì)方法60一條特定的肽鏈所能采取的構(gòu)象數(shù)目是極其巨大的。以相對較小的100個殘基的肽鏈為例，由20個天然氨基酸組成，就有20100(大于10130)種可能性，如果每種可能合成一個分子，把這些分子放到一個盒子里，這個盒子會比數(shù)個宇宙還大！更何況每個殘基位置上都可能有許多轉(zhuǎn)子，這個組合數(shù)就太大了。

解決辦法是先考慮“二元模式”和氨基酸的二級結(jié)構(gòu)傾向性，各個位置上不是每個氨基酸都適合的，考慮到這些特性后，每個位置上就只有不多的氨基酸需要進(jìn)一步檢驗(yàn)了。一條特定的肽鏈所能采取的構(gòu)象數(shù)目是極其巨大的。以相對614.設(shè)計(jì)實(shí)例長期以來，設(shè)計(jì)目標(biāo)都是一些結(jié)構(gòu)簡單、規(guī)律明顯的分子。最著名的是四螺旋捆結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)可以作為一個獨(dú)立的折疊單位，易于獨(dú)立研究。

Degrado等應(yīng)用“設(shè)計(jì)循環(huán)”的策略，在1986年完成了一個四聚體螺旋捆，每個單體為16殘基，這個序列僅使用Leu作為疏水殘基，放在螺旋的內(nèi)側(cè)，用Lys或Glu作為極性殘基，置于螺旋的外側(cè)，每個螺旋用Gly（螺旋終結(jié)者）結(jié)束，而Gly又為將來加環(huán)區(qū)埋下了伏筆。4.設(shè)計(jì)實(shí)例62

此后，研究者在兩個反平行的螺旋間加了環(huán)區(qū)，并根據(jù)第一步的結(jié)果對螺旋進(jìn)行了一些修改。環(huán)區(qū)開始是用單個Pro與兩個螺旋的終結(jié)者Gly構(gòu)成Gly-Pro-Arg-Gly的連接區(qū)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物成了三聚體（含6個螺旋）而不是期望的二聚體（4個螺旋），后來將連接的環(huán)區(qū)改成Gly-Pro-Arg-Arg-Gly才得到二聚體。此后，研究者在兩個反平行的螺旋間加了環(huán)區(qū)，并根據(jù)第一63

第三步，在二聚體之間加了第三個連接體，用的仍是Pro-Arg-Arg，這個肽共74個殘基。最后，他們合成了該多肽的基因，在E.coli中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。這項(xiàng)工作被譽(yù)為蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的里程碑。后來Richardson等也設(shè)計(jì)了四螺旋捆，稱為Felix（意為fourhelix），79個殘基，由非重復(fù)序列組成，并在1～4螺旋間加了一個二硫鍵。第三步，在二聚體之間加了第三個連接體，用的仍是Pro64設(shè)計(jì)目標(biāo)除了α-螺旋外還有β-折疊。β

-折疊比α-螺旋要困難一些，后者主要靠局域性的氫鍵就可以設(shè)計(jì)出來，而前者卻涉及了序列上靠近或不靠近的不同股之間的氫鍵。著名的是Betabellin（Betabarrelbellshapedprotein），是由前后兩個β－折疊組成，每個折疊由四股組成。隨著理論和技術(shù)的發(fā)展，人們又把目標(biāo)瞄向α/β混合蛋白質(zhì)，以及進(jìn)一步優(yōu)化已經(jīng)成功的結(jié)果和將設(shè)計(jì)工作自動化。設(shè)計(jì)目標(biāo)除了α-螺旋外還有β-折疊。β-折疊比α65最近成功的例子是Dahiyat和Mayo等完成的自動化蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)。這是一個ββα鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，共28個殘基，結(jié)構(gòu)中同時(shí)包含了α－螺旋、β－折疊以及轉(zhuǎn)角，全部使用天然氨基酸，其重要意義在于這是第一個全自動設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。除了努力達(dá)到設(shè)計(jì)出具有目標(biāo)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)外，人們更希望設(shè)計(jì)出有目標(biāo)功能的蛋白質(zhì)。最近成功的例子是Dahiyat和Mayo等完成的自動66Hecht等最近成功地應(yīng)用二元模式設(shè)計(jì)出了具有血紅素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)這個領(lǐng)域還有許多挑戰(zhàn)性的問題，如β－折疊蛋白質(zhì)、α/β交替蛋白的設(shè)計(jì)還有困難，即使對α-螺旋蛋白而言，要設(shè)計(jì)各種性能都和天然蛋白質(zhì)一樣仍然是個問題。Hecht等最近成功地應(yīng)用二元模式設(shè)計(jì)出了具有血紅素67序列組合中只有極少數(shù)序列能形成精確的結(jié)構(gòu)、高水平的活性，要設(shè)計(jì)出這樣的分子無疑是個難度更高的課題。但無論如何，在過去10年中，人們已經(jīng)從一個只能從天然有機(jī)體中提取蛋白質(zhì)的時(shí)代走到了一個蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)成為新期刊和專題研討會的焦點(diǎn)的時(shí)代。序列組合中只有極少數(shù)序列能形成精確的結(jié)構(gòu)、高水平的活68第四節(jié)蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用一、提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

葡萄糖異構(gòu)酶(GI)在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，朱國萍等人在確定第138位甘氨酸(G1y138)為目標(biāo)氨基酸后，對GI基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，以脯氨酸(Pro138)替代G1y138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍，最適反應(yīng)溫度提高10-12℃，酶比活相同。第四節(jié)蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用69據(jù)分析，Pro替代G1y138后，可能由于引入了一個吡咯環(huán)，該側(cè)鏈剛好能夠填充于GIyl38附近的空洞，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。據(jù)分析，Pro替代G1y138后，可能由于引入了一個70二、融合蛋白質(zhì)腦啡肽(Enk)N端5肽線性結(jié)構(gòu)是δ型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細(xì)胞因子。黎孟楓等人化學(xué)合成了EnkN端5肽編碼區(qū)，通過一連接3肽編碼區(qū)與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。

