發(fā)酵過程中工藝參數(shù)檢測和控制張

第七章發(fā)酵過程中工藝參數(shù)的

檢測和控制發(fā)酵的一般流程種子擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基配制空氣除菌培養(yǎng)基滅菌發(fā)酵生產(chǎn)下游處理發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵生產(chǎn)水平取決于菌種生產(chǎn)性能生產(chǎn)代謝環(huán)境條件檢測和控制發(fā)酵工藝控制即為檢測控制發(fā)酵生產(chǎn)過程環(huán)境條件以達(dá)到代謝產(chǎn)物高產(chǎn)量。第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵的主要類型一、按投料方式分分批、連續(xù)培養(yǎng)、補(bǔ)料分批二、按菌體生長與產(chǎn)物形成關(guān)系分生長關(guān)聯(lián)型、生長部分關(guān)聯(lián)型、生長無關(guān)聯(lián)型（一）分批發(fā)酵法(batchfermentation)

分批發(fā)酵又稱分批培養(yǎng)，發(fā)酵工業(yè)中常見的分批發(fā)酵方法是采用單罐深層分批發(fā)酵法。每一個(gè)分批發(fā)酵過程都經(jīng)歷接種、生長繁殖、菌體衰老進(jìn)而結(jié)束發(fā)酵，最終提取出產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、染菌機(jī)會(huì)小，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制缺點(diǎn)：前期營養(yǎng)多抑止菌體生長、后期營養(yǎng)缺乏降低產(chǎn)物生成（二）連續(xù)發(fā)酵法(continuousfermentation)

在發(fā)酵罐中一方面以一定速度連續(xù)不斷地流加新鮮液體培養(yǎng)基，另一方面又以同樣的速度連續(xù)不斷地將發(fā)酵液排出，使發(fā)酵罐中的菌體進(jìn)行連續(xù)生長和發(fā)酵。

優(yōu)點(diǎn)：操作條件穩(wěn)定、易于自動(dòng)化控制優(yōu)化、設(shè)備利用率高、配件使用壽命長缺點(diǎn)：發(fā)酵周期長、易于染菌、菌種易變異、設(shè)備要求高、菌體易掛壁和結(jié)團(tuán)（三）補(bǔ)料分批發(fā)酵法(fed-batchfermentation)

補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法?！钆c分批發(fā)酵相比，解除營養(yǎng)無抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng)；與連續(xù)發(fā)酵相比，它不會(huì)產(chǎn)物菌種老化和變異；生長關(guān)聯(lián)型生長部分關(guān)聯(lián)型生長無關(guān)聯(lián)型---產(chǎn)物生成與細(xì)胞生長的關(guān)系（a）與生長相關(guān)聯(lián)；（b）與生長部分相關(guān)聯(lián)；（c）與生長不相關(guān)聯(lián)類型產(chǎn)物生成與菌體生長的關(guān)系特點(diǎn)生長關(guān)聯(lián)型成正比菌體生長與產(chǎn)物生成同步進(jìn)行生長部分關(guān)聯(lián)型第一階段無關(guān)第二階段成正比分階段，先菌體生長，再產(chǎn)物生成且于菌體生長正相關(guān)生長無關(guān)聯(lián)型無關(guān)分階段，先菌體生長，再產(chǎn)物生成第二節(jié)

發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)一、物理參數(shù)

1．

溫度：與菌體生長，氧的溶解、產(chǎn)物合成都有關(guān)。①如四環(huán)素生產(chǎn)菌在30℃時(shí)合成金霉素，35℃時(shí)，只產(chǎn)生四環(huán)素，合成方向會(huì)改變。②生長溫度與合成溫度不同。如青霉素，生長30℃，合成24.7℃。

2．

壓力（Pa，帕斯卡）。

罐內(nèi)維持壓力。維持正壓避免污染；影響的氧的溶解度98070Pa=1Kg/cm2

1Mpa﹦103Kpa=106Pa。

滅菌壓力1Kg/cm2=0.11Mpa。

發(fā)酵罐壓一般為0.02~0.05Mpa。

3．?dāng)嚢柁D(zhuǎn)速（r/min）。

與氧的溶解相關(guān)。罐體積

轉(zhuǎn)速（r/min）通風(fēng)量（m3/m3.min

）

50L5501：0.650000L1101：0.12一般來說，假如小罐與大罐的幾何相同。但為什么轉(zhuǎn)速會(huì)相差這么大？原因大罐氣液接觸時(shí)間長，氧的溶解率高，攪拌和通氣均可小些，

4．?dāng)嚢韫β剩↘W）P/VKW/m3

攪拌器攪拌時(shí)所消耗的功率。與氧的傳遞有關(guān)。生產(chǎn)上：一般用瓦特計(jì)直接測量電動(dòng)機(jī)的耗用功率，從中減去各項(xiàng)傳動(dòng)摩擦所損耗的功率。對小罐，誤差較大。用電阻應(yīng)變式動(dòng)力計(jì)測量。

