掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件

第四章沉淀分離技術(shù)第四章沉淀分離技術(shù)1鹽析有機(jī)溶劑沉析等電點(diǎn)沉析有機(jī)聚合物沉析其他沉析技術(shù)鹽析2一、鹽析原理溶液加入高濃度中性鹽后，鹽離子與生物分子表面的帶相反電荷的離子基團(tuán)結(jié)合，中和了生物分子表面的電荷，降低了生物分子與水分子之間的相互作用，生物分子表面水化膜逐漸被破壞，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的限度時(shí)，生物分子之間的排斥力降到很小，此時(shí)生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，從而形成沉淀從溶液中析出。產(chǎn)生鹽析的另一個(gè)原因是大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使生物分子脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀析出。掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件3影響鹽析的因素（一）鹽離子濃度在低鹽濃度時(shí)，鹽離子能增加生物分子表面電荷，使生物分子水合作用增強(qiáng)，具有促進(jìn)溶解的作用，稱鹽溶現(xiàn)象。當(dāng)鹽濃度達(dá)一定值后,鹽濃度升高，生物分子溶解度不斷降低,產(chǎn)生了鹽析作用,不同的生物分子，“鹽溶”與“鹽析”的分界值不同。影響鹽析的因素4（二）生物分子種類生物分子的分子結(jié)構(gòu)不同，其分子表面親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)不相同，不同生物分子產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象所需中性鹽的濃度（離子強(qiáng)度）亦不同。（三）生物分子濃度溶液中生物分子的濃度對(duì)鹽析的效果有很大的影響，要得到理想的沉析效果，必須將生物分子的濃度控制在一定的范圍內(nèi)。一般對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，其濃度為2%～3%比較合適。掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件5（四）pH值在鹽析時(shí)，如果要沉析某一成分，應(yīng)將溶液的pH值調(diào)整到該成分的等電點(diǎn)，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，則應(yīng)使溶液的pH值偏離該成分的等電點(diǎn)。（五）溫度多數(shù)物質(zhì)的溶解度會(huì)受溫度變化的影響。

掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件6鹽析的操作與應(yīng)用（一）鹽析的操作1、鹽的處理硫酸銨使用時(shí)要求純度較高，生產(chǎn)時(shí)為降低成本，一般選用化學(xué)純的硫酸銨，在使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，可通過化學(xué)法將重金屬除去（如通入H2S后過濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。2、加鹽的方法（1）直接加入固體硫酸銨法（2）加入飽和硫酸銨溶液法鹽析的操作與應(yīng)用73、鹽析操作注意事項(xiàng)（1）鹽析反應(yīng)完全需要一定時(shí)間，一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可進(jìn)行固-液分離。（2）經(jīng)過一次分級(jí)得到的鹽析沉淀，能否進(jìn)行第二次鹽析要靠試驗(yàn)確定。（3）鹽析操作時(shí)加入鹽的純度、加量、加入方法、攪拌的速度、溫度及pH等參數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制。掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件8

（4）鹽析時(shí)生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收率、鹽量和固-液分離等問題。一般低濃度硫酸銨可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因?yàn)楦邼舛攘蛩徜@密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要較高的離心速率和較長的離心時(shí)間。

（5）鹽析后溶液應(yīng)進(jìn)行脫鹽，常用的辦法有透析、凝膠過濾及超濾等。

（4）鹽析時(shí)生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收9（二）鹽析的主要應(yīng)用

鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能達(dá)到很好的分離效果。由于成本低，操作安全簡單，對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸等物質(zhì)的分離純化。

