微生物限度檢查法培訓(xùn)課件

微生物限度檢查法1．微生物限度檢查法的意義藥品是防病治病、關(guān)系用藥者生命健康的特殊商品，必須保證其質(zhì)量，用藥的安全與有效。微生物污染藥品引起的藥源性疾病屢見不鮮，在國內(nèi)外均有報道。為保證藥品質(zhì)量，必須對微生物污染進行必要的控制和檢驗。其意義在于：已有許多實例表明，藥品污染微生物不僅危及病人用藥安全，而且也直接影響藥品的有效性，所以藥品衛(wèi)生質(zhì)量是藥品質(zhì)量不可分割的部分。反映藥品生產(chǎn)工藝的科學(xué)性、合理性及質(zhì)量管理水平。通過檢驗，凡工藝條件、生產(chǎn)管理水平、生產(chǎn)人員的素質(zhì)差，不注意文明生產(chǎn)的單位和企業(yè)，其生產(chǎn)的藥品，染菌必然嚴重，不合格率無疑就高。微生物限度的檢驗是提供藥品衛(wèi)生質(zhì)量狀況的重要依據(jù)，因而保證銷售與使用過程中藥品的有效性與安全性，是促進與提高生產(chǎn)單位全面質(zhì)量管理水平與提高藥品質(zhì)量的重要依據(jù)。微生物限度檢查法概述2微生物限度檢查法2．微生物限度檢查的范圍根據(jù)藥品使用的要求，可劃分為兩大類：規(guī)定滅菌的藥品：包括注射劑和輸液劑，及用于體腔、嚴重?zé)齻?、潰瘍、出血及眼科用藥等制劑。非?guī)定滅菌藥品：包括常用的口服制劑與一般外用制劑。對這一部分制劑一般不要求絕對無菌，允許一定限量的微生物存在，但同時規(guī)定不得有可疑致病的細菌存在。由于致病菌的范圍很廣，各國藥典都規(guī)定了幾個常見的致病菌或指標(biāo)菌作為控制菌。在非規(guī)定滅菌的制劑中，對每克或每毫升的藥品按劑型或品種不同規(guī)定：染菌量檢查：包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)測定，以檢查這幾類微生物對藥品的污染程度。控制菌檢查：包括大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的檢查等。3微生物限度檢查法實

驗

所

用

的

培

養(yǎng)

基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）

4－甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（MUG）乳糖培養(yǎng)基5％乳糖培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）麥康凱瓊脂（MacC）營養(yǎng)肉湯4微生物限度檢查法微生物限度檢查常用檢驗設(shè)備及器材

恒溫培養(yǎng)箱30～35℃36±1℃霉菌培養(yǎng)箱25～28℃恒溫水浴箱45±1℃凈化工作臺生物顯微鏡1500X體視顯微鏡或放大鏡電冰箱電熱干燥箱250～300℃高壓蒸汽消毒器電子天平或藥物天平感量0.1g勻漿儀或研缽錐形瓶100ml，250ml，500ml，1000ml5微生物限度檢查法直形吸管1ml，10ml量杯10ml試管18x180mm，13x200mm，30x200mm試管筒培養(yǎng)皿9cm培養(yǎng)皿筒陶瓦蓋12cm量筒100ml，500ml，1000ml濾器及微孔濾膜孔徑0.45±0.02um注射器1ml，5ml，10ml，30ml載玻片及蓋玻片接種針及接種環(huán)試管架6微生物限度檢查法乙醇燈康氏振蕩器離心機500～4000／min紫外燈365nm玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）大、小橡皮乳頭乙醇棉球或碘伏棉球滅菌剪刀、鑷子、鋼錐滅菌稱樣紙滅菌不銹鋼藥匙火柴、記號筆（玻璃鉛筆）白瓷盤、洗手盆實驗記錄紙7微生物限度檢查法細菌、霉菌與酵母菌的檢查方法