5．

通氣量（V/V.min）指每分鐘每單位體積發(fā)酵液通進(jìn)的空氣體積。與溶氧相關(guān)。氣體流量用轉(zhuǎn)子流量計(jì)測量。6．粘度

Pa·s(秒）

Pa=1N/m2

是細(xì)胞生長和細(xì)胞形態(tài)的一項(xiàng)標(biāo)志，它的大小可影響氧傳遞的阻力，又可表示相對菌體的濃度。用黏度測定儀測定。

7．料液流量（L/min)

控制進(jìn)料的參數(shù)。用流量計(jì)測定。

二、化學(xué)參數(shù)1．

PH：發(fā)酵過程中產(chǎn)酸或產(chǎn)堿的生化反應(yīng)的綜合結(jié)果。與菌體生長、產(chǎn)物合成有關(guān)。pH計(jì)測定。2．

基質(zhì)濃度：指營養(yǎng)成分的濃度，發(fā)酵過程中必須定時(shí)測定還原糖，總糖，磷酸鹽、氮（氨基酸或氨氮）等基質(zhì)的濃度。與菌體生長、產(chǎn)物合成有關(guān)。在線或離線檢測。3．

溶解氧濃度（DO）：mmol/L,mg/L,ppm或用%（指飽和濃度的百分?jǐn)?shù)）表示。利用它的變化可了解生產(chǎn)菌對氧利用的規(guī)律也能反映發(fā)酵的異常情況。在線電極檢測4．

產(chǎn)物的濃度：監(jiān)測發(fā)酵是否正常。常離線檢測。6．

廢氣中氧和二氧化碳的濃度：監(jiān)測生產(chǎn)菌的攝氧率、呼吸熵和發(fā)酵罐的供氧能力。用順磁氧分析儀測定氧氣的濃度，用紅外二氧化碳分析儀測定二氧化碳濃度。5．

氧化還原電位（mv)

影響微生物的生長。在線檢測電極三、生物參數(shù)1.菌體形態(tài)：觀察菌體形態(tài)是生產(chǎn)中最常用的方法。用于衡量種子質(zhì)量區(qū)分發(fā)酵階段控制發(fā)酵過程決定發(fā)酵周期能及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常染菌鏡檢如青霉素生產(chǎn)，生產(chǎn)菌生長分為I.孢子發(fā)芽，II.菌絲增殖，III.菌絲分枝旺盛，出現(xiàn)脂肪顆粒，IV.菌絲生長減緩，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小氣泡，V.氣泡增大，顆粒消失，產(chǎn)物形成，VI.氣泡延伸，菌絲自溶。2.菌體濃度：測定方法有三種：A.濕重法：量100ml發(fā)酵液，進(jìn)行過濾，濾后菌體用水洗凈，然后用吸水紙將水分?jǐn)D干，直接稱量。B.干重法：上述步驟菌絲放85℃烘干至恒重。C.體積法：取樣品10ml放于刻度離心管內(nèi)，用轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分離10min，計(jì)算%（V/V）。固體原料也在其中，但如培養(yǎng)基組成不變條件下，具有相對準(zhǔn)確性。第三節(jié)菌體濃度對發(fā)酵的影響及控制

菌體濃度單位體積發(fā)酵液中菌體的含量。影響目的產(chǎn)物的產(chǎn)率發(fā)酵液溶解氧

補(bǔ)料策略（1）對產(chǎn)物產(chǎn)率的影響對于生長關(guān)聯(lián)型，菌體濃度越大，產(chǎn)物產(chǎn)率越大對于生長部分關(guān)聯(lián)型，菌體濃度越大，營養(yǎng)成分消耗越大，導(dǎo)致分批發(fā)酵過程中第二階段由于營養(yǎng)成分不足產(chǎn)物產(chǎn)率下降（2）菌體濃度對發(fā)酵液溶解氧的影響菌體濃度增大，溶解氧降低，影響菌體生長及產(chǎn)物合成首先確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔龋苊猱a(chǎn)生過濃（或過?。┑木w量。然后通過中間補(bǔ)料來控制，如當(dāng)菌體生長緩慢、菌濃太稀時(shí)，則可補(bǔ)加一部分磷酸鹽，促進(jìn)生長，提高菌濃；但補(bǔ)加過多，則會(huì)使菌體過分生長，超過臨界濃度，對產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。菌體濃度的控制：中間補(bǔ)料控制培養(yǎng)基濃度。菌體濃度檢測方法：濁度法：分光光度計(jì)直接測定發(fā)酵液OD值干重法、濕重法、體積法基質(zhì)濃度即培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中各成分濃度。影響菌體生長產(chǎn)物合成溶解氧第四節(jié)基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響及控制