（二）鹽析的主要應(yīng)用10二、有機(jī)溶劑沉析原理（一）親水性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，使溶質(zhì)分子周圍的水化層變薄，導(dǎo)致脫水而相互聚集析出，也就是降低了溶質(zhì)的溶解度。（二）有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，加入有機(jī)溶劑后，整個(gè)溶液的介電常數(shù)降低，帶電的溶質(zhì)分子之間庫侖引力增強(qiáng)，使溶質(zhì)分子相互吸引而聚集。二、有機(jī)溶劑沉析11影響有機(jī)溶劑沉析的因素（一）溫度大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時(shí)要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過濃。溫度越低，得到的生物活性物質(zhì)越多，而且可以減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。影響有機(jī)溶劑沉析的因素12（二）生物樣品的濃度與鹽析相似，樣品濃度低時(shí)增加有機(jī)溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果。反之，對(duì)于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機(jī)溶劑，減少了變性的危險(xiǎn)，但共沉作用大，分離效果下降。一般認(rèn)為，對(duì)于蛋白質(zhì)溶液0.5%～2%起始濃度較合適,對(duì)于粘多糖以1%～2%為起始濃度為宜。（二）生物樣品的濃度13（三）pH有機(jī)溶劑沉析時(shí)適宜的pH，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點(diǎn)附近，以提高該沉析的分辨能力。但應(yīng)注意的是有少數(shù)生物分子在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定，影響其活性；同時(shí)盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生。（三）pH14（四）離子強(qiáng)度在有機(jī)溶劑和水的混合液中，當(dāng)離子強(qiáng)度很小，物質(zhì)不能沉析時(shí)，補(bǔ)加少量電解質(zhì)即可解決。鹽的濃度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量的有機(jī)溶劑來沉析，并可能使部分鹽在加入有機(jī)溶劑后析出。同時(shí)鹽的離子強(qiáng)度達(dá)一定程度時(shí)，還會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度。所以一般離子強(qiáng)度在0.05或稍低為好，既能使沉析迅速形成，又能對(duì)蛋白質(zhì)或酶起一定的保護(hù)作用，防止變性。（四）離子強(qiáng)度15（五）金屬離子在用有機(jī)溶劑沉析生物高分子時(shí)還應(yīng)注意到某些金屬離子的助沉作用，一些金屬離子如Zn2+、Ca2+等可與某些呈陰離子狀態(tài)的生物高分子形成復(fù)合物。這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機(jī)溶劑的耗量，0.005～0.02mol／L的Zn2+可使有機(jī)溶劑用量減少l／3至1／2,使用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。

（五）金屬離子16有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用（一）有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過濾比較容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。

有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用17（二）應(yīng)用

有機(jī)溶劑沉析技術(shù)經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分離。使用時(shí)先要選擇合適的有機(jī)劑，然后注意調(diào)控樣品的濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度，使之達(dá)到最佳的分離效果。沉析所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉析物，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫除有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性（二）應(yīng)用18三、等電點(diǎn)沉析等電點(diǎn)沉析原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點(diǎn)沉析技術(shù)。等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時(shí)介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時(shí)溶質(zhì)的溶解度最低三、等電點(diǎn)沉析19等電點(diǎn)沉析的注意事項(xiàng)（一）等電點(diǎn)的改變（二）目的物的穩(wěn)定性（三）鹽溶作用（四）pH的調(diào)節(jié)

等電點(diǎn)沉析的注意事項(xiàng)20等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用21有機(jī)聚合物沉析

有機(jī)聚合物沉析原理利用生物分子與某些有機(jī)聚合物形成沉淀而析出的分離技術(shù)稱為有機(jī)聚合物沉析。非離子型多聚物沉析的機(jī)理離子型多聚物沉析的機(jī)理有機(jī)聚合物沉析22有機(jī)聚合物的種類（一）水溶性非離子型聚合物（二）離子型表面活性劑聚合物（三）離子型多聚物

有機(jī)聚合物的種類23有機(jī)聚合物沉析的應(yīng)用非離子型聚合物最早在20世紀(jì)60年代時(shí)被用來沉析分離血纖維蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些細(xì)菌與病毒，近年來廣泛用于核酸和酶的分離純化。有機(jī)聚合物沉析的應(yīng)用24其他沉析技術(shù)一、金屬離子沉析（一）許多生物活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸、多肽、抗生素和有機(jī)酸等）能與金屬離子形成難溶性的復(fù)合物而沉析。（二）金屬離子沉析生物活性物質(zhì)已有廣泛的應(yīng)用，如鋅鹽可用于沉淀?xiàng)U菌肽和胰島素等，CaCO3用來沉析乳酸、枸櫞酸、人血清蛋白等。此外，該技術(shù)還能用來除去雜質(zhì)。其他沉析技術(shù)25二、有機(jī)酸沉析含氮有機(jī)酸如苦味酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但這些有機(jī)酸與蛋白質(zhì)形成鹽復(fù)合物沉析時(shí)，常常發(fā)生不可逆的沉析反應(yīng)。工業(yè)上應(yīng)用此法制備蛋白質(zhì)時(shí)，需采取較溫和的條件，有時(shí)還加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。二、有機(jī)酸沉析26三、選擇變性沉析選擇變性沉析法原理是利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，而有選擇地使之變性沉析，以達(dá)到目的物與雜蛋白分離的技術(shù)，稱為選擇變性沉析。1、選擇性熱變性2、選擇性酸堿變性3、選擇性變性劑三、選擇變性沉析27