二、融合蛋白質(zhì)71以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H-胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過Naloxone競爭阻斷實(shí)驗(yàn)證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H72三、蛋白質(zhì)活性的改變通常飯后30－60分鐘，人血液中胰島素的含量達(dá)到高峰，120－180分鐘內(nèi)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。而目前臨床上使用的胰島素制劑注射后120分鐘后才出現(xiàn)高峰且持續(xù)180－240分鐘，與人生理狀況不符。實(shí)驗(yàn)表明胰島素在高濃度（大于10－5mol/L）時(shí)以二聚體形式存在，低濃度（小于10－9mol/L）時(shí)主要以單體形式存在。設(shè)計(jì)速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。三、蛋白質(zhì)活性的改變73類胰島素生長因子－1（IGF－1）的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島素具有高度的同源性和三維結(jié)構(gòu)的相似性，但I(xiàn)GF－1不形成二聚體。IGF－1的B結(jié)構(gòu)域（與胰島素B鏈相對應(yīng)）中B28－B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28－B29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過臨床實(shí)驗(yàn)。類胰島素生長因子－1（IGF－1）的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島74四、治癌酶的改造癌癥的基因治療分二個方面：藥物作用于癌細(xì)胞，特異性地抑制或殺死癌細(xì)胞；藥物保護(hù)正常細(xì)胞免受化學(xué)藥物的侵害，可以提高化學(xué)治療的劑量。

皰疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它結(jié)構(gòu)類似物如GANCICLOVIR和ACYCLOVIR無環(huán)鳥苷磷酸化。GANCICLOVIR和ACYCLOVIR缺少3`端羥基，就可以終止DNA的合成，從而殺死癌細(xì)胞。四、治癌酶的改造75HSV-TK催化GANCICLOVIR和ACYCLOVIR的能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機(jī)突變中篩選出一種，在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力分別提高43和20倍。O6-烷基-鳥嘌呤是DNA經(jīng)烷化劑（包括化療用亞硝基藥物）處理以后形成的主要誘變劑和細(xì)胞毒素，所以這些亞硝基藥物的使用劑量受到限制。HSV-TK催化GANCICLOVIR和ACYCLO7606-烷基-鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT）能夠?qū)ⅧB嘌呤06上的烷基去除掉，起到保護(hù)作用。通過反向病毒轉(zhuǎn)染，人類AGT在鼠骨髓細(xì)胞中表達(dá)并起到保護(hù)作用。通過突變處理，得到一些正突變AGT基因且活性都比野生型的高，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)一個突變基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。06-烷基-鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT）能夠?qū)ⅧB77五．嵌合抗體和人源化抗體免疫球蛋白呈Y型，由二條重鏈和二條輕鏈通過二硫鍵相互連接而構(gòu)成。每條鏈可分為可變區(qū)(N端)和恒定區(qū)(C端)?？乖奈轿稽c(diǎn)在可變區(qū)，細(xì)胞毒素或其他功能因子的吸附位點(diǎn)在恒定區(qū)。每個可變區(qū)中有三個部分在氨基酸序列上高度變化，在三維結(jié)構(gòu)上是處在β折疊端頭的松散結(jié)構(gòu)(CDR)，是抗原的結(jié)合位點(diǎn)，其余部分為CDR的支持結(jié)構(gòu)。五．嵌合抗體和人源化抗體78不同種屬的CDR結(jié)構(gòu)是保守的，這樣就可以通過蛋白質(zhì)工程對抗體進(jìn)行改造。鼠單克隆抗體被人免疫系統(tǒng)排斥，它潛在的治療作用得不到利用。

嵌合抗體就是用人抗體的恒定區(qū)替代鼠單克隆抗體的恒定區(qū)，這樣它的免疫原性就顯著下降。不同種屬的CDR結(jié)構(gòu)是保守的，這樣就可以通過蛋白質(zhì)工79如用于治療直腸結(jié)腸腺癌的單克隆抗體Mabl7-lA。盡管嵌合抗體還存在著免疫原的問題，但仍有幾種嵌合抗體通過了臨床實(shí)驗(yàn)。

所謂人源化抗體就是將抗原吸附區(qū)域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到最小，免疫原性也就最小。但是，僅將CDR轉(zhuǎn)接到人抗體上，其抗原吸附能力很小，必須帶上幾個框架氨基酸殘基，才能保持原有的吸附力。如用于治療直腸結(jié)腸腺癌的單克隆抗體Mabl7-lA。80這樣就存在免疫原性與抗原吸附力之間的矛盾。通過逐個氨基酸替代或計(jì)算機(jī)模擬分析，可在保持原有吸附力的基礎(chǔ)之上，盡可能地降低免疫原性。第一個臨床上應(yīng)用的用于治療淋巴肉芽腫病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人源化抗體CAMPATH－1H，盡管療效顯著，但仍有半數(shù)以上的患者有免疫反應(yīng)。而其他人源化抗體如治療脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反應(yīng)可以忽略不計(jì)。這樣就存在免疫原性與抗原吸附力之間的矛盾。通過逐個氨81蛋白質(zhì)工程匯集了當(dāng)代分子生物學(xué)等學(xué)科的一些前沿領(lǐng)域的最新成就，它把核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物功能結(jié)合起來研究。蛋白質(zhì)工程將蛋白質(zhì)與酶的研究推進(jìn)到嶄新的時(shí)代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用開拓了誘人的前景。蛋白質(zhì)工程開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時(shí)期。蛋白質(zhì)工程匯集了當(dāng)代分子生物學(xué)等學(xué)科的一些前沿領(lǐng)域的82第五節(jié)t-PA的基因工程與蛋白質(zhì)工程