（平皿菌落計數(shù)法）

（一）供試品的抽樣、保存及檢驗量1．

供試品應(yīng)隨機抽樣。一般抽樣量（2個以上最小包裝單位）為檢驗量的3倍量。2．對異常的供試品應(yīng)針對性的抽樣。抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠?，應(yīng)選取有疑問的樣品，但機械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）、外觀看出長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格，無需在抽樣檢驗。不能以外觀有上述情況而檢查內(nèi)容物合格，來判斷該藥品合格。3．供試品收檢后應(yīng)及時檢驗，若有困難，應(yīng)存放在該品種規(guī)定的儲存條件下（一般為陰涼干燥處），勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死、損傷或繁殖。8微生物限度檢查法4．供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴禁開啟，包裝已開啟的樣品不得作為供試品。5．供試品的取樣必須在凈化條件下無菌操作，嚴防再污染。（原料藥、裝量大的藥）6．有劑型檢驗量均需取自2個以上包裝單位（中藥蜜丸、膜劑，除需取自2個以上包裝外，還應(yīng)取4丸、片以上樣品）。7．固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗量為10克。8．液體制劑檢驗量為10毫升。9．膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗量為30～50cm2

，化學(xué)膜劑及生化藥膜劑檢驗量為100cm2

。10．貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可以酌減，除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3克，液體制劑采用原液者不得少于6毫升，采用供試液者不得少于3毫升，外用藥品不得少于5克69微生物限度檢查法（二）實驗操作前的準備

1．將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、研缽、吸管（1ml10ml）、量筒、稀釋劑等移至無菌室內(nèi)。每次實驗所用物品必須事先計劃，準備足夠用量，避免操作中出入操作間。編號后將全部外包裝（牛皮紙、布）取掉。另外還有增菌液、培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，保持在45℃左右的水浴中）、MUG培養(yǎng)基試管等……………..濕熱滅菌的物品稱量紙、手術(shù)鑷子、剪子等…………...干熱滅菌的物品

2．開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣凈化裝置，并使其工作不少于30分鐘。

3．操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋。再用0.1％苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌衣、帽、口罩。10微生物限度檢查法

4．操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。（三）供試液的制備（1：10供試液）按供試品的理化特性與生物學(xué)特性采取適宜的方法制備供試液。不得改變污染微生物的數(shù)量和種類。

1．液體供試品取供試品10ml，加入到稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。（有的書上講取10ml，置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，搖勻）。①

油劑可加適量聚山梨酯－80；11微生物限度檢查法

②氣霧劑、噴霧劑供試品將供試品置冰室內(nèi)2hr后，取出，用滅菌鋼錐小心鉆孔，使拋射劑緩慢釋放，然后用滅菌注射器加入稀釋劑，混勻后吸取相當(dāng)于10g或10ml供試品，再稀釋成1：10供試液。USPXXIV規(guī)定是拋射劑導(dǎo)出后，吸取10ml或取10g供試品，加稀釋液使成100ml。③合劑（系指含蜂蜜或王漿者）與滴眼劑可用供試品作為供試液。（滴眼劑不得檢出霉菌和酵母菌）。含蜂蜜、王漿的制劑2．固體、半固體或粘稠供試品稱取供試品10g，置裝有0.9％無菌氯化鈉100ml的勻漿杯中，用勻漿儀（3000～5000r／2－4min），或其他適宜方法（振蕩器或研缽研磨等方法分散混勻，作為供試液。在制備過程中，必要時可加適量聚山梨酯－80，并適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超過45℃。12微生物限度檢查法3．非水溶性供試品①軟膏劑、乳化劑稱取供試品5g(5ml)，加入含已滅菌熔化并保溫45℃左右的司盤－8050g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯－8010g混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加入45℃左右的0.9％無菌氯化鈉溶液約80ml，（實際測可能是85ml），邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液（1：20）。②油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯－805～8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml。③栓劑稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃左右水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯－805～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯－80總量為100ml），搖勻13微生物限度檢查法④

茶劑取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖30秒，以滅菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30分鐘）。⑤

膠丸劑（如魚肝油丸等）同膠囊劑⑥

膠劑（如阿膠）取膠劑若干，搗碎，稱取10g，再用研缽研細，轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶內(nèi)，加入稀釋劑100ml，置45℃±1℃水浴中，振搖使溶，即為1：10供試液。⑦膠丸劑（如魚肝油丸等）同膠囊劑⑧