實(shí)驗(yàn)四等電點(diǎn)沉析法分離牛乳中的酪蛋白實(shí)驗(yàn)原理

2材料用具

3操作方法

4目的要求

2155注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)四等電點(diǎn)沉析法分28目的要求學(xué)習(xí)從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。

掌握等電點(diǎn)沉析分離的基本操作技術(shù)。目的要求29原理

蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，當(dāng)其溶液在某一pH值時(shí)，這些生物大分子的所帶的正負(fù)電荷數(shù)目相等而呈電中性，此時(shí)溶液的pH值稱為該物質(zhì)的等電點(diǎn)。生物大分子在其等電點(diǎn)的溶液中，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，一般疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)可用此法分離原理蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，30材料用具

鮮牛奶醋酸鈉、優(yōu)級(jí)純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液其配制如下：①配A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液，稱NaAc·H2O5.44g溶至200ml。②配B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu)級(jí)純醋酸2.4g溶至200ml。③取A液約17.7ml，B液約12.3ml混合，用酸度計(jì)調(diào)得pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml。材料用具醋酸鈉、優(yōu)級(jí)純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.31等電點(diǎn)沉析制備酪蛋白

1、將鮮牛奶30ml及醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml分別水浴加熱40℃左右。并用8層紗布過濾牛奶。2、量取加熱后的牛奶20ml。在攪拌下慢慢加入加熱后的醋酸-醋酸鈉緩沖液20ml。用酸度計(jì)調(diào)pH至4.7。3、將上述混合液冷至室溫，離心（3500r/min）15min，棄去上清液，得酪蛋白粗制品。4、用水洗沉淀3次，離心（3500r/min）10min，棄去上清液

操作方法等1、將鮮牛奶30ml及醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml分別水32等電點(diǎn)沉析制備酪蛋白5、在沉淀中加入20ml乙醇，攪拌片刻。將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。6、將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干得酪蛋白純品。7、準(zhǔn)確稱量，計(jì)算含量和收率。含量=酪蛋白g/100mL牛乳操作方法測(cè)得含量理論含量收率=×100%式中理論含量為3.5g/100mL牛乳等5、在沉淀中加入20ml乙醇，攪拌片刻。將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移33注意事項(xiàng)1、醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制應(yīng)規(guī)范，pH值應(yīng)用酸度計(jì)測(cè)試，以準(zhǔn)確達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)。2、加入醋酸-醋酸鈉緩沖液時(shí)，動(dòng)作要緩慢，并慢慢加入，不可操之過急而大量一次加入。3、離心前溫度一定要降至室溫。注意事項(xiàng)2、加入醋酸-醋酸鈉緩沖液時(shí)，動(dòng)作要緩慢，并慢慢加入34思考

題1、為何用醋酸-醋酸鈉緩沖液來調(diào)酪蛋白的等電點(diǎn)，可否改用酸或堿來？2、如何提高酪蛋白的收率？

思考題1、為何用醋酸-醋酸鈉緩沖液來調(diào)酪蛋白的等35

實(shí)驗(yàn)五乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠實(shí)驗(yàn)原理

2材料用具

3操作方法

4目的要求

2155注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)五乙醇沉析法36目的要求掌握機(jī)械破碎法及酸堿法從柑橘皮制得果膠粗提液方法。

取得滅酶、提取溫度及PH控制等最佳操作技術(shù)參數(shù)。目的要求37原理

果膠是植物膠，屬于多糖類，存在于高等植物的葉、莖、根的細(xì)胞壁內(nèi)，與細(xì)胞彼此粘合在一起，尤其是果實(shí)及葉的含量較多；也是一種親水的植物膠，能溶于20倍水中生成粘稠溶液，不溶于乙醇及一般有機(jī)溶劑，在酸性條件下穩(wěn)定。由于其水溶液在適當(dāng)?shù)臈l件下可以形成凝膠，具有良好的膠凝化和乳化作用，因此可用于制造果醬、果凍或膠狀食物，也可用作食品添加劑、微生物培養(yǎng)基及保護(hù)劑等。原理果膠是植物膠，屬于多糖類，存在于高等植物的葉、38材料用具