組織纖溶酶原激活劑(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)專一水解纖溶酶原形成纖溶酶，從而激活纖溶系統(tǒng)。正常的纖溶功能對于清除血管內(nèi)不溶性纖維蛋白，保證血液循環(huán)暢通起重要作用。藥用t-PA能高效地預(yù)防和治療急性心肌梗塞等血栓性疾病。第五節(jié)t-PA的基因工程與蛋白質(zhì)工程83

t-PA與纖維蛋白的親和力很高，其激活纖溶酶原依賴于纖維蛋白的作用。當(dāng)t-PA接觸到血栓后，立刻形成纖維蛋白、t-PA及纖溶酶原三元復(fù)合體，t-PA選擇性地高效激活血栓中的纖溶酶原生成纖溶酶，后者水解纖維蛋白，從而溶解血栓。纖溶酶本身的專一性不高，除水解纖維蛋白外，還能降解纖維蛋白原、凝血因子V及VIII。游離狀態(tài)的t-PA幾乎不激活血流中的纖溶酶原，藥用時(shí)一般不會引起全身性纖溶狀態(tài)。t-PA與纖維蛋白的親和力很高，其激活纖溶酶原依賴于84t-PA用于溶栓治療時(shí)也有一定的局限性，例如它進(jìn)入血漿后大部分與纖溶酶原激活劑抑制物（plasminogenactivatorinhabitor-1，PAI-1）形成復(fù)合物，并迅速失去活性。肝細(xì)胞膜上的特異受體能識別t-PA分子，快速與t-PA結(jié)合，使t-PA血漿半衰期僅為4～6min。t-PA用于溶栓治療時(shí)也有一定的局限性，例如它進(jìn)入血85因此，t-PA溶栓治療急性心肌梗塞的劑量較大，為50～100mg。當(dāng)接受治療的病人血漿中t-PA濃度上升到生理水平的1,000倍時(shí)，可引起血漿纖維蛋白濃度下降30～50%，多次持續(xù)用藥易出現(xiàn)內(nèi)出血傾向。因而，改造t-PA分子結(jié)構(gòu)，消除上述缺點(diǎn)，是t-PA蛋白質(zhì)工程的主要內(nèi)容。

t-PA的唯一功能是水解激活纖溶酶原，可直接與t-PA分子相互作用的有纖溶酶原、纖維蛋白、PAI-1和肝細(xì)胞受體四種蛋白質(zhì)，這說明t-PA的作用受到復(fù)雜的控制。因此，t-PA溶栓治療急性心肌梗塞的劑量較大，為5086研究這些分子間的作用機(jī)制，尤其是t-PA對纖維蛋白的親和力、激活纖溶酶原的活性、PAI-1對t-PA的抑制作用，以及受體對t-PA的特異性攝取等方面與t-PA分子特定結(jié)構(gòu)域的關(guān)系，會促進(jìn)t-PA分子的結(jié)構(gòu)改造，使其具有更強(qiáng)的纖溶專一性和效率。t-PA基因工程和蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)就在于生成高效特異的新型t-PA產(chǎn)品。研究這些分子間的作用機(jī)制，尤其是t-PA對纖維蛋白的87一、t-PA分子的結(jié)構(gòu)和功能t-PA分子是含527個氨基酸的糖蛋白，分子量為67,000。天然t-PA為單鏈分子，受纖溶酶或胰蛋白酶催化水解Arg275－Ile276肽鍵，轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓡味蜴I相連的雙鏈t-PA。雙鏈t-PA的N端是重鏈（或A鏈），C端為輕鏈（或B鏈），見圖3-13和表3-1。一、t-PA分子的結(jié)構(gòu)和功能88圖3-13t-PA分子的一級結(jié)構(gòu)圖3-13t-PA分子的一級結(jié)構(gòu)89肽鏈類型結(jié)構(gòu)類型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)功能信號肽（S）Met35－Gln13與t-PA由胞內(nèi)向細(xì)胞分泌有關(guān)前肽（P）Gln12－Ala1N端重鏈指形區(qū)（F）Ser1－Ser50與t-PA對纖維蛋白的結(jié)合有關(guān)表皮生長因子區(qū)（EGF）Cys51-Asp87含肝細(xì)胞膜識別t-PA的受體結(jié)構(gòu)K1區(qū)The88-Gly176K2區(qū)Asp177-rg275含纖維蛋白結(jié)合位點(diǎn)C端輕鏈Ile276-pro527含有絲氨酸蛋白酶類活性中心，含PAI－1結(jié)合位點(diǎn)表3-1t-PA分子各結(jié)構(gòu)的分布與功能肽鏈類型結(jié)構(gòu)類型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)功能信號肽（S）Met35－G90重鏈和輕鏈t-PA重鏈（H）位于肽鏈的1～275位，包括指形區(qū)、表皮生長因子區(qū)及兩個三角區(qū)，決定了t-PA對纖維蛋白的親和力，即t-PA溶血栓的高效特異性與重鏈有關(guān)。輕鏈位于276～527位，與胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶有很高的同源性，含有t-PA活性中心，即His322、Asp371和Ser478。重鏈和輕鏈912.指形區(qū)t-PA分子1-43位氨基酸與纖維結(jié)合蛋白分子的指形區(qū)結(jié)構(gòu)同源性很高，稱為指形區(qū)（F）；實(shí)驗(yàn)證實(shí)t-PA與纖維蛋白的作用部分與指形區(qū)有關(guān)。3.表皮生長因子區(qū)t-PA分子的44-91位氨基酸結(jié)構(gòu)與人表皮生長因子的同源性很高，稱為表皮生長因子區(qū)（E）。2.指形區(qū)924.三角區(qū)t-PA分子有兩個三角區(qū)（K1和K2），分別由氨基酸殘基92-173、180-261組成。K1和K2都與纖溶酶原分子、凝血酶原分子的三角區(qū)有較大的同源性。K2區(qū)是t-PA分子與纖維蛋白分子結(jié)合部位，比F更為重要。4.三角區(qū)935.糖鏈t-PA分子含糖6.8%，有三個糖基化位點(diǎn)，分別位于Asn117、Asn184和Asn448。糖鏈對t-PA活性影響不大，但缺少糖鏈或無糖鏈的缺失突變cDNA表達(dá)的新型t-PA，其血漿半衰期顯著延長，具有更大應(yīng)用價(jià)值。5.糖鏈94二、t-PA的基因工程