膠劑（如阿膠）取膠劑若干，搗碎，稱取10g，再用研缽研細，轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶內(nèi)，加入稀釋劑100ml，置45℃±1℃水浴中，振搖使溶，即為1：10供試液。14微生物限度檢查法

4．含抑菌成分供試品（僅限檢查控制菌時用）凡含防腐劑或抑菌成分且影響檢驗（供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對照菌，不能檢出時）的供試品，可根據(jù)供試品的性質(zhì)，控制菌的特性及檢驗條件等按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合應(yīng)用處理后，依法檢查。同時做陽性和陰性對照。藥典規(guī)定：供試品如干擾控制菌檢驗，按以下方法處理后，依法檢查。實際操作中：先把供試液離心（500r/min5min）這樣菌體在上層，吸取上清液過濾，把濾膜直接貼在培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可，具體吸取上清液10ml還是100ml按品種要求自己定。取10ml過濾測出來的是個／克，取100ml過濾測出來的是個／10克。（限度檢查）①稀釋法：將供試品種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度（使該供試液稀釋至陽性對照菌能生長的濃度）。此法用作控制菌檢查和限度檢查。本法適用于抑菌作用不強的中藥、化學(xué)藥品的檢驗。15微生物限度檢查法②離心沉淀集菌法：取規(guī)定量的供試液于無菌刻度離心管中，離心（每分鐘3000轉(zhuǎn)）30分鐘，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原規(guī)定的供試液。如有不溶性藥渣，可先離心（每分鐘500轉(zhuǎn)）5分鐘，取全部上層液，再行集菌處理。本法適用于一些抑菌作用不強的中、西藥品，如蜜丸、水丸、片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑及液體制劑。應(yīng)用本法需嚴防操作污染，并注意上層液或上清液和底部殘渣的分離，避免沉渣混入其中。③薄膜過濾法：取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45um±0.02um的微孔濾膜過濾器中，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50～100ml，取出濾膜備檢。沖洗時每次最好不少于100ml，可以將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中，可以用加入濾器中供試品的量來控制檢驗量，也可以把濾膜取出來剪成2～4片，使每片相當(dāng)于供試品1g或1ml，放入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢驗。16微生物限度檢查法本法適用于水溶性抑菌成分的中、西藥品和滴眼劑等制劑的“滅活”處理。安放濾膜時，注意濾膜與濾器應(yīng)密合，防止濾膜破損、漏液。本法所用濾膜孔徑0.45um±0.02um。④（鈍化）中和法：凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。磺胺類藥物中和法取規(guī)定量含磺胺類的供試品，于100ml增菌液中加入含1％對氨基苯甲酸約1～5ml（以前講加入0.5ml）。本法用于含磺胺較少的制劑，如：三黃軟膏、消炎眼藥水、斑馬眼藥水等。應(yīng)用本法可因供試品的不同，對氨基苯甲酸的用量可適當(dāng)調(diào)整。含砷、汞等重金屬藥物中和法，取規(guī)定量的供試品，加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中，作增菌培養(yǎng)。17微生物限度檢查法本法適用于含重金屬鹽類藥物的檢驗，如磺胺嘧啶銀軟膏等。含洗必泰等防腐劑的供試品中和法，取規(guī)定量的供試品，加入含適量聚山梨酯－80等表面活性劑的100ml增菌液中（表面活性劑的用量應(yīng)預(yù)試，用量過大有抑菌作用）。本法適用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓劑及其它含抑菌成分的供試品。應(yīng)用本法需注意，由于供試品不同，表面活性劑的用量應(yīng)預(yù)試，用量不宜過大，否則本身易產(chǎn)生抑菌作用。⑤沉降法：（藥典上沒收載此法）取規(guī)定量的供試液，自然沉降5分鐘，取上層液于100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)。本法用于單一成分固體制劑如磺胺嘧啶片。取規(guī)定量的供試液，自然沉降5分鐘，吸取上層液于（含1％對氨基苯甲酸1ml）100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)。本法適用于復(fù)方磺胺制劑，如復(fù)方磺胺嘧啶片、復(fù)方新諾明片等18微生物限度檢查法以上兩法適用于難溶于水的抗菌制劑。如磺胺類藥應(yīng)用沉降法時，供試品應(yīng)充分研細，并與稀釋劑充分搖勻，使污染菌分散于液相中；沉降時間不宜超過5分鐘，以防菌細胞下沉；取上清液時，避免吸入藥渣。（四）對照用陽性菌液控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的陽性對照試驗。對照菌株為大腸桿菌［CMCC(B)44102］、沙門菌CMCC(B)50094］、銅綠假單胞菌、［CMCC(B)10104］及金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]制備：取相應(yīng)菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20小時后，稀釋至1：106。對照菌的加入量為50～100個。CMCC――醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。國內(nèi)藥品微生物檢驗所用的菌種主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌號，B(bacteria)代表細菌，F(xiàn)(fungi)代表真菌。中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供這些干燥菌種。19微生物限度檢查法（五）平皿菌落計數(shù)法取均勻供試液，進一步稀釋成1：1021：103等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試品液各1ml，置直徑約9mm的平皿中，再注入約45℃的培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級應(yīng)作2～3個平皿。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數(shù)。在特殊情況下，前者同時點記霉菌、酵母菌菌落數(shù)，后者同時點記細菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。含蜂蜜、王漿的制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別測定霉菌、酵母菌菌落數(shù)，合并計數(shù)。含糖的液體及半固體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基同時點計霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。（六）菌數(shù)測定陰性對照試驗取供試驗用的稀釋劑各1ml，置4個無菌平皿中，分別按細菌、霉菌計數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。（七）檢驗程序20微生物限度檢查法細菌、霉菌（酵母菌）檢驗程序