新鮮柑橘皮50g正磷酸、0.2mol／L鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四鈉）。組織搗碎機(jī)、大燒杯（≥500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計(jì)、不銹鋼鍋。材料用具正磷酸、0.2mol／L鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四39分離將提取液加入1％的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機(jī)。過濾后得無色透明的果膠稀溶液，濾渣棄去。操作方法將提取液加入1％的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機(jī)。過40濃縮將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75℃溫度下濃縮，直至濃縮到果膠濃度為4％左右。操作方法將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75℃溫度下濃縮，41沉析將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至已濃縮好的果膠溶液中，乙醇含量控制在40％～50％的范圍內(nèi)，不斷攪動(dòng)。這時(shí)，果膠聚結(jié)成海綿狀析出。

操作方法將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至42分離將果膠—乙醇混合物經(jīng)1～2h靜置后，送入板框壓濾機(jī)過濾。收集濾餅(果膠)，然后用80％乙醇溶液洗滌濾餅1～2次，再用95％的乙醇洗滌1～2次。洗完后壓干。操作方法將果膠—乙醇混合物經(jīng)1～2h靜置后，送入板框壓濾機(jī)過濾。43干燥將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果膠純品。操作方法將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果44注意事項(xiàng)1、提取溫度溫度過高容易引起果膠解聚，降低果膠膠凝能力。溫度過低，則會(huì)延長萃取時(shí)間，造成果膠過分脫脂，一般以75℃～82℃為宜。提取時(shí)間時(shí)間短，提取不完全；時(shí)間過長，則會(huì)引起果膠降解，難以得到高質(zhì)量的果膠。提取時(shí)間以40min～60min為宜。2、提取的pH值pH值高，獲得果膠的膠凝能力強(qiáng)，但果膠收率低，當(dāng)pH值大于3.5時(shí)，就很難得到果膠。pH值低，果膠收率提高，但質(zhì)量下降。在提取過程中，體系的pH值會(huì)發(fā)生變化，要經(jīng)常用試紙檢測(cè)溶液的pH值，要使之保持穩(wěn)定，以保證提取正常進(jìn)行。注意事項(xiàng)45注意事項(xiàng)3、脫色及醇洗滅酶后的柑橘皮水洗脫色及進(jìn)行分離操作時(shí)助濾劑的使用都有一定的脫色作用。脫色處理要徹底及最后的高濃度乙醇洗滌果膠濾餅時(shí)要充分，否則影響所得果膠純品色澤及含量。注意事項(xiàng)46思考

題1、柑橘皮預(yù)處理時(shí)為何要加熱至沸而滅酶？2、如何提高果膠的收率和質(zhì)量？3、提取時(shí)加入焦磷酸鈉的作用？思考題1、柑橘皮預(yù)處理時(shí)為何要加熱至沸而滅酶？47

實(shí)驗(yàn)六硫酸銨分級(jí)鹽析分離血清中的主要蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理

2材料用具

3操作方法

4目的要求

2155注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)六硫酸銨分級(jí)48目的要求了解鹽析法分離血清中的主要蛋白質(zhì)的基本原理；

掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)目的要求49原理

鹽析是最常用分離蛋白質(zhì)的方法，是利用各種蛋白質(zhì)所帶電荷不同、相對(duì)分子質(zhì)量不同，從而在高濃度的鹽溶液中溶解度就不同，因此一個(gè)含有幾種蛋白質(zhì)的混合液，就可用不同濃度的中性鹽來使其中各種蛋白質(zhì)先后分別沉析下來，達(dá)到分離純化的目的，這種方法稱為分級(jí)鹽析。一般粗提取物常用它進(jìn)行粗分離。常用的鹽析劑有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉等，其中最常用的是硫酸銨。用鹽析法分離蛋白質(zhì)，簡便安全，而且所得的蛋白質(zhì)并不喪失活性，是分離純化中最佳的一種方法。原理鹽析是最常用分離蛋白質(zhì)的方法，是利用各種蛋50材料用具