1.碳源對發(fā)酵的影響及控制迅速利用的碳源緩慢利用的碳源葡萄糖、蔗糖等迅速參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解產(chǎn)物，有利于菌體生長，但有的分解代謝產(chǎn)物對產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用；多數(shù)為聚合物，淀粉等為菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長抗生素的分泌期，也有許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。在工業(yè)上，發(fā)酵培養(yǎng)基中常采用含迅速和緩慢利用的混合碳源。2.氮源對發(fā)酵的影響及控制迅速利用的氮源緩慢利用的氮源氨基（或銨）態(tài)氮的氨基酸（或硫酸銨等）、玉米漿容易被菌體利用，促進(jìn)菌體生長，但對某些代謝產(chǎn)物的合成特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。延長代謝產(chǎn)物的分泌期、提高產(chǎn)物的產(chǎn)量；但一次投入也容易促進(jìn)菌體生長和養(yǎng)分過早耗盡，以致菌體過早衰老而自溶，縮短產(chǎn)物的分泌期。發(fā)酵培養(yǎng)基一般選用含有快速和慢速利用的混合氮源，還要在發(fā)酵過程中補(bǔ)加氮源來控制濃度。補(bǔ)加有機(jī)氮源，如酵母汁、玉米漿、尿素補(bǔ)加無機(jī)氮源，如氨水或硫酸銨3.磷酸鹽對發(fā)酵的影響及控制磷是微生物菌體生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產(chǎn)物所必需的。微生物生長良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32～300mmol/L，次級代謝產(chǎn)物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol/L.磷酸鹽濃度的控制，一般是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中采用適當(dāng)?shù)臐舛?。?）對菌體的生長基質(zhì)濃度有一定的限值P94圖7－4（2）對產(chǎn)物合成的影響高基質(zhì)濃度對產(chǎn)物合成不利（3）對溶解氧的影響高濃度降低溶解氧的傳遞基質(zhì)濃度的控制方式：中間補(bǔ)料補(bǔ)料的內(nèi)容補(bǔ)充能源和碳源補(bǔ)充氮源補(bǔ)充微量元素和無機(jī)鹽補(bǔ)充誘導(dǎo)酶的作用底物補(bǔ)料的原則：根據(jù)微生物的生長代謝與生物合成規(guī)律，控制微生物的中間代謝，使之向有利于生產(chǎn)的方向發(fā)展。通常中間補(bǔ)料的數(shù)量為基礎(chǔ)料的1-3倍。

補(bǔ)料的時(shí)間補(bǔ)料的時(shí)間很重要，有人研究加糖時(shí)間對四環(huán)素發(fā)酵單位的影響。接種20h45h62h

產(chǎn)量6000u/ml10000u/ml5000u/ml一般認(rèn)為，過早補(bǔ)糖，可能刺激菌絲生成，加速糖的利用，過遲補(bǔ)糖，可能菌絲的內(nèi)在質(zhì)量已受到一定損害，補(bǔ)糖只是干擾代謝并不能提高產(chǎn)量。補(bǔ)料方式及控制連續(xù)流加、不連續(xù)流加、多周期流加快速流加、恒速流加、指數(shù)速率流加、變速流加單組分流加、多組分流加補(bǔ)料方式流加操作控制系統(tǒng)反饋控制直接方法間接方法以溶氧、pH值、呼吸商、排氣中CO2分壓及代謝產(chǎn)物濃度等作為控制參數(shù)直接以限制性營養(yǎng)物濃度作為反饋參數(shù)，如控制氮源、碳源、C/N比等，由于目前缺乏能直接測量重要參數(shù)的傳感器，因此直接方法的使用受到了限制。補(bǔ)料的實(shí)例:如慶大霉素生產(chǎn)，大罐總體積20噸，第一次裝料7噸，接種后15h一次性補(bǔ)5噸，然后在30-60h中小量間隙多次補(bǔ)入6噸料（全料），視生長情況決定是否在80h補(bǔ)適量水?？傊芷?20-130h。第五節(jié)溶氧的濃度對發(fā)酵的影響及控制

O2在水中的溶解度很低。如在25℃，1個(gè)大氣壓下O2溶解在水中的量為0.2mmol/L，或6.4mg/L。而微生物需氧量20—50mmol/L.h，正常情況下，只能維持20—50秒鐘,水中氧消耗完。不斷向培養(yǎng)基中供應(yīng)氧氣，才能保證需氧微生物的正常代謝。一、溶解氧對發(fā)酵的影響1.對微生物生長的影響對厭氧微生物是有毒性的；對需要微生物：微生物對氧的需求：1、C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+能量從分子式看出，180g葡萄糖完全氧化需190克O2。2、構(gòu)成細(xì)胞成分含有氧，如酵母細(xì)胞元素組成為C3.95N6.5O1.94。不同微生物的需氧量不同。呼吸強(qiáng)度（Ｑo2）

mmolo2/[g（干菌體）.h]

單位重量的干菌體每小時(shí)消耗的氧量。微生物攝氧率（γ）mmolO2/（L．ｈ）單位體積培養(yǎng)液每小時(shí)消耗的氧量。兩者關(guān)系γ=Qo2.XX—發(fā)酵液中菌體密度（g/L）。微生物對發(fā)酵液中溶解氧濃度有一個(gè)最低要求，這個(gè)濃度叫臨界氧濃度。①不同微生物C臨界不同，見下表：菌種