21微生物限度檢查法

（八）供試液的稀釋（10倍遞增稀釋法）

取2～3支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑。另取1支1ml滅菌吸管吸取1：10均勻供試液1ml，加入裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中混勻，即得1：100供試液。依此類推，根據(jù)供試品的污染程度，可稀釋至1：103、1：104等適宜稀釋級（至少共三級）。一般取1：101：1021：103三級稀釋液檢驗。每遞增一個稀釋級，必須另換一支吸管。在作10倍遞增稀釋時，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次。吸液時，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，再沿第2支稀釋管的內(nèi)壁靠近液面（勿接觸液面）緩慢地吹出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。22微生物限度檢查法（九）注平皿在進行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管，吸取各級稀釋液各1ml至每個平皿中，每一稀釋劑注2～3個平皿。（此時，一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。同時做陰性對照（待各級稀釋液注皿完成后，用一支1ml吸管吸取稀釋劑各1ml，分別注入4個平皿中。其中兩個作細菌陰性對照；另2個作霉菌、酵母菌陰性對照，如另用YPD瓊脂測定酵母菌數(shù)時，再增加2個平皿作酵母菌數(shù)陰性對照）。（十）傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基（細菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、王漿液體制劑另加用YPD瓊脂）溶化，冷至約45℃時，23微生物限度檢查法傾注上述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿，使試液與培養(yǎng)基混勻，（注意，混勻時切勿將培養(yǎng)基濺到平皿邊及皿蓋上），置操作臺上待凝。（十一）培養(yǎng)細菌計數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，霉菌、酵母菌計數(shù)平板于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。（十二）菌落計數(shù)1．細菌培養(yǎng)時間為48小時，分別在24小時及48小時點記菌落數(shù)，一般以48小時菌落數(shù)為準，霉菌、酵母菌培養(yǎng)時間為72小時，分別在48小時及72小時點記菌落數(shù)，一般以72小時菌落數(shù)為準。菌落如蔓延生長成片，此平板不宜計數(shù)。點計后，計算各稀釋級的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。24微生物限度檢查法2．一般將平皿置菌落計數(shù)器或從平皿的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的區(qū)別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區(qū)別，可延長培養(yǎng)時間4～7天，細菌菌落常會生長增大而加以區(qū)別。3．供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點記在細菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法須按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。4．供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，（特別是1：10級別）培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多且難與菌落用肉眼相區(qū)別的有形物。為了有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿25微生物限度檢查法（1～2個平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計數(shù)菌落時作為對照?；蛴?.001％TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細菌菌落與其他有形物區(qū)別開來。［0.001%TTC肉湯瓊脂培養(yǎng)基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑瓊脂），在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌的1％TTC溶液1ml混勻后傾注平皿，防止菌落蔓延］。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長的菌落不易辨認和點計，為防止這種情況，也可用0.001％TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后生長的菌落為紅色，襯以白色背景上易于點計。5．若平板上有2個或2個以上菌落重疊，肉眼可辨別時仍以2個菌落或2個以上菌落計數(shù)；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無明顯界限，一條鏈作為一個菌落計，但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時，仍應(yīng)分別計數(shù)，若生長蔓延較大的片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計數(shù)用。26微生物限度檢查法附表：細菌、霉菌、酵母菌形態(tài)特征比較（營養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板）

