基因?qū)W之人類(lèi)基因組計(jì)劃

1人類(lèi)基因組計(jì)劃2人類(lèi)基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)是對(duì)全長(zhǎng)約33億對(duì)堿基的人類(lèi)基因組進(jìn)行測(cè)序和注釋工作的國(guó)際科學(xué)合作計(jì)劃。該計(jì)劃所制作的基因組圖（GenomeMaps）將幫助科學(xué)家定位人類(lèi)的全部基因。3一、歷史背景1985年：

美國(guó)能源部（DOE）提出

三項(xiàng)主要目標(biāo)：

繪制高精度的人類(lèi)染色體物理圖譜

開(kāi)發(fā)相關(guān)技術(shù)及設(shè)備

擴(kuò)展用于交流的網(wǎng)絡(luò)、計(jì)算能力以及數(shù)據(jù)庫(kù)容積4一、歷史背景1986年3月：

諾貝爾獲獎(jiǎng)?wù)逺enatoDulbecco

在《Science》發(fā)表短文《腫瘤研究的轉(zhuǎn)折點(diǎn)——人類(lèi)基因組測(cè)序》被譽(yù)為“人類(lèi)基因組計(jì)劃”的標(biāo)書(shū)5一、歷史背景1988年：

美國(guó)在NIH建立人類(lèi)基因組國(guó)家研究中心

——NCHGR協(xié)調(diào)全國(guó)主要研究組織和實(shí)驗(yàn)室

向國(guó)會(huì)提出15年，經(jīng)費(fèi)￥30億。6一、歷史背景WatsonCollinsNCHGR第一任主任NCHGR第二任主任（1989）（1992）7一、歷史背景1990年：

美國(guó)官方正式宣布實(shí)施人類(lèi)基因組計(jì)劃英、法、德、日制定了各自的人類(lèi)基因組計(jì)劃

人類(lèi)基因組計(jì)劃是一項(xiàng)國(guó)際合作事業(yè)8一、歷史背景人類(lèi)基因組組織成立（HUGO）

協(xié)助研究資源的互通

鼓勵(lì)公眾的討論

對(duì)人類(lèi)基因組研究的用途提出建議Bermuda原則

1996年2月，在Bermuda召開(kāi)的國(guó)際會(huì)議上，合作者同意讓測(cè)序數(shù)據(jù)在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)入公共數(shù)據(jù)庫(kù)，9一、歷史背景1998年5月，CraigVenter創(chuàng)立Celera公司10一、歷史背景1993年：

中國(guó)成立人類(lèi)基因組南方和北方中心1999年：

中國(guó)加入HGP

負(fù)責(zé)3號(hào)染色體短臂末端30萬(wàn)bp的測(cè)序工作11二、目標(biāo)12二、目標(biāo)1.繪制人類(lèi)基因組的遺傳圖2.繪制人類(lèi)基因組的物理圖3.繪制人類(lèi)基因組的序列圖4.繪制人類(lèi)基因組的基因圖遺傳圖以遺傳標(biāo)記為路標(biāo)，以遺傳學(xué)距離為圖距的基因組圖。遺傳標(biāo)記：具有遺傳多態(tài)性，在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具有一個(gè)以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率高于1%遺傳學(xué)距離：在減數(shù)分裂事件中兩個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組的百分率，1%重組率為1cM（厘摩）14三代不同的遺傳標(biāo)記：第一代標(biāo)記：RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）第二代標(biāo)記：VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)）第三代標(biāo)記：SNP（單核苷酸多態(tài)性）15

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）概念由于DNA多態(tài)性，如果取代的某一堿基正好位于某一限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列內(nèi)，那么群體當(dāng)中不同個(gè)體、不同染色體的DNA用相同的某一限制性內(nèi)切酶切割時(shí)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段。16可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)（VNTR）概念基因組內(nèi)廣泛存在串聯(lián)重復(fù)序列，串聯(lián)重復(fù)首尾相連。在群體中不同的個(gè)體或不同的染色體中，其串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)不同而產(chǎn)生的多態(tài)。17可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)（VNTR）重復(fù)單元衛(wèi)星DNA：>25bp

小衛(wèi)星DNA：6~25bp

微衛(wèi)星DNA：2~6bp18可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)（VNTR）19單核苷酸多態(tài)（SNP）概念

DNA序列中單個(gè)核苷酸發(fā)生的變異。位置編碼區(qū)、非編碼區(qū)、基因間20遺傳圖應(yīng)用RFLP繪制遺傳圖：標(biāo)記間距>10cM應(yīng)用VNTR繪制遺傳圖：標(biāo)記間距達(dá)1cM應(yīng)用SNP繪制遺傳圖：將遺傳圖和物理圖有機(jī)整合21物理圖以序列標(biāo)簽位點(diǎn)為路標(biāo)，以序列長(zhǎng)度kb或Mb為圖距的基因組圖。步驟：（1）用限制性內(nèi)切酶切割DNA鏈（2）序列分析（3）構(gòu)建克隆片段重疊群23物理圖