新鮮動(dòng)物血漿或血清（無溶血現(xiàn)象）：100ml離心機(jī)、大燒杯（≥500ml）、燒杯（250ml）、高精度pH試紙、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。pH7.2飽和硫酸銨溶液0.2mol/LpH7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）。材料用具新鮮動(dòng)物血漿或血清（無溶血現(xiàn)象）：100ml離心51清蛋白與球蛋白分離1、取100ml血漿或血清置于500ml燒杯中，加PBS100ml攪拌10min。2、在攪拌下慢慢滴加200mlpH7.2飽和硫酸銨溶液。3、加完飽和硫酸銨溶液后繼續(xù)攪拌20~30min以充分沉淀球蛋白。4、離心（3500r/min）20min，棄去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各種球蛋白。操作方法清1、取100ml血漿或血清置于500ml燒杯中，加PBS52各種球蛋白的分離1、用100mlPBS溶解上述沉淀中的各種球蛋白，并轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中攪拌15min。2、在攪拌下，慢慢滴加25ml飽和硫酸銨溶液，飽和度達(dá)20%。3、離心（3500r/min）20min，沉淀含少量纖維蛋白質(zhì)，取上清液4、上清液在攪拌下，慢慢滴加18ml～25ml飽和硫酸銨溶液，飽和度達(dá)30%～33%。5、離心（3500r/min）20min得上清液和沉淀（主要含γ-球蛋白和少量β-球蛋白）。操作方法各1、用100mlPBS溶解上述沉淀中的各種球蛋白，并轉(zhuǎn)移53各種球蛋白的分離6、取5中沉淀溶于PBS中使體積達(dá)100ml并轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中攪拌15min。7、在攪拌下，慢慢滴加43ml～50ml飽和硫酸銨溶液，約達(dá)30%～33%飽和度。8、離心（3500r/min）20min得上清液（含β-球蛋白）和沉淀（主要含γ-球蛋白）。9、取5中上清液在攪拌下，慢慢滴加35ml～40ml飽和硫酸銨溶液，飽和度約達(dá)45%。10、離心（3500r/min）20min得上清液（主要為α-球蛋白）和沉淀（主要為β-球蛋白）。操作方法各6、取5中沉淀溶于PBS中使體積達(dá)100ml并轉(zhuǎn)移至25054注意事項(xiàng)1、緩沖液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。2、滴加飽和硫酸銨溶液的速度要慢一些及攪拌的速度應(yīng)適中。3、加完硫酸銨溶液后要靜置一段時(shí)間，至少20min～30min，使沉淀完全。注意事項(xiàng)3、加完硫酸銨溶液后要靜置一段時(shí)間，至少20min55思考

題為什么所用離心管等器皿必須滅菌？蔗糖密度梯度在離心中起什么作用？思考題為什么所用離心管等器皿必須滅菌？56第四章沉淀分離技術(shù)第四章沉淀分離技術(shù)57鹽析有機(jī)溶劑沉析等電點(diǎn)沉析有機(jī)聚合物沉析其他沉析技術(shù)鹽析58一、鹽析原理溶液加入高濃度中性鹽后，鹽離子與生物分子表面的帶相反電荷的離子基團(tuán)結(jié)合，中和了生物分子表面的電荷，降低了生物分子與水分子之間的相互作用，生物分子表面水化膜逐漸被破壞，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的限度時(shí)，生物分子之間的排斥力降到很小，此時(shí)生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，從而形成沉淀從溶液中析出。產(chǎn)生鹽析的另一個(gè)原因是大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使生物分子脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀析出。掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件59影響鹽析的因素（一）鹽離子濃度在低鹽濃度時(shí)，鹽離子能增加生物分子表面電荷，使生物分子水合作用增強(qiáng)，具有促進(jìn)溶解的作用，稱鹽溶現(xiàn)象。當(dāng)鹽濃度達(dá)一定值后,鹽濃度升高，生物分子溶解度不斷降低,產(chǎn)生了鹽析作用,不同的生物分子，“鹽溶”與“鹽析”的分界值不同。影響鹽析的因素60（二）生物分子種類生物分子的分子結(jié)構(gòu)不同，其分子表面親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)不相同，不同生物分子產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象所需中性鹽的濃度（離子強(qiáng)度）亦不同。（三）生物分子濃度溶液中生物分子的濃度對(duì)鹽析的效果有很大的影響，要得到理想的沉析效果，必須將生物分子的濃度控制在一定的范圍內(nèi)。一般對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，其濃度為2%～3%比較合適。掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件61（四）pH值在鹽析時(shí)，如果要沉析某一成分，應(yīng)將溶液的pH值調(diào)整到該成分的等電點(diǎn)，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，則應(yīng)使溶液的pH值偏離該成分的等電點(diǎn)。（五）溫度多數(shù)物質(zhì)的溶解度會(huì)受溫度變化的影響。

掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件62鹽析的操作與應(yīng)用（一）鹽析的操作1、鹽的處理硫酸銨使用時(shí)要求純度較高，生產(chǎn)時(shí)為降低成本，一般選用化學(xué)純的硫酸銨，在使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，可通過化學(xué)法將重金屬除去（如通入H2S后過濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。2、加鹽的方法（1）直接加入固體硫酸銨法（2）加入飽和硫酸銨溶液法鹽析的操作與應(yīng)用633、鹽析操作注意事項(xiàng)（1）鹽析反應(yīng)完全需要一定時(shí)間，一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可進(jìn)行固-液分離。（2）經(jīng)過一次分級(jí)得到的鹽析沉淀，能否進(jìn)行第二次鹽析要靠試驗(yàn)確定。（3）鹽析操作時(shí)加入鹽的純度、加量、加入方法、攪拌的速度、溫度及pH等參數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制。掌握硫酸銨分級(jí)鹽析的基本操作技術(shù)原理課件64

（4）鹽析時(shí)生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收率、鹽量和固-液分離等問題。一般低濃度硫酸銨可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因?yàn)楦邼舛攘蛩徜@密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要較高的離心速率和較長的離心時(shí)間。

（5）鹽析后溶液應(yīng)進(jìn)行脫鹽，常用的辦法有透析、凝膠過濾及超濾等。

（4）鹽析時(shí)生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收65（二）鹽析的主要應(yīng)用

鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能達(dá)到很好的分離效果。由于成本低，操作安全簡單，對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸等物質(zhì)的分離純化。

（二）鹽析的主要應(yīng)用66二、有機(jī)溶劑沉析原理（一）親水性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，使溶質(zhì)分子周圍的水化層變薄，導(dǎo)致脫水而相互聚集析出，也就是降低了溶質(zhì)的溶解度。（二）有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，加入有機(jī)溶劑后，整個(gè)溶液的介電常數(shù)降低，帶電的溶質(zhì)分子之間庫侖引力增強(qiáng)，使溶質(zhì)分子相互吸引而聚集。二、有機(jī)溶劑沉析67影響有機(jī)溶劑沉析的因素（一）溫度大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時(shí)要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過濃。溫度越低，得到的生物活性物質(zhì)越多，而且可以減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。影響有機(jī)溶劑沉析的因素68（二）生物樣品的濃度與鹽析相似，樣品濃度低時(shí)增加有機(jī)溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果。反之，對(duì)于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機(jī)溶劑，減少了變性的危險(xiǎn)，但共沉作用大，分離效果下降。一般認(rèn)為，對(duì)于蛋白質(zhì)溶液0.5%～2%起始濃度較合適,對(duì)于粘多糖以1%～2%為起始濃度為宜。（二）生物樣品的濃度69（三）pH有機(jī)溶劑沉析時(shí)適宜的pH，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點(diǎn)附近，以提高該沉析的分辨能力。但應(yīng)注意的是有少數(shù)生物分子在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定，影響其活性；同時(shí)盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生。（三）pH70（四）離子強(qiáng)度在有機(jī)溶劑和水的混合液中，當(dāng)離子強(qiáng)度很小，物質(zhì)不能沉析時(shí)，補(bǔ)加少量電解質(zhì)即可解決。鹽的濃度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量的有機(jī)溶劑來沉析，并可能使部分鹽在加入有機(jī)溶劑后析出。同時(shí)鹽的離子強(qiáng)度達(dá)一定程度時(shí)，還會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度。所以一般離子強(qiáng)度在0.05或稍低為好，既能使沉析迅速形成，又能對(duì)蛋白質(zhì)或酶起一定的保護(hù)作用，防止變性。（四）離子強(qiáng)度71（五）金屬離子在用有機(jī)溶劑沉析生物高分子時(shí)還應(yīng)注意到某些金屬離子的助沉作用，一些金屬離子如Zn2+、Ca2+等可與某些呈陰離子狀態(tài)的生物高分子形成復(fù)合物。這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機(jī)溶劑的耗量，0.005～0.02mol／L的Zn2+可使有機(jī)溶劑用量減少l／3至1／2,使用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。

（五）金屬離子72有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用（一）有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過濾比較容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。