27微生物限度檢查法

6．如同一稀釋級2個平板菌落數(shù)超過1倍以上，不應(yīng)計數(shù)，菌落蔓延成片不應(yīng)計數(shù)。7．當(dāng)2個平板菌落數(shù)均在15（含15）以下時，按菌落計數(shù)的Poisson分布菌數(shù)的95%可信限計。二個平板最大差值分別在0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15，以上各數(shù)分別為菌落平均值1、2、3、4、5、6、7的上限及下限，超出以上限度，視為操作誤差，不得作為計數(shù)依據(jù)。每個稀釋級使用3個平板時，平板菌落數(shù)均在10個以下的情況。0～3，1～5，2～7，3～9，4～10，5～12，6～13，7～14。

8．對有疑議的供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計數(shù)時，可培養(yǎng)至1周再點計菌落數(shù)。（十三）菌數(shù)報告規(guī)則

1．細菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30～300（國外近年有選取25～250的趨向）之間的稀釋級，霉菌、酵母菌選取平均菌落數(shù)在30～100之間的稀釋級作為報告菌28微生物限度檢查法數(shù)計算的依據(jù)。如只有1個稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間，則將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。

2．如有2個相鄰稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間時，則按比值計算。當(dāng)比值≤2時，則以2個稀釋級的均值報告。當(dāng)比值＞2時，則以低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。比值＝（高稀釋級平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）／（低稀釋級平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）

3．如有3個稀釋級平均菌落數(shù)均在30～300（30～100）之間時，則以后2個稀釋級計算級間比值報告。

4．如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，則按最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在30以下，一般則按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。29微生物限度檢查法

5．如各稀釋級平均菌落數(shù)均不在30～300（30～100）之間，則以最接近30或300（100）的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。

6．如各稀釋劑的平板均無菌落生長或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時，則報告菌數(shù)為小于10個／g或ml。如供試品原液平板均未生長霉菌及酵母菌，則報告未檢出霉菌及酵母菌／ml。

7．當(dāng)各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，如高稀釋級平均菌落數(shù)大于或等于低稀釋級平均菌落數(shù)時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法重新測定，按測定結(jié)果報告菌數(shù)。

培養(yǎng)基稀釋法：取低稀釋級供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個或5個以上平皿中（每皿0.2ml或＜0.2ml)，每1個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。5個或5個以上平板點計的菌落數(shù)之和，即為每1ml菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。30微生物限度檢查法8．結(jié)果報告①

菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)報告。②

菌落數(shù)大于100時，取兩位有效數(shù)字報告，第三位按數(shù)值修約規(guī)則處理。③

復(fù)試供試品細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)其中任一項一次檢驗不合格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項復(fù)試兩份，以三次檢驗結(jié)果的平均值報告。31微生物限度檢查法（十四）注意事項1．供試品檢驗全過程必須符合無菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。2．從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)基操作應(yīng)在1小時內(nèi)完成，避免由于時間過長導(dǎo)致菌細胞繁殖或死亡。3．供試液稀釋及注皿應(yīng)取均勻的供試液，以免造成實驗誤差。4．為避免細菌菌落蔓延生長，宜采取下列方法處理：開蓋干燥換陶瓦蓋加TTC(0.001%)5．在凈化工作臺上操作時，應(yīng)避免雙手來回出入工作臺；在無菌室操作時，應(yīng)避免操作者來回出入無菌室。