溫度.℃C臨界（mg/L）

大腸桿菌

37.80.26

酵母菌

34.80.15

產(chǎn)黃青霉

240.7表明青霉菌攝氧率高，發(fā)酵時(shí)空氣通氣量大。②同一種菌生長不同階段C臨界不同。如幼齡菌大于老齡菌

2、溶解氧對產(chǎn)物合成的影響微生物產(chǎn)物合成存在最低溶氧濃度為產(chǎn)物合成臨界氧濃度。生長臨界氧濃度往往與產(chǎn)物合成臨界氧濃度不是同一值。二、發(fā)酵液溶解氧濃度控制—供、需平衡供氧控制氧在溶液中的傳遞N=KLa（C*—CL)式中

N——氧的傳遞速率，mmolO2/h；

C*——溶液中飽和溶氧濃度，mmolO2

／L；CL——溶液主流中的溶氧濃度，mmolO2

／L；

KL——以濃度差為推動(dòng)力的氧傳質(zhì)系數(shù)，m／h；

a——比表面積（單位體積溶液中所含有的氣液接觸面積m2／m3

）。因?yàn)閍很難測定，所以將KLa當(dāng)成一項(xiàng)，稱為液相體積氧傳遞系數(shù)，1／h氧的傳遞方程式影響C*-CL的因素：1．提高C*。

飽和濃度：氣體與液體相接觸，氣體分子就會(huì)溶解于液體之中。經(jīng)過一段時(shí)間的接觸，氣體分子在氣液兩相中的濃度就會(huì)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。溶解氧的飽和濃度（C*

）的單位可用mmolo2/L、ppm、和mgo2/L。

影響氧飽和濃度的主要因素有：溫度、氧分壓、溶液的組成不能隨意改動(dòng)氧分壓；

亨利公式：C*=H-1×Po2C*—在平衡狀態(tài)下液體中氧的溶解度（mmolo2/L）

Po2—氧分壓

MPaH—亨利常數(shù)MPa×L/mmolo2從公式中可知C*與Po2成正比。氣相中氧的濃度取決大氣壓和①純氧；②罐壓提高，Po2提高。C*增大，但不能太高，純氧也可提高。③利用吸氮裝置，減少空氣中的氮?dú)?，增加氧含量?/p>

溶液的組成：氧在不同性質(zhì)的溶液中的溶解度是不同的。同一種溶液由于其中溶質(zhì)含量不同，氧的溶解度也不同。鹽酸0.5mol1mol2mol1.211.161.12溶質(zhì)含量越高，氧的溶解度就越小。

加水稀釋培養(yǎng)基，提高溶氧2．降低發(fā)酵液中的CL

如降低通氣量和攪拌速度可降低CL，但發(fā)酵過程中發(fā)酵液的CL不能低于C臨界，否則就會(huì)影響微生物的呼吸。不可行！

影響KLa的因素?cái)嚢栊剩喊汛髿馀荽蛩椋黾託庖簝上嗟慕佑|面積，KLa增加；降低液膜厚度，KLa增加；減少菌絲結(jié)團(tuán)，減少菌周圍液膜阻力，并有利于排出廢氣；

空氣流速：KLa與空氣流速（V）有關(guān)。V增加KLa增加。但當(dāng)V增加到一定值后KLa便不增加，因存在所謂氣泛現(xiàn)象，即空氣流速過大時(shí)，氣流形成大氣泡在軸的周圍逸出。

發(fā)酵液的物理化學(xué)性質(zhì)：KLa與發(fā)酵液粘度成反比。在發(fā)酵過程中，由于粘度變化，而使發(fā)酵液呈多種流變學(xué)性質(zhì)（液體的湍動(dòng)性和液膜的阻力）。一般細(xì)菌、酵母發(fā)酵液粘度為一常數(shù)。