下面描述t-PA基因工程的步驟和方法。1.獲取目的基因獲取目的基因的方法很多。對于大多數(shù)已知基因，借逆轉(zhuǎn)錄酶，以mRNA為模板，進(jìn)行酶促合成相應(yīng)的cDNA，是獲得真核細(xì)胞基因最主要和最常用的方法。t-PA基因可用此法獲得。二、t-PA的基因工程95（1）搜索t-PAmRNA序列①登陸美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站，在Search欄中鍵入nucleotide，在For欄中鍵入humantissueplasminogenactivatormRNA，點(diǎn)擊Go；②網(wǎng)頁上會出現(xiàn)許多搜索結(jié)果，選擇

A03776H.sapiensmRNAfortissueplasminogenactivator(t-PA)，即可得到t-PAmRNA全長序列。（1）搜索t-PAmRNA序列96（2）提取總細(xì)胞RNABowes黑色素瘤細(xì)胞能大量合成t-PA，因此也可以高頻率地合成t-PAmRNA。體外大量培養(yǎng)Bowes黑色素瘤細(xì)胞，應(yīng)用TRIZOL法提取總細(xì)胞RNA。（2）提取總細(xì)胞RNA97（3）cDNA合成在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，采用oligo（dT）引物，以總細(xì)胞RNA為模板，合成cDNA的第一條鏈，得到DNA-RNA雜合分子，隨后采用RNaseH、大腸桿菌DNA聚合酶I和T4DNALigase聯(lián)合作用，以單鏈cDNA為模板合成雙鏈cDNA。（3）cDNA合成98（4）以PCR方法獲取t-PA基因根據(jù)t-PAmRNA5`和3`端的核苷酸順序，設(shè)計(jì)一對PCR引物。在兩條引物中分別設(shè)計(jì)AvrII和NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以獲得的cDNA為模板，加入引物、耐熱的Taq酶、dNTP和緩沖液后，PCR擴(kuò)增t-PA基因。（4）以PCR方法獲取t-PA基因992.t-PA基因的體外重組與測序以AvrII和NotI酶解t-PA基因和pUC19質(zhì)粒，在T4DNA連接酶的作用下，將t-PA基因與pUC19質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，應(yīng)用藍(lán)白斑法篩選陽性克隆。為了保證所獲基因的準(zhǔn)確性，必須對其進(jìn)行DNA序列測定?，F(xiàn)有許多生物技術(shù)公司能夠提供測序服務(wù)，快捷方便且價(jià)格合理，為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用。2.t-PA基因的體外重組與測序1003.表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染應(yīng)用AvrII和NotI酶解陽性克隆的重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pPIC9K，將分離的t-PA基因與pPIC9K相應(yīng)位點(diǎn)重組，構(gòu)建t-PA表達(dá)質(zhì)粒。電轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125，再應(yīng)用上述兩種酶進(jìn)行酶切鑒定，篩選出重組的陽性克隆。3.表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染1014.t-PA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母SalI將構(gòu)建成功的陽性表達(dá)載體線性化，電穿孔轉(zhuǎn)化甲醇營養(yǎng)型酵母PichiapastorisGS115，t-PAcDNA通過同源重組與酵母染色體整合，篩選多拷貝的轉(zhuǎn)化子，PCR驗(yàn)證t-PAcDNA與酵母染色體的整合狀態(tài)。4.t-PA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母1025.t-PA基因在甲醇營養(yǎng)型酵母中的表達(dá)挑取數(shù)個多拷貝轉(zhuǎn)化子，并以轉(zhuǎn)入空載體的GS115轉(zhuǎn)化子作對照，接種于含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每兩小時(shí)取樣，電泳分析t-PA表達(dá)水平，培養(yǎng)時(shí)間3-5天。6.純化（1）濃縮脫鹽：將離心所獲的上清經(jīng)微孔過濾后，應(yīng)用超濾法濃縮脫鹽。5.t-PA基因在甲醇營養(yǎng)型酵母中的表達(dá)103（2）凝膠過濾：用SephadexG-50凝膠過濾層析柱純化，去除小分子雜質(zhì)如核酸、雜蛋白、殘留無機(jī)鹽、甲醇等。（3）離子交換：純化后的樣品用SP-SepharoseFF離子交換層析柱進(jìn)一步純化。通過以上的純化步驟，一般可以得到純度>95%的t-PA蛋白。（2）凝膠過濾：用SephadexG-50凝膠過濾層析柱純1047.活性鑒定應(yīng)用酪蛋白－纖溶酶原－瓊脂糖平板溶圈法測定t-PA活性：將t-PA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按等倍梯度稀釋，加入到酪蛋白－纖溶酶原－瓊脂糖平板各孔中，37℃溫育直至溶圈出現(xiàn)，測定各溶圈面積，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測得t-PA活性。亦可用發(fā)色底物法測定t-PA活性。7.活性鑒定105三、t-PA的蛋白質(zhì)工程應(yīng)用蛋白質(zhì)工程改造t-PA，主要目的是使其獲得更高的纖維蛋白親和力、逃逸PAI的抑制、減少肝受體攝取，從而延長半衰期、增加溶栓效能、減少藥用劑量和降低副作用。三、t-PA的蛋白質(zhì)工程106Reteplase（r-PA）r-PA為野生型t-PA基因經(jīng)缺失突變，用大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)物。缺失突變體的cDNA基因失去了整個指形區(qū)、生長因子樣區(qū)和K1三角區(qū)等結(jié)構(gòu)域，只剩下重鏈的K2三角區(qū)和輕鏈結(jié)構(gòu)域的編碼順序。r-PA為單鏈非糖化分子，分子量為39kD，與肝細(xì)胞膜受體親和力顯著降低，血漿半衰期明顯延長，為11-14min。臨床對比試驗(yàn)主要數(shù)據(jù)表明r-PA的離心和不良反應(yīng)與重組t-PA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Reteplase（r-PA）107r-PA用大腸桿菌表達(dá)，成本比t-PA明顯降低。因半衰期延長等原因，其臨床治療劑量比t-PA明顯減少，靜脈用藥10min內(nèi)完成，比t-PA快9倍，因此使用方便，易于推廣。r-PA現(xiàn)已上市，競爭力很強(qiáng)r-PA用大腸桿菌表達(dá)，成本比t-PA明顯降低。因半1082.TNK-t-PATNK-t-PA為野生型t-PAcDNA基因經(jīng)以下多重突變后，由哺乳細(xì)胞表達(dá)。（1）Thr103替換為Asn103，從而形成一個新的糖基化位點(diǎn)；（2）Asn117替換為Glu117，從而去除了一個原有的糖基化位點(diǎn)。由于此處原有的糖鏈能夠促進(jìn)t-PA從血漿清除，因此突變后能降低血漿清除率，延長血漿半衰期；