32微生物限度檢查法細菌、霉菌及酵母菌的其他檢驗方法

（一）

細菌計數(shù)其他測定方法細菌計數(shù)除平板菌落計數(shù)法外，還有其他方法，大體上可分兩大類：1．活菌計數(shù)包括試管稀釋法、濾膜法、毛細血管法等前者是液體培養(yǎng)法，后兩者是固體培養(yǎng)法。其特點都是檢測具有繁殖能力的細菌數(shù)。2．總菌數(shù)計數(shù)法是以細菌（或其它菌類）的形態(tài)特征檢測細菌總數(shù)，包括無生殖能力的菌細胞在內(nèi)。試管稀釋法（試管法、MPN法）33微生物限度檢查法濾膜法（BP、JP已收載此法）計數(shù)板法（采用血球計數(shù)板或其它計數(shù)板進行細菌計數(shù)）儀器法（應(yīng)用儀器測定菌數(shù)是現(xiàn)代菌數(shù)檢測技術(shù)的一種發(fā)展動向。細菌細胞則屬不導(dǎo)電的粒子，可被計數(shù)）平板涂布法（二）

霉菌、酵母菌數(shù)測定的其他方法1．表面涂抹平板法本法適用于污染比較嚴重的供試品2．濾膜培養(yǎng)法3．酵母菌鏡檢計數(shù)法血球計數(shù)板或其它的計數(shù)板進行酵母菌計數(shù)

34微生物限度檢查法大

腸

桿

菌

檢

查

法

大腸桿菌即大腸埃希菌(Escherichiacoli)，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等四個種（有的資料說五種）。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到了人和溫血動物糞便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌。用4－甲基傘形酮葡糖苷酸(4－Methylumbelliferyl－β－D－glucuronide，即MUG)和靛基質(zhì)（Indole）試驗檢驗大腸桿菌是一項新技術(shù)，專一性強，試驗證明94％大腸埃希菌MUG陽性，且在大腸埃希菌屬中，除E.coli以外，其他5種35微生物限度檢查法大腸埃希桿菌MUG皆為陰性。其檢驗步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌種分離單個菌，如MUG、Indole試驗為陽性或陰性即可報告結(jié)果，如MUG、Indole試驗不一致時，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗鑒別。原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用的低物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指標(biāo)系統(tǒng)來鑒定目標(biāo)菌。試驗證明96％的大腸桿菌含β－葡糖苷酸酶（β－glucuronidase,GUD），約10％的沙門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。單一的MUG鑒別大腸桿菌其漏檢率達6％，這不符合藥典檢查方法的準確度要求，鑒于98％的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性，故將MUG－靛基質(zhì)試驗結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔以IMViC試驗，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達99％。36微生物限度檢查法（一）大腸桿菌檢驗程序（見下頁圖表）供試液的制備方法：1．液體供試品

2．固體、半固體或粘稠液體供試品

3．非水溶性供試品

4．含抑菌成分的供試品（稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法、沉降法）（二）增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基3份，每份各100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照菌50～100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。37℃培養(yǎng)18～24小時（必要時可延長至48小時）。陰性對照應(yīng)無菌生長。37微生物限度檢查法搖勻上述膽鹽乳糖增菌液，以滅菌吸管吸取供試品膽鹽乳糖增菌液、供試品陽性對照增菌液、陰性對照培養(yǎng)液各0.2ml，分別加入5mlMUG－蛋白胨培養(yǎng)基管，37℃培養(yǎng)，分別于5小時、24小時，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外燈下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性，供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。（三）分離培養(yǎng)如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時，將上述供試品BL38微生物限度檢查法大