放線菌、霉菌粘度不是一個(gè)常數(shù)。發(fā)酵過程產(chǎn)生泡沫降低氧的傳遞速率，加消泡劑或是消泡裝置

空氣分布器和發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)：單孔分布器較好溶解氧（DO）檢測方法：在線溶氧電極檢測三、溶氧的監(jiān)測溶氧異常升高：菌體代謝能力下降，耗氧能力下降，溶氧增加；受噬菌體感染溶氧異常降低：污染好氧菌；菌體代謝異常，需氧量升高，溶氧下降；設(shè)備故障，供氧不足，溶氧下降。第六節(jié)pH值對發(fā)酵的影響及其控制一、pH值對發(fā)酵的影響影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會(huì)阻礙菌體的新陳代謝；影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄；影響培養(yǎng)基中某些組分的解離，進(jìn)而微生物對這些成分的吸收；pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。二、發(fā)酵過程pH值的變化在發(fā)酵過程中，隨著菌種對培養(yǎng)基種碳、氮源的利用，隨著有機(jī)酸和氨基酸的積累，會(huì)使pH值產(chǎn)生一定的變化。1、生長階段：菌體產(chǎn)生蛋白酶水解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，生成銨離子，使pH上升至堿性；隨著菌體量增多，銨離子的消耗也增多，另外糖利用過程中有機(jī)酸的積累使pH值下降。2、生產(chǎn)階段：這個(gè)階段pH值趨于穩(wěn)定。3、自溶階段：隨著養(yǎng)分的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使pH又上升，此時(shí)菌體趨于自溶而代謝活動(dòng)終止。pH值培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液pH值的大致變化趨勢由此可見，在適合于菌生長及合成產(chǎn)物的環(huán)境條件下，菌體本身具有一定的調(diào)節(jié)pH的能力，但是當(dāng)外界條件變化過于劇烈，菌體就失去了調(diào)節(jié)能力，培養(yǎng)液的pH就會(huì)波動(dòng)。三、引起發(fā)酵液pH值異常波動(dòng)的因素pH值的變化決定于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。1、pH下降：①培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)。碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補(bǔ)糖過多加上溶氧不足，致使有機(jī)酸大量積累而pH下降；②消泡劑加得過多；③生理酸性物質(zhì)的存在，銨被利用，pH下降。2、pH上升：①培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)。氮源過多，氨基氮釋放，使pH上升；②生理堿性物質(zhì)存在；③中間補(bǔ)料氨水活尿素等堿性物質(zhì)加入過多。四、發(fā)酵pH值的確定和控制1.發(fā)酵pH值的確定微生物發(fā)酵的最適pH值范圍一般是在5～8之間。最適pH在微生物生長和產(chǎn)物形成的關(guān)系中有四種情況。a.比生長速率（u）和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率（Qp）最適pH范圍較寬，生產(chǎn)較易控制。b.u、Qp二者一個(gè)較寬，一個(gè)較窄。c.二者都較窄，pH又相同。d.二者都較窄，pH又不同。將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成不同的出發(fā)pH值，進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，定時(shí)測定和調(diào)節(jié)pH值，以分別維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液來配制培養(yǎng)基來維持。到時(shí)觀察菌體的生長情況，以菌體生長達(dá)到最高值的pH值為菌體生長的合適pH值。用同樣的方法，可測得產(chǎn)物合成的合適pH值。同一產(chǎn)品的合適pH值，與所用的菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。在確定合適發(fā)酵pH值時(shí)，不定期要考慮培養(yǎng)溫度的影響，若溫度提供或降低，合適pH值也可能發(fā)生變動(dòng)。最適pH值是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定的。2.pH值的控制首先考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過程中的pH值變化在合適的范圍內(nèi)。在發(fā)酵過程中直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)料的方式來控制；補(bǔ)充生理酸性物質(zhì)（如(NH4)2SO4）和生理堿性物質(zhì)（如NaNO3）來控制。通過中間補(bǔ)料的方式：補(bǔ)碳源、氮源第七節(jié)溫度對發(fā)酵的影響及其控制一、溫度對發(fā)酵的影響微生物發(fā)酵所用的菌體絕大多數(shù)是中溫菌，如霉菌、放線菌和一般細(xì)菌。它們的最適生長溫度一般在20～40℃。溫度會(huì)影響各種酶反應(yīng)的速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，影響微生物的代謝調(diào)控機(jī)制。影響發(fā)酵液的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成。在發(fā)酵過程中，需要維持適當(dāng)?shù)臏囟?，才能使菌體生長和代謝產(chǎn)物的合成順利進(jìn)行。二、影響發(fā)酵溫度變化的因素產(chǎn)熱因素：生物熱（Q生物）、攪拌熱（Q攪拌）散熱因素：蒸發(fā)熱（Q蒸發(fā)）、輻射熱（Q輻射）、顯熱（Q顯）發(fā)酵熱（Q發(fā)酵）是發(fā)酵溫度變化的主要因素。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射－Q顯為了使發(fā)酵能在一定溫度下進(jìn)行，要設(shè)法進(jìn)行控制。由于Q生物、Q蒸發(fā)和Q顯，特別是Q生物在發(fā)酵過程中隨時(shí)間變化，因此發(fā)酵熱在整個(gè)發(fā)酵過程中也隨時(shí)間變化，引起發(fā)酵溫度發(fā)生波動(dòng)。三、溫度的控制最適溫度的選擇溫度的控制在生長階段，應(yīng)選擇最適生長溫度；在產(chǎn)物分泌階段，應(yīng)選擇最適生產(chǎn)溫度。發(fā)酵溫度可根據(jù)不同菌種、不同產(chǎn)品進(jìn)行選擇。工業(yè)生產(chǎn)上，所用的大發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中一般不需要加熱，因發(fā)酵中釋放了大量的發(fā)酵熱，需要冷卻的情況較多。利用自動(dòng)控制或手動(dòng)調(diào)整的閥門，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇行管中，通過熱交換來降溫，保持恒溫發(fā)酵。如果氣溫較高（特別是我國南方的夏季氣溫），冷卻水的溫度又高，致使冷卻效果很差，達(dá)不到預(yù)定的溫度，就可采用冷凍鹽水進(jìn)行循環(huán)式降溫，以迅速降到最適溫度。因此大工廠需要建立冷凍站，提高冷卻能力，以保證在正常溫度下進(jìn)行發(fā)酵。案例：