2.TNK-t-PA109（3）PAI－1結(jié)合位點(diǎn)處的Lys296-His297－Arg298-Arg299替換為4個Ala，有效地對抗PAI-1的抑制作用。TNK-t-PA的血漿廓清速度明顯減慢，其清除速度比t-PA慢4倍，對PAI－1抗性增加80倍，血漿半衰期17min，對纖維蛋白的選擇性作用增強(qiáng)14倍，纖維蛋白原下降明顯減少。（3）PAI－1結(jié)合位點(diǎn)處的Lys296-His297－Ar110TNK-t-PA體外溶栓速度比t-PA快3倍，溶解兔血栓能力比t-PA強(qiáng)13倍，用藥劑量為t-PA的1/3時(shí)，兩者冠狀動脈再通率無顯著差別。由于不出現(xiàn)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，再梗塞發(fā)生率低。因出血等不良反應(yīng)少而輕，TNK-t-PA可在5秒內(nèi)一次性用藥。TNK-t-PA體外溶栓速度比t-PA快3倍，溶解兔1113.Lanoteplase（n－PA）n－PA是野生型t-PA缺失突變體，去除了指形區(qū)、表皮生長因子區(qū)，并修飾了K1三角區(qū)內(nèi)的糖基化位點(diǎn)。N－PA由中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)生成，與野生型t-PA相比，半衰期延長10倍，約37min。n－PA的溶栓效率比t-PA顯著提高：n－PA的冠脈再通率（TIMIIII級）為57%，t-PA則為46%（p=0.11）。n-PA的出血發(fā)生率也低于t-PA，可一次性、大劑量靜脈用藥。3.Lanoteplase（n－PA）1124.t-PA和scu-PA基因的重組表達(dá)單鏈尿激酶（scu-PA）也有選擇性激活血栓局部纖溶酶原的特性，也是較理想的溶栓劑。t-PA與scu-PA激活纖溶酶原溶解纖維蛋白的機(jī)制不一樣。t-PA溶解特異性依賴于重鏈，而scu-PA則不必依賴于重鏈。同時(shí)，合并應(yīng)用t-PA和scu-PA治療心肌梗塞有協(xié)同增強(qiáng)作用，因此t-PA分子的重鏈與scu-PA分子的輕鏈形成的雜交體，結(jié)合了這兩類分子對纖維蛋白的選擇性，將會是更好的溶血栓藥物。4.t-PA和scu-PA基因的重組表達(dá)113運(yùn)用重組DNA技術(shù)，還可以將凝血酶、scu-PA、纖維結(jié)合蛋白、纖溶酶原等分子中的三角區(qū)接到t-PA分子中，形成具有多個三角區(qū)的t-PA，以便提高與纖維蛋白的親和力。運(yùn)用重組DNA技術(shù)，還可以將凝血酶、scu-PA、纖維1145.單克隆抗體介導(dǎo)t-PA抗纖維蛋白的單克隆抗體對人纖維蛋白的親和力極高，是t-PA的1,000倍，用它來介導(dǎo)t-PA作溶血栓治療會更理想。Haber將t-PA和抗纖維蛋白單克隆抗體（59D8）以二硫鍵相連，形成t-PA－59D8，具有t-PA活性及59D8的抗體活性，比t-PA的溶栓效率提高2.8-9.6倍。5.單克隆抗體介導(dǎo)t-PA115在使用取得相同療效的劑量時(shí)，t-PA－59D8引起的血漿纖維蛋白原及α2-抗纖溶酶的下降要少得多。Harber還將編碼59D8的重鏈基因與t-PA輕鏈cDNA重組，表達(dá)出的融合蛋白同時(shí)具有t-PA活性和抗體活性。在使用取得相同療效的劑量時(shí)，t-PA－59D8引起的116此外，還有人將抗纖維蛋白的單克隆抗體和抗t-PA的單克隆抗體連接后，再和t-PA一起作溶栓治療。同樣劑量的t-PA與雙抗體合用時(shí)，溶栓效率明顯高于單用t-PA。雙抗體的連接，可采用化學(xué)方法，也可將兩株雜交瘤融合（或抗t-PA的雜交瘤和抗纖維蛋白的B淋巴細(xì)胞再融合），形成新的雜交瘤細(xì)胞，后者合成分泌既抗纖維蛋白又抗t-PA的抗體。此外，還有人將抗纖維蛋白的單克隆抗體和抗t-PA的單1176.t-PA蛋白分子修飾聚乙二醇（PEG）與蛋白分子偶聯(lián)后，可防止該蛋白分子同其它大分子相互作用，從而延長半衰期，逃逸蛋白酶的水解。