有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用73（二）應(yīng)用

有機(jī)溶劑沉析技術(shù)經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分離。使用時(shí)先要選擇合適的有機(jī)劑，然后注意調(diào)控樣品的濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度，使之達(dá)到最佳的分離效果。沉析所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉析物，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫除有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性（二）應(yīng)用74三、等電點(diǎn)沉析等電點(diǎn)沉析原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點(diǎn)沉析技術(shù)。等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時(shí)介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時(shí)溶質(zhì)的溶解度最低三、等電點(diǎn)沉析75等電點(diǎn)沉析的注意事項(xiàng)（一）等電點(diǎn)的改變（二）目的物的穩(wěn)定性（三）鹽溶作用（四）pH的調(diào)節(jié)

等電點(diǎn)沉析的注意事項(xiàng)76等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用77有機(jī)聚合物沉析

有機(jī)聚合物沉析原理利用生物分子與某些有機(jī)聚合物形成沉淀而析出的分離技術(shù)稱為有機(jī)聚合物沉析。非離子型多聚物沉析的機(jī)理離子型多聚物沉析的機(jī)理有機(jī)聚合物沉析78有機(jī)聚合物的種類（一）水溶性非離子型聚合物（二）離子型表面活性劑聚合物（三）離子型多聚物

有機(jī)聚合物的種類79有機(jī)聚合物沉析的應(yīng)用非離子型聚合物最早在20世紀(jì)60年代時(shí)被用來沉析分離血纖維蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些細(xì)菌與病毒，近年來廣泛用于核酸和酶的分離純化。有機(jī)聚合物沉析的應(yīng)用80其他沉析技術(shù)一、金屬離子沉析（一）許多生物活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸、多肽、抗生素和有機(jī)酸等）能與金屬離子形成難溶性的復(fù)合物而沉析。（二）金屬離子沉析生物活性物質(zhì)已有廣泛的應(yīng)用，如鋅鹽可用于沉淀?xiàng)U菌肽和胰島素等，CaCO3用來沉析乳酸、枸櫞酸、人血清蛋白等。此外，該技術(shù)還能用來除去雜質(zhì)。其他沉析技術(shù)81二、有機(jī)酸沉析含氮有機(jī)酸如苦味酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但這些有機(jī)酸與蛋白質(zhì)形成鹽復(fù)合物沉析時(shí)，常常發(fā)生不可逆的沉析反應(yīng)。工業(yè)上應(yīng)用此法制備蛋白質(zhì)時(shí)，需采取較溫和的條件，有時(shí)還加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。二、有機(jī)酸沉析82三、選擇變性沉析選擇變性沉析法原理是利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，而有選擇地使之變性沉析，以達(dá)到目的物與雜蛋白分離的技術(shù)，稱為選擇變性沉析。1、選擇性熱變性2、選擇性酸堿變性3、選擇性變性劑三、選擇變性沉析83

實(shí)驗(yàn)四等電點(diǎn)沉析法分離牛乳中的酪蛋白實(shí)驗(yàn)原理

2材料用具

3操作方法

4目的要求

2155注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)四等電點(diǎn)沉析法分84目的要求學(xué)習(xí)從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。

掌握等電點(diǎn)沉析分離的基本操作技術(shù)。目的要求85原理

蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，當(dāng)其溶液在某一pH值時(shí)，這些生物大分子的所帶的正負(fù)電荷數(shù)目相等而呈電中性，此時(shí)溶液的pH值稱為該物質(zhì)的等電點(diǎn)。生物大分子在其等電點(diǎn)的溶液中，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，一般疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)可用此法分離原理蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，86材料用具

鮮牛奶醋酸鈉、優(yōu)級(jí)純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液其配制如下：①配A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液，稱NaAc·H2O5.44g溶至200ml。②配B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu)級(jí)純醋酸2.4g溶至200ml。③取A液約17.7ml，B液約12.3ml混合，用酸度計(jì)調(diào)得pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml。材料用具醋酸鈉、優(yōu)級(jí)純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.87等電點(diǎn)沉析制備酪蛋白

1、將鮮牛奶30ml及醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml分別水浴加熱40℃左右。并用8層紗布過濾牛奶。2、量取加熱后的牛奶20ml。在攪拌下慢慢加入加熱后的醋酸-醋酸鈉緩沖液20ml。用酸度計(jì)調(diào)pH至4.7。3、將上述混合液冷至室溫，離心（3500r/min）15min，棄去上清液，得酪蛋白粗制品。4、用水洗沉淀3次，離心（3500r/min）10min，棄去上清液