抗生素生產(chǎn)，菌的生長和合成需不同溫度。青霉素變溫發(fā)酵，起初5小時(shí)，維持在30℃，以后降到25℃培養(yǎng)35h，再降到20℃培養(yǎng)85h，最后又提高到25℃，培養(yǎng)40小時(shí)，放罐。青霉素產(chǎn)量比在25℃恒溫培養(yǎng)提高14.7%。生長的溫度和合成的溫度并不一致。第八節(jié)二氧化碳對發(fā)酵的影響及其控制一、CO2對發(fā)酵的影響二氧化碳是微生物在生長繁殖過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，同時(shí)它也是合成某些代謝產(chǎn)物的基質(zhì)。CO2效應(yīng)：發(fā)酵中CO2的濃度對微生物生長和合成代謝產(chǎn)物具有刺激或抑制作用的現(xiàn)象。CO2影響菌體的形態(tài)CO2影響發(fā)酵液的pH值影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)

CO2及HCO3-都影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。

CO2→脂質(zhì)核心部位

HCO3-→膜蛋白當(dāng)膜脂質(zhì)相中的濃度達(dá)到臨界值時(shí)，膜的流動(dòng)性及表面電荷密度就發(fā)生改變，使許多基質(zhì)的膜運(yùn)輸受到阻礙，影響細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率，導(dǎo)致細(xì)胞處于“麻醉”狀態(tài)，細(xì)胞生長受到抑制，形態(tài)改變。產(chǎn)生反饋抑制發(fā)生化學(xué)反應(yīng)CO2在發(fā)酵液中的濃度受到菌體的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液流變學(xué)特性、通氣攪拌程度、外界壓力大小、設(shè)備規(guī)模的影響。控制CO2濃度要根據(jù)它對發(fā)酵影響的情況來定。二、CO2濃度的控制通氣攪拌是控制CO2濃度的一種方法。提高通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速有利于增加CO2在發(fā)酵液中的濃度。反之則減少。用堿中和CO2產(chǎn)生的碳酸(不能用CaCO3)調(diào)節(jié)罐壓控制補(bǔ)糖