Garman用PEG修飾t-PA，使t-PA在體內(nèi)半衰期延長了5倍，但t-PA活性損失30%。此外，t-PA酰化衍生物，半衰期也顯著延長。6.t-PA蛋白分子修飾118第二專題第三章蛋白質(zhì)工程

第二專題119

引言

1978年，美國Hutchison用寡脫氧核糖核苷酸作體外誘變劑，成功地實(shí)現(xiàn)了定位突變試驗(yàn)，培育出多種具有生物學(xué)特性的突變株。1981年，美國Gene公司厄爾默(K．U1mer)將此定位突變試驗(yàn)冠以“蛋白質(zhì)工程”。經(jīng)過多年的發(fā)展，蛋白質(zhì)工程已經(jīng)成為生命科學(xué)中的一個重要分支。

引言120

蛋白質(zhì)工程的定義：通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動力學(xué)的研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等方面的信息，在此基礎(chǔ)上對編碼該蛋白的基因進(jìn)行有目的的設(shè)計(jì)改造，并通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終將其投入實(shí)際應(yīng)用。蛋白質(zhì)工程是在基因重組技術(shù)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)之上，融合了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動力學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等多學(xué)科而發(fā)展起來的新興研究領(lǐng)域。蛋白質(zhì)工程的定義：通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)121

蛋白質(zhì)工程內(nèi)容主要有兩個方面：（1）根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；（2）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新蛋白質(zhì)，這也是蛋白質(zhì)工程最根本的目標(biāo)之一。蛋白質(zhì)工程內(nèi)容主要有兩個方面：（1）根據(jù)需要合成122第一節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。一、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)有4個嚴(yán)格的層次，即蛋白質(zhì)的一級至四級結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）是指多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序。

第一節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析123圖3-1胰島素一級結(jié)構(gòu)及不同動物胰島素A鏈的差異圖3-1胰島素一級結(jié)構(gòu)及不同動物胰島素A鏈的差異124線性多肽鏈在空間折疊成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)或構(gòu)象。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)包括：二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）是指多肽鏈主鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象），主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等幾種形式(見圖3-2至圖3-4)。線性多肽鏈在空間折疊成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)125圖3-2四種不同的α-螺旋圖3-2四種不同的α-螺旋126圖3-3反向β-折疊圖3-3反向β-折疊127圖3-4RNase的某些二級結(jié)構(gòu)α-螺旋無規(guī)卷曲β-轉(zhuǎn)角β-折疊圖3-4RNase的某些二級結(jié)構(gòu)α-螺旋無規(guī)卷曲β-轉(zhuǎn)角128

超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）和結(jié)構(gòu)域（domain）是介于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間的空間結(jié)構(gòu)。

超二級結(jié)構(gòu)是指相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，排列形成規(guī)則的、在空間結(jié)構(gòu)上能夠辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體，并充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件（blockbuilding），其基本形式有αα、βαβ和βββ等(見圖3-5至圖3-7)。超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystruc129圖3-5細(xì)胞色素C的αα結(jié)構(gòu)圖3-6纖溶酶原的βββ結(jié)構(gòu)圖3-5細(xì)胞色素C的αα結(jié)構(gòu)圖3-6纖溶酶原130圖3-7細(xì)胞核抗原的βαβ結(jié)構(gòu)圖3-7細(xì)胞核抗原的βαβ結(jié)構(gòu)131

結(jié)構(gòu)域是在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的，通常由50-300個氨基酸殘基組成，其特點(diǎn)是在三維空間可以明顯區(qū)分和相對獨(dú)立，并且具有一定的生物學(xué)功能。

模體或基序（motif）是結(jié)構(gòu)域的亞單位，通常由2～3個二級結(jié)構(gòu)單位組成，一般為α螺旋、β折疊和環(huán)（loop）(見圖3-8)。較大的蛋白質(zhì)分子一般含有兩個以上的結(jié)構(gòu)域，其間以柔性的鉸鏈（hinge）相連，以便相對運(yùn)動。結(jié)構(gòu)域是在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的，通常由50-30132圖3-8Zn2+模體圖3-8Zn2+模體133

三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）是指整條多肽鏈的三維結(jié)構(gòu)，包括骨架和側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排列。如果蛋白質(zhì)分子僅由一條多肽鏈組成，三級結(jié)構(gòu)就是它的最高結(jié)構(gòu)層次（見圖3-9）。三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）是指134圖3-9胰島素的三級結(jié)構(gòu)圖3-9胰島素的三級結(jié)構(gòu)135

四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）是指在亞基和亞基之間通過疏水作用等次級鍵結(jié)合成為有序排列的特定的空間結(jié)構(gòu)。

亞基通常由一條多肽鏈組成，有時(shí)含兩條以上的多肽鏈，單獨(dú)存在時(shí)一般沒有生物活性（見圖3-10）。四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）136圖3-10血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)圖3-10血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)137二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定1.一級結(jié)構(gòu)測定

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定又稱蛋白質(zhì)順序分析，其基本方法是：（1）應(yīng)用化學(xué)裂解法和蛋白酶水解法將多肽鏈專一性裂解；（2）逐一測定每個純化的小肽段的順序；（3）根據(jù)肽段氨基酸順序中的重疊區(qū)確定小肽段的排列次序；（4）完成整條多肽鏈的順序分析。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定138盡管蛋白質(zhì)順序分析已經(jīng)自動化，但仍然耗時(shí)、復(fù)雜并且昂貴。