腸

桿

菌

檢

驗

程

序

圖

示

39微生物限度檢查法

增菌液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24小時。當(dāng)陰性對照呈陰性，陽性對照的平板呈典型菌落生長時，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌。如果有菌落生長，應(yīng)挑選2～3個可疑菌落作靛基質(zhì)試驗（I）、甲基紅試驗（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗（V－P）、枸櫞酸鹽利用試驗（C）及革蘭染色，鏡檢。按表中規(guī)定判斷結(jié)果：（見下頁）40微生物限度檢查法大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)

曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）典型菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無明顯暗色中心，無金屬光澤。麥康凱瓊脂

典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。非典型菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色。

41微生物限度檢查法（四）純培養(yǎng)（復(fù)壯）如生長菌落與（大腸桿菌菌落形態(tài)特征表）所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24小時，作以下檢查。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24小時，在挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。（五）革蘭染色、鏡檢

1．以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，輕輕研開，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2～3次（載玻片不燙手為宜）固定。42微生物限度檢查法2．滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗3．滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水4．滴加95％乙醇，脫色20～30秒，水洗?；?qū)?5％乙醇滴滿整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿涂片脫色10秒，水洗、吸干5．滴加沙黃染液，復(fù)染1分鐘，待干后，鏡檢染色結(jié)果：革蘭陽性菌呈藍紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。注意事項：

1．玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌量不可濃，否則，菌細胞成堆或連成片?？床磺鍐蝹€菌體形態(tài)。染色反應(yīng)難于判斷，菌細胞形態(tài)難于觀察。

2．待檢菌菌齡以16～24小時為宜。革蘭陽性菌易受菌齡影響，老化細胞易呈陰性。

3．脫色是本法的關(guān)鍵步驟，脫色時間不足菌細胞易染成陽性，脫色時間過長易染成陰性。43微生物限度檢查法（六）生化試驗

1．靛基質(zhì)試驗（I）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48小時，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。98％的大腸桿菌I試驗為陽性。一般24小時即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出1ml或2ml培養(yǎng)液進行檢查，如靛基質(zhì)試驗是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24小時，作靛基質(zhì)試驗。

2．甲基紅試驗(M)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時±2小時，于管內(nèi)加入甲基紅指示液2～3滴（約每1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。44微生物限度檢查法

3．乙酰甲基甲醇生成試驗(V－P)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時±2小時，于每2ml培養(yǎng)液中加入α－萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40％KOH溶液0.4ml，充分振搖，在4小時（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。

4．枸櫞酸鹽利用試驗(C)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，一般培養(yǎng)48～72小時，培養(yǎng)基斜面有菌落生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮?。（七）注意事?/p>

1．本法（MUG法）不必從混合菌中分離單個菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；亦有極少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽性。因此在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽性45微生物限度檢查法菌的干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長，即使有生長，本法能檢出。既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌。

2．配制MUG培養(yǎng)基時，務(wù)必校正PH值，滅菌后PH不得過7.4，否則PH值偏高，MUG管本身分解則顯熒光，分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管本身不得顯熒光。

3．培養(yǎng)時間供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間，一般在5小時、24小時觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準確判斷時，可延長培養(yǎng)至48小時再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD（β－葡萄糖醛酸苷酶）的活性不完全相同，對低物和低物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時間、溫度；PH的改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對結(jié)果的判斷亦有影響。46微生物限度檢查法

4．結(jié)果觀察取供試品的MUG試驗管、陽性對照管、陰性對照管同時在365nm紫外燈下觀察，陽性對照管應(yīng)有較強藍白色熒光，陰性對照管無熒光。供試品MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中間），適當(dāng)傾斜試管。如陽性對照管熒光強烈，影響供試品管與陰性對照管的觀察時，亦可移去陽性對照管。

5．藥品中污染的大腸桿菌，亦受生產(chǎn)工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特征時有變化，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗，主觀性較大，務(wù)必挑選2～3個以上菌落分別做IMViC試驗鑒別，挑選菌落越多，檢出陽性菌的機率越高，如僅挑選一個菌落做IMViC試驗鑒別，則易漏檢。47微生物限度檢查法