補(bǔ)糖、CO2濃度、pH之間有相關(guān)性，可根據(jù)CO2釋放速率來控制補(bǔ)糖。第九節(jié)泡沫對發(fā)酵的影響及其控制一、泡沫的形成及其對發(fā)酵的影響在大多數(shù)微生物發(fā)酵過程中，通氣、攪拌以及代謝氣體的逸出，再加上培養(yǎng)基中糖、蛋白質(zhì)、代謝物等表面活性劑的存在，培養(yǎng)液中就形成了泡沫。泡沫的多少與攪拌、通風(fēng)、培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。蛋白質(zhì)原料如蛋白胨、玉米漿、黃豆粉、酵母粉等是主要的發(fā)泡劑。糊精含量多也引起泡沫的形成。當(dāng)發(fā)酵感染雜菌和噬菌體時(shí)，泡沫異常多。少量泡沫的作用：一定數(shù)量的泡沫是正常現(xiàn)象，可以增加氣液接觸面積，導(dǎo)致氧傳遞速率增加；大量的泡沫引起許多負(fù)作用：發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減少、氧傳遞系統(tǒng)減??；增加了菌群的非均一性；造成大量逃液，增加染菌機(jī)會(huì)；嚴(yán)重時(shí)通氣攪拌無法進(jìn)行，菌體呼吸受到阻礙，導(dǎo)致代謝異常或菌體自溶；消泡劑的添加將給提取工序帶來困難。二、泡沫的消除調(diào)整培養(yǎng)基中的成分（如少加或緩加易起泡的原料）或改變某些物理化學(xué)參數(shù)（如pH值、溫度、通氣和攪拌）或者改變發(fā)酵工藝（如采用分次投料）來控制，以減少泡沫形成的機(jī)會(huì)。采用菌種選育的方法，篩選不產(chǎn)生流態(tài)泡沫的菌種，來消除起泡的內(nèi)在因素。采用機(jī)械消泡或消泡劑來消除已形成的泡沫。1.機(jī)械消泡物理消泡方法，利用機(jī)械強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力變化而使泡沫破裂。優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省原料，減少染菌機(jī)會(huì)。缺點(diǎn)：消泡效果不理想，僅可作為消泡的輔助方法。罐內(nèi)消泡——靠罐內(nèi)消泡槳轉(zhuǎn)動(dòng)打碎泡沫。罐外消泡——將泡沫引出罐外，通過噴嘴的加速作用或離心力來消除泡沫。2.消泡劑消泡A.消泡劑的作用：降低泡沫液膜的機(jī)械強(qiáng)度；降低液膜的表面黏度；兼有兩者的作用，達(dá)到破裂泡沫的目的。B.作為生物工業(yè)理想的消泡劑，應(yīng)具備下列條件：應(yīng)該在氣－液界面上具有足夠大的鋪展系數(shù)，才能迅速發(fā)揮消泡作用，這就要求消泡劑有一定的親水性；應(yīng)該在低濃度時(shí)具有消泡活性；應(yīng)該具有持久的消泡或抑泡性能，以防止形成新的泡沫；應(yīng)該對微生物、人類和動(dòng)物無毒性；應(yīng)該對產(chǎn)物的提取不產(chǎn)生影響；不會(huì)在使用、運(yùn)輸中引起任何危害；來源方便，成本低；應(yīng)該對氧傳遞不產(chǎn)生影響；能耐高溫滅菌。C.常用的消泡劑有4大類：天然油脂類脂肪酸和酯類聚醚類硅酮類以天然油脂類和聚醚類在生物發(fā)酵中最為常用。豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和豬油等。油不僅用作消泡劑，還可作為碳源和發(fā)酵控制的手段。在發(fā)酵中，要控制油的質(zhì)量、新鮮程度，并要進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)檢驗(yàn)。聚醚類消泡劑品種很多，它們是氧化丙稀或氧化丙稀和環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的聚合物。聚氧丙稀甘油（GP型）——氧化丙稀和甘油聚合；親水性差，在發(fā)泡介質(zhì)中的溶解度小，所以用于稀薄發(fā)酵液中要比用于粘稠發(fā)酵液中的效果好；抑泡性能比消泡性能好，適宜用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以抑制泡沫的產(chǎn)生。聚氧乙烯氧丙稀甘油（GPE型，泡敵）——氧化丙稀、環(huán)氧乙烷與甘油聚合；親水性好，在發(fā)泡介質(zhì)中易鋪展，消泡能力強(qiáng)，作用快，溶解度大，消泡活性維持時(shí)間短，用于粘稠發(fā)酵液的效果比用于稀薄的好。D.應(yīng)用消泡劑時(shí)的增效方法：加載體增效，即用惰性載體（如礦物油、植物油等）使消泡劑溶解分散，達(dá)到增效的目的；消泡劑并用增效，取各種消泡劑的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行互補(bǔ)，達(dá)到增效；乳化消泡劑增效，用乳化劑（或分散劑）將消泡劑制成乳劑，以提高分散能力，增強(qiáng)消泡效力，一般只適用于親水性差的消泡劑。GP和GPE1:1混合使用于土霉素發(fā)酵，結(jié)果比單獨(dú)使用GP的效力提高2倍。用吐溫-80制成的乳劑，用于慶大霉素發(fā)酵，效力提高1～2倍。在生產(chǎn)過程中，消泡的效果除了與消泡劑的種類、性質(zhì)、分子量大小、消泡劑親油親水基團(tuán)等密切香港外，還與消泡劑使用時(shí)加入方法、使用濃度、溫度等有很大關(guān)系，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際加以注意和解決。