重組DNA技術(shù)出現(xiàn)后，人們可以從cDNA或基因序列直接推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸順序，速度快且經(jīng)濟(jì)，已成為最常用的測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的方法。盡管蛋白質(zhì)順序分析已經(jīng)自動化，但仍然耗時(shí)、復(fù)雜并且昂1392.蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定根據(jù)蛋白質(zhì)的狀態(tài)，測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法分為兩大類：（1）應(yīng)用X射線晶體衍射圖譜法和中子衍射法測定晶體中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象；（2）應(yīng)用核磁共振法（NMR）、園二色性光譜法、激光拉曼光譜法、熒光光譜法、紫外差光譜法和氫同位素交換法等測定溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象。2.蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定140利用X射線晶體衍射法測定蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，結(jié)果比較可靠。但是，與溶液中的構(gòu)象相比，蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象是靜態(tài)的。所以，利用蛋白質(zhì)晶體不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象。而且，很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大單晶。另外，X射線晶體衍射的工作流程較長（見圖3-11）。利用X射線晶體衍射法測定蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，結(jié)果比較可141圖3-11X射線晶體衍射的基本原理圖3-11X射線晶體衍射的基本原理142

核磁共振（縮寫NMR）是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用下，核自旋能級發(fā)生塞曼分裂(Zeemansplitting)，共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過程。近年來，NMR法測定小蛋白的三維結(jié)構(gòu)得到了成功的應(yīng)用。NMR法不需要制備蛋白質(zhì)晶體，但這種方法僅限于分析長度不超過150個氨基酸殘基的小蛋白（見圖3-12）。核磁共振（縮寫NMR）是指核磁矩不為零的核，在外磁場143圖3-12NMR測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基本過程圖3-12NMR測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基本過程144第二節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)很大程度上決定了蛋白質(zhì)的功能，因此如何獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并對之基序分析研究是現(xiàn)代分子生物學(xué)的重要課題。目前應(yīng)用X射線晶體衍射法和NMR法已測定出1萬多種蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，但與已測得的30多萬蛋白質(zhì)序列相比，還有很大的差距，大大地影響了人們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究。第二節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測145因此發(fā)展一種不依賴實(shí)驗(yàn)而又有一定準(zhǔn)確性的理論蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法顯得格外重要，近年來在這個方面取得了很多重要的成果。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理論預(yù)測方法都是建立在氨基酸的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的理論基礎(chǔ)上，大致分為以下三類。因此發(fā)展一種不依賴實(shí)驗(yàn)而又有一定準(zhǔn)確性的理論蛋146一、比較建模法(comparativemodelingmethod)

比較建模法是基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)知識的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，又稱為同源結(jié)構(gòu)預(yù)測，是根據(jù)大量已知的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)來預(yù)測序列已知而結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

一、比較建模法(comparativemodelingm147按照目前的定義，若模型構(gòu)建蛋白質(zhì)的序列與模板序列經(jīng)比對（alignment）后,序列同源性（sequenceidentity）在40%（也有人認(rèn)為在35%）以上，則它們的結(jié)構(gòu)可能屬于同一家族，它們是同源蛋白（homology），可以用同源蛋白模型構(gòu)建的方法預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)。因?yàn)樗鼈兛赡苁怯赏环N蛋白質(zhì)分化而來，它們具有相似的空間結(jié)構(gòu)，相同或相近的功能。按照目前的定義，若模型構(gòu)建蛋白質(zhì)的序列與模板序列經(jīng)比148因此，若知道了同源蛋白家族中某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，就可以預(yù)測其它一些序列已知而結(jié)構(gòu)未知的同源蛋白的結(jié)構(gòu)，可以用同源模型構(gòu)建的方法預(yù)測未知蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此，若知道了同源蛋白家族中某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，149同源蛋白模型構(gòu)建（模建）的步驟：1.目標(biāo)蛋白序列與目標(biāo)序列的匹配應(yīng)用FASTA或BLAST搜索軟件，在PIR、SWISSPROT或GENEBANK等序列庫中按序列同源性挑選出一些同源性比較高的序列，然后把挑選出的序列與目標(biāo)序列基序多重匹配，得到模板結(jié)構(gòu)等價(jià)位點(diǎn)套的初始集合。同源蛋白模型構(gòu)建（模建）的步驟：1502.根據(jù)模板結(jié)構(gòu)構(gòu)建目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)模型在已確定的模板結(jié)構(gòu)等價(jià)位點(diǎn)套的初始集合基礎(chǔ)上，旋轉(zhuǎn)每一個模板的結(jié)構(gòu)，使它們相互間的位置盡可能多地重疊在一起。不同兩個模板在空間中若符合一定的重疊距離標(biāo)準(zhǔn)，那它們相互之間的關(guān)系就是等價(jià)位點(diǎn)。許多這樣的等價(jià)位點(diǎn)構(gòu)成了等價(jià)位點(diǎn)套。2.根據(jù)模板結(jié)構(gòu)構(gòu)建目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)模型151疊合結(jié)束后，即得到了同源蛋白的結(jié)構(gòu)保守區(qū)（SCRs），以及相應(yīng)的基架結(jié)構(gòu)。模板結(jié)構(gòu)匹配后，一般還要用得到的同源體SCRs的第一條序列與目標(biāo)序列匹配，挑選出目標(biāo)序列上的高相擬區(qū)，定義為目標(biāo)蛋白的SCRs。

Homology、UQANTA/CHARM、COMPOSER和Collarextension等軟件和方法可以用于目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建。疊合結(jié)束后，即得到了同源蛋白的結(jié)構(gòu)保守區(qū)（SCRs）1523.對模建結(jié)構(gòu)基序優(yōu)化和評估同源結(jié)構(gòu)模建（預(yù)測）得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，通常含有一些不合理的原子間接觸，需要對模型進(jìn)行分子力學(xué)和分子動力學(xué)優(yōu)化，消除模型中不合理的接觸。另外，模型中有些鍵長、鍵角和二面角也有可能不合理，也需要檢查評估。PROCHECK和PROSAII等軟件常用于完成這類工作。3.對模建結(jié)構(gòu)基序優(yōu)化和評估153二．反向折疊法