6．在IMViC試驗中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。且勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。枸櫞酸鹽利用培養(yǎng)時間，原定為2天，根據(jù)試驗資料，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3天后，枸櫞酸鹽利用試驗產(chǎn)生陽性。僅培養(yǎng)2天是不夠的，故實驗培養(yǎng)時間改為2～4天（藥典規(guī)定48～72小時）。

7．陽性對照試驗是檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陽性對照菌液的制備、計數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測供試品的無菌室或凈化臺上進行，必須在單獨的隔離間或凈化臺操作，以免污染供試品及操作環(huán)境。48微生物限度檢查法8．在各類供試品中檢測大腸桿菌及其他控制菌，按一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復(fù)驗。檢出的大腸桿菌及其他控制菌培養(yǎng)物須保留備查。（一般保留1個月）

9．大腸埃希桿菌（E.coli）是大腸埃希桿菌屬中一種細菌，已知大腸埃希菌屬有6種，其中IMViC試驗?zāi)Ｊ綖椋D―或－＋――。故中國藥典大腸埃希桿菌檢查法所指的IMViC試驗結(jié)果與BP1998的E.coli檢查法比較，判斷檢出或未檢出大腸埃希桿菌，均有其局限性。

BP1998法中含IMViC試驗為＋＋――的菌株但BP1998法中不含IMViC試驗為－＋――的菌株49微生物限度檢查法附：典型大腸桿菌＋＋――

非典型大腸桿菌－＋――

典型中間型大腸桿菌＋＋―＋非典型中間型大腸桿菌－＋―＋典型產(chǎn)氣腸桿菌――＋＋非典型產(chǎn)氣腸桿菌＋―＋＋

50微生物限度檢查法微生物限度檢查法結(jié)果判斷

（一）細菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下規(guī)定，應(yīng)判為供試品符合規(guī)定；其中任何一項不符合該品種項下規(guī)定，應(yīng)判供試品不合格。（二）細菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)第一次測定結(jié)果超過該品種項下規(guī)定時，應(yīng)從同一批號樣品中隨機抽樣，復(fù)試2次，以3次結(jié)果平均值報告。（三）眼科用藥的霉菌和酵母菌菌落數(shù)復(fù)試報告，須以2次復(fù)試結(jié)果均不得長菌，方可判供試品合格。52微生物限度檢查法（四）如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板生長霉菌（酵母菌）菌落數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長細菌菌落數(shù)超過該品種項下微生物限度規(guī)定時，經(jīng)復(fù)試2次，如3次結(jié)果平均值仍超過規(guī)定，應(yīng)判供試品不合格。（五）各類制劑檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復(fù)試，即應(yīng)判該供試品不符合規(guī)定。53微生物限度檢查法沙

門

菌

檢

驗

程

序54微生物限度檢查法銅

綠

假

單

胞

菌

檢

驗

程

序55微生物限度檢查法金

黃

色

葡

萄

球

菌

檢

驗

程

序

56微生物限度檢查法破

傷

風(fēng)

梭

菌

檢

驗

程

序57微生物限度檢查法無

菌

室

技

術(shù)

要

求微生物限度及無菌檢查實驗室條件應(yīng)滿足工作任務(wù)的要求，有完善的實驗設(shè)施和管理制度。在未普遍采用現(xiàn)代化的無菌隔離器技術(shù)之前，無菌實驗室仍是最常用的無菌環(huán)境之一。1.

無菌室的建筑設(shè)計應(yīng)充分考慮其合理布局，使用方便，操作安全等條件。應(yīng)設(shè)在較潔凈的環(huán)境內(nèi)。遠離交通干道、廁所及污染區(qū)，最好在二樓以上，應(yīng)選上下水道及其他安裝適宜的位置。2.專用無菌室無菌檢查、微生物限度檢查與抗生素微生物檢定用實驗室，應(yīng)嚴格分開，具危險性的毒菌、毒素如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉素需單獨使用，以便控制、防止傳播。58微生物限度檢查法3、

無菌室操作間面積不超過10m2、高不超過2.4m4、室內(nèi)六面應(yīng)光滑平整、無縫隙，不起灰