序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequencetaggedsite,STS）：已知核苷酸序列的一個(gè)DNA片段稱(chēng)為STS。

STS作為基因組中的特殊位點(diǎn)，可用兩個(gè)引物由PCR來(lái)鑒定。物理圖的制作伴隨DNA克隆技術(shù)的發(fā)展而完善。2425載體將外源DNA片段運(yùn)送到受體細(xì)胞，并能進(jìn)行自我復(fù)制增殖和表達(dá)的工具。26載體的基本特征

（1）分子量小，便于與較大的DNA片段結(jié)合，能進(jìn)入受體細(xì)胞并在其中增殖。（2）有多種限制酶切位點(diǎn)，但對(duì)于每一種限制酶只能有一個(gè)酶切位點(diǎn)。（3）被切割載體DNA插入外源DNA后，不影響自身的復(fù)制和表達(dá)能力。（4）載體上要有可選擇的標(biāo)記基因（如抗藥基因）或報(bào)道基因，以利于在受體細(xì)胞中被選出。（5）克隆載體上要有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體上還要有啟動(dòng)子。27載體種類(lèi)：（1）克隆載體：外源DNA片段在宿主細(xì)胞中復(fù)制、拷貝增多。質(zhì)粒

λ噬菌體粘粒細(xì)菌人工染色體酵母人工染色體（2）表達(dá)載體：外源DNA片段或基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。281、質(zhì)粒（plasmid）獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子。29具備特點(diǎn)：片段較小，多克隆位點(diǎn)，抗性基因，復(fù)制起始點(diǎn)302、λ噬菌體（λphage）

一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒，可高效感染大腸桿菌。

COS序列：5′末端12bp突出的互補(bǔ)粘末端，進(jìn)入宿主細(xì)胞后配對(duì)環(huán)化。3132

置換λ載體：33

插入λ載體：343、粘粒（cosmid）將質(zhì)粒和λ噬菌體改造的載體，改造后含λ噬菌體的COS序列以及質(zhì)粒特性354、細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）

抗生素抗性標(biāo)記復(fù)制子oriS

解旋酶（RepE）確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA,parB，parC等）365、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）

著絲粒端粒

自主復(fù)制序列元件37物理圖第一代物理圖譜：由酵母人工染色體構(gòu)建的疊連群第二代物理圖譜：由細(xì)菌人工染色體與P1人工染色體

克隆疊連群38序列圖是人類(lèi)基因組的核苷酸序列圖，也是分子水平的最高層次和最精確的物理圖。是指核苷酸在每條染色體上從一個(gè)末端經(jīng)著絲粒到另一末端的精確次序。只有測(cè)序完成才能繪制出全基因組30億堿基分布于每條染色體上正確順序的序列圖。3940四、遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)相互影響4.人類(lèi)基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)41測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

Sanger測(cè)序↓

焦磷酸測(cè)序↓

Next-generationsequencing

42雙脫氧鏈終止法（Sanger測(cè)序）：

磷酸二酯鍵43444546474849焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）Pyrosequencing技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（PPi）。

PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成。50焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）第1步：

1個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物（包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。51焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）第2步：

向反應(yīng)體系中加入1種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3‘末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸（PPi）。52焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）第3步：

在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見(jiàn)光。通過(guò)CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。53焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）54第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）55焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）第5步：

加入另一種dNTP，使第2~4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。Next-generationsequencing

57Next-generationsequencing

第三代測(cè)序

5960在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。（1）獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄/人工合成cDNA（EST）（2）以EST為探針，進(jìn)行雜交（3）鑒定轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因基因圖62三、進(jìn)程2000年6月，完成人類(lèi)基因組的框架圖（工作草圖）63三、進(jìn)程2003年4月，完成人類(lèi)基因組DNA的關(guān)鍵序列圖64三、進(jìn)程2006年5月，完成人類(lèi)最后1條染色體——1號(hào)染色體的測(cè)序65中國(guó)對(duì)基因組研究的主要貢獻(xiàn)

1999年加入HGP3號(hào)染色體短臂末端30萬(wàn)bp

完成人類(lèi)基因組關(guān)鍵序列圖的六國(guó)之一

水稻基因組框架圖

2007年10月，“炎黃一號(hào)”人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃（HapMap）黑猩猩基因組序列66人與黑猩猩的基因組只有1.32％的差別黑猩猩的Chr22＝人的Chr21中國(guó)對(duì)基