操作方法等1、將鮮牛奶30ml及醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml分別水88等電點(diǎn)沉析制備酪蛋白5、在沉淀中加入20ml乙醇，攪拌片刻。將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。6、將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干得酪蛋白純品。7、準(zhǔn)確稱量，計(jì)算含量和收率。含量=酪蛋白g/100mL牛乳操作方法測(cè)得含量理論含量收率=×100%式中理論含量為3.5g/100mL牛乳等5、在沉淀中加入20ml乙醇，攪拌片刻。將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移89注意事項(xiàng)1、醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制應(yīng)規(guī)范，pH值應(yīng)用酸度計(jì)測(cè)試，以準(zhǔn)確達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)。2、加入醋酸-醋酸鈉緩沖液時(shí)，動(dòng)作要緩慢，并慢慢加入，不可操之過急而大量一次加入。3、離心前溫度一定要降至室溫。注意事項(xiàng)2、加入醋酸-醋酸鈉緩沖液時(shí)，動(dòng)作要緩慢，并慢慢加入90思考

題1、為何用醋酸-醋酸鈉緩沖液來調(diào)酪蛋白的等電點(diǎn)，可否改用酸或堿來？2、如何提高酪蛋白的收率？

思考題1、為何用醋酸-醋酸鈉緩沖液來調(diào)酪蛋白的等91

實(shí)驗(yàn)五乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠實(shí)驗(yàn)原理

2材料用具

3操作方法

4目的要求

2155注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)五乙醇沉析法92目的要求掌握機(jī)械破碎法及酸堿法從柑橘皮制得果膠粗提液方法。

取得滅酶、提取溫度及PH控制等最佳操作技術(shù)參數(shù)。目的要求93原理

果膠是植物膠，屬于多糖類，存在于高等植物的葉、莖、根的細(xì)胞壁內(nèi)，與細(xì)胞彼此粘合在一起，尤其是果實(shí)及葉的含量較多；也是一種親水的植物膠，能溶于20倍水中生成粘稠溶液，不溶于乙醇及一般有機(jī)溶劑，在酸性條件下穩(wěn)定。由于其水溶液在適當(dāng)?shù)臈l件下可以形成凝膠，具有良好的膠凝化和乳化作用，因此可用于制造果醬、果凍或膠狀食物，也可用作食品添加劑、微生物培養(yǎng)基及保護(hù)劑等。原理果膠是植物膠，屬于多糖類，存在于高等植物的葉、94材料用具

新鮮柑橘皮50g正磷酸、0.2mol／L鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四鈉）。組織搗碎機(jī)、大燒杯（≥500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計(jì)、不銹鋼鍋。材料用具正磷酸、0.2mol／L鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四95分離將提取液加入1％的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機(jī)。過濾后得無色透明的果膠稀溶液，濾渣棄去。操作方法將提取液加入1％的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機(jī)。過96濃縮將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75℃溫度下濃縮，直至濃縮到果膠濃度為4％左右。操作方法將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75℃溫度下濃縮，97沉析將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至已濃縮好的果膠溶液中，乙醇含量控制在40％～50％的范圍內(nèi)，不斷攪動(dòng)。這時(shí)，果膠聚結(jié)成海綿狀析出。

操作方法將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至98分離將果膠—乙醇混合物經(jīng)1～2h靜置后，送入板框壓濾機(jī)過濾。收集濾餅(果膠)，然后用80％乙醇溶液洗滌濾餅1～2次，再用95％的乙醇洗滌1～2次。洗完后壓干。操作方法將果膠—乙醇混合物經(jīng)1～2h靜置后，送入板框壓濾機(jī)過濾。99干燥將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果膠純品。操作方法將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果100注意事項(xiàng)1、提取溫度溫度過高容易引起果膠解聚，降低果膠膠凝能力。溫度過低，則會(huì)延長萃取時(shí)間，造成果膠過分脫脂，一般以75℃～82℃為宜。提取時(shí)間時(shí)間短，提取不完全；時(shí)間過長，則會(huì)引起果膠降解，難以得到高質(zhì)量的果膠。提取時(shí)間以40min～60min為宜。2、提取的pH值pH值高，獲得果膠的膠凝能力強(qiáng)，但果膠收率低，當(dāng)pH值大于3.5時(shí)，就很難得到果膠。pH值低，果膠收率提高，但質(zhì)量下降。在提取過程中，體系的pH值會(huì)發(fā)生變化，要經(jīng)常用試紙檢測(cè)溶液的pH值，要使之保持穩(wěn)定，以保證