反向折疊法是近年來發(fā)展起來的一種比較新的方法。它可以應(yīng)用到?jīng)]有同源結(jié)構(gòu)的情況中，且不需要預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，即直接預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，從而可以繞過現(xiàn)階段二級結(jié)構(gòu)預(yù)測準(zhǔn)確性不超過65%的限度，是一種有潛力的預(yù)測方法。二．反向折疊法154

反向折疊法的主要原理是把未知蛋白的序列和已知的結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配，找出一種或幾種匹配最好的結(jié)構(gòu)作為未知蛋白質(zhì)的預(yù)測結(jié)構(gòu)。

它的實(shí)現(xiàn)過程是總結(jié)出已知獨(dú)立的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模式做為未知結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配的模板，然后用經(jīng)過對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫的學(xué)習(xí)，總結(jié)出的可以區(qū)分正誤結(jié)構(gòu)的平均勢函數(shù)（MeanForceField），做為判別標(biāo)準(zhǔn)來選擇出最佳匹配方式。反向折疊法的主要原理是把未知蛋白的序列和已知的結(jié)構(gòu)進(jìn)155

這種方法的局限性在于它假設(shè)蛋白質(zhì)折疊類型是有限的，所以只有未知蛋白質(zhì)和已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相像的時(shí)候，才有可能預(yù)測出未知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。如未知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是現(xiàn)在還沒有出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)類型時(shí)，這種方法將不能被應(yīng)用。這種方法的局限性在于它假設(shè)蛋白質(zhì)折疊類型是有限156三．從頭預(yù)測法

從理論上說，從頭預(yù)測法是最為理想的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法。它要求方法本身可以只根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列來預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，但現(xiàn)在還不能完全得到這個要求。三．從頭預(yù)測法157從頭預(yù)測可以細(xì)分為：二級結(jié)構(gòu)預(yù)測首先從一級結(jié)構(gòu)預(yù)測出二級結(jié)構(gòu)，然后再把二級結(jié)構(gòu)堆積成三維結(jié)構(gòu)。由于目前對二級結(jié)構(gòu)中氨基酸的中遠(yuǎn)程相互作用不完全清楚，因此預(yù)測準(zhǔn)確率一般在65%以下。如果具有多種蛋白質(zhì)同源序列的三維結(jié)構(gòu)，在多重序列匹配比較的情況下，預(yù)測的準(zhǔn)確性可以達(dá)到88%以上。從頭預(yù)測可以細(xì)分為：158

Barton和Sander等人發(fā)現(xiàn)，在一個蛋白質(zhì)序列中總有約40%序列的預(yù)測可以有很好的可信度，其預(yù)測的準(zhǔn)確性都在80%以上。這些區(qū)域都是一些二級結(jié)構(gòu)序列比較保守的部分。這些結(jié)果給如何將現(xiàn)有二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果應(yīng)用到三維結(jié)構(gòu)預(yù)測提供了有益的啟示。Barton和Sander等人發(fā)現(xiàn)，在一個蛋白質(zhì)序列1592.超二級結(jié)構(gòu)預(yù)測實(shí)際上是局部的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，主要應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法和向量投影方法，從蛋白質(zhì)序列出發(fā)，直接預(yù)測蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)，觀察此段氨基酸序列是否能形成某一種模式的超二級結(jié)構(gòu)。其中人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法預(yù)測的準(zhǔn)確率在75%～82%，向量投影方法預(yù)測的準(zhǔn)確率達(dá)到85%以上。2.超二級結(jié)構(gòu)預(yù)測1603.結(jié)構(gòu)類型（structureclass）預(yù)測

該方法是預(yù)測未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)屬于何種類型，如全α類蛋白質(zhì)（主要由α-螺旋組成）、全β類蛋白質(zhì)（主要由β-折疊組成）、α/β類蛋白質(zhì)（由α-螺旋和β-折疊交替排列）或α＋β類蛋白質(zhì)（由分開的α-螺旋和β-折疊組成，其中β-折疊一般為平行結(jié)構(gòu)）。

3.結(jié)構(gòu)類型（structureclass）預(yù)測161

結(jié)構(gòu)類型預(yù)測除能了解大概的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊情況外，對二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測也有幫助。

方法主要有光譜數(shù)據(jù)預(yù)測、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測和Mahalanobis距離預(yù)測等，后者的準(zhǔn)確率較前兩者為高，可達(dá)94.7%。結(jié)構(gòu)類型預(yù)測除能了解大概的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊情況外，對二1624.三維結(jié)構(gòu)預(yù)測是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的最終目標(biāo)。主要有兩個方面：（1）根據(jù)二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)類型和折疊類型預(yù)測的結(jié)果，結(jié)合結(jié)構(gòu)間的立體化學(xué)性質(zhì)、親疏水性質(zhì)、氫鍵以及靜電相互作用，把可信度較高的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步組裝，搭建出最后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由于該方法主要依賴于前面的預(yù)測結(jié)果，所以受到的限制很多。4.三維結(jié)構(gòu)預(yù)測163（2）不依賴二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，直接預(yù)測三維結(jié)構(gòu)。主要方法是有效收集構(gòu)象空間和區(qū)分天然結(jié)構(gòu)和錯誤結(jié)構(gòu)。根據(jù)對天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測一定氨基酸序列的肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。（2）不依賴二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，直接預(yù)測三維結(jié)構(gòu)。主要方法是164通過基因重組等實(shí)驗(yàn)可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；也可以通過分子動力學(xué)、分子熱力學(xué)等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時(shí)存在兩個原子等基本原則分析計(jì)算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。