發(fā)酵染菌：指在發(fā)酵過程中生產(chǎn)菌以外的其他微生物侵入了發(fā)酵系統(tǒng)，從而使發(fā)酵過程失去真正意義上的純種培養(yǎng)。第十節(jié)染菌對發(fā)酵的影響及其控制一、染菌對發(fā)酵的影響1、染菌對不同發(fā)酵過程的影響2、染菌發(fā)生的不同時(shí)間對發(fā)酵的影響由于各種發(fā)酵過程所用的微生物菌種、培養(yǎng)基以及發(fā)酵的條件、產(chǎn)物的性質(zhì)不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是對于哪種發(fā)酵過程，一旦發(fā)生染菌，都會(huì)由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被消耗或代謝產(chǎn)物被分解，嚴(yán)重影響到產(chǎn)物的生成，使發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量大為降低。（一）染菌對不同發(fā)酵過程的影響青霉素發(fā)酵過程：由于許多雜菌都能產(chǎn)生青霉素酶，因此不管染菌是發(fā)生在發(fā)酵前期、中期或后期，都會(huì)使青霉素迅速分解破壞，使目的產(chǎn)物得率降低，危害十分嚴(yán)重。核苷或核苷酸發(fā)酵過程：由于所用的生產(chǎn)菌種是多種營養(yǎng)缺陷型微生物，其生長能力差，所需的培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此容易受到雜菌的污染，且染菌后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制了生產(chǎn)菌的生長和代謝產(chǎn)物的生成。檸檬酸等有機(jī)酸發(fā)酵過程：一般在產(chǎn)酸后發(fā)酵液的pH值比較低，雜菌生長十分困難，在發(fā)酵中、后期不太會(huì)發(fā)生染菌，主要是要預(yù)防發(fā)酵前期染菌。谷氨酸發(fā)酵：周期短，生產(chǎn)菌繁殖快，培養(yǎng)基不太豐富，一般較少污染雜菌，但噬菌體污染對谷氨酸發(fā)酵的影響較大。種子培養(yǎng)期染菌（二）染菌發(fā)生的不同時(shí)間對發(fā)酵的影響種子培養(yǎng)主要是使微生物細(xì)胞生長與繁殖，此時(shí)，微生物菌體濃度低，培養(yǎng)基地營養(yǎng)十分豐富，比較容易染菌。若將污染的種子帶入發(fā)酵罐，則危害極大，因此應(yīng)嚴(yán)格控制種子染菌的發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)種子受到雜菌的污染，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄去，并對種子罐、管道等進(jìn)行仔細(xì)檢查和徹底滅菌。發(fā)酵前期染菌在發(fā)酵前期，微生物菌體主要是處于生長、繁殖階段，此時(shí)期代謝的產(chǎn)物很少，相對而言這個(gè)時(shí)期也容易染菌。染菌后的雜菌將迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的正常生長、繁殖及產(chǎn)物的生成。發(fā)酵中期染菌發(fā)酵中期染菌將會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，并嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的生成。有的染菌后雜菌大量繁殖，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌體自溶，致使發(fā)酵液發(fā)粘，產(chǎn)生大量的泡沫，代謝產(chǎn)物的積累減少或停止；有的染菌后會(huì)使已生成的產(chǎn)物被利用或破壞。從目前的情況來看，發(fā)酵中期染菌一般較難挽救，危害性較大，在生產(chǎn)過程中應(yīng)盡力做到早發(fā)現(xiàn)、快處理。發(fā)酵后期染菌由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的糖等營養(yǎng)物質(zhì)已接近耗盡，且發(fā)酵的產(chǎn)物也已積累較多，如果染菌量不太多，對發(fā)酵影響相對來說就要小一些，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。對發(fā)酵產(chǎn)物來說，發(fā)酵后期染菌對不同的產(chǎn)物的影響也是不同的，如抗生素、檸檬酸的發(fā)酵，染菌對產(chǎn)物的影響不大；肌苷酸、谷氨酸等地發(fā)酵，后期染菌也會(huì)影響產(chǎn)物的產(chǎn)量、提取和產(chǎn)品的質(zhì)量。二、發(fā)酵異?，F(xiàn)象及原因分析1、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象2、染菌的檢查和判斷3、發(fā)酵染菌原因分析發(fā)酵過程中的種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象是指發(fā)酵過程中某些物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)或生物參數(shù)發(fā)生與原有規(guī)律不同的改變，這些改變必然影響發(fā)酵水平，使生產(chǎn)蒙受損失。對此應(yīng)及時(shí)查明原因，加以解決。（一）種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異常現(xiàn)象1、種子培養(yǎng)異常表現(xiàn)為培養(yǎng)的種子質(zhì)量不合格菌體生長緩慢菌絲結(jié)團(tuán)代謝不正常培養(yǎng)基原料質(zhì)量下降、菌體老化、滅菌操作失誤、供氧不足、培養(yǎng)溫度偏高或偏低、酸堿度調(diào)節(jié)不當(dāng)；接種物冷藏時(shí)間長或接種量過低而導(dǎo)致菌體量少；接種物本身質(zhì)量差等在培養(yǎng)過程中有些絲狀菌容易產(chǎn)生菌絲團(tuán)，菌體僅在表面生長，菌絲向四周伸展，而菌絲團(tuán)的中央結(jié)實(shí)，使內(nèi)部菌絲的營養(yǎng)吸收和呼吸受到很大影響，從而不能正常地生長。通氣不良或停止攪拌導(dǎo)致溶解氧濃度不足；原料質(zhì)量差或滅菌效果差導(dǎo)致培養(yǎng)基質(zhì)量下降；接種的孢子或菌絲保藏時(shí)間長而菌落數(shù)少，泡沫多；罐內(nèi)裝料小、菌絲粘壁等會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液的菌絲濃度比較低；接種物種齡短等導(dǎo)致菌體生長緩慢造成菌絲結(jié)團(tuán)。代謝不正常表現(xiàn)出糖、氨基氮等變化部正常，菌體濃度和代謝產(chǎn)物不正常。原因很復(fù)雜，與接種物質(zhì)量和培養(yǎng)基質(zhì)量差、培養(yǎng)環(huán)境條件差、接種量小、雜菌污染等有關(guān)。2、發(fā)酵異常菌體生長差pH值過高或過低溶解氧水平異常泡沫過多菌體濃度過高或過低菌體生長差由于種子質(zhì)量差或種子低溫放置時(shí)間長導(dǎo)致菌體數(shù)量較少、停滯期延長、發(fā)酵液內(nèi)菌體數(shù)量增長緩慢、外形不整齊。種子質(zhì)量不好、菌種的發(fā)酵性能差、環(huán)境條件差、培養(yǎng)基質(zhì)量不好、接種量太少等均會(huì)引起糖、氮的消耗少或間歇停滯，出現(xiàn)糖、氮代謝緩慢現(xiàn)象。pH值過高或過低發(fā)酵過程中由于培養(yǎng)基原料質(zhì)量差、滅菌效果差、加糖、加油過多或過于集中，將會(huì)引起pH的異常變化。pH值變化是所有代謝反應(yīng)的綜合反映，在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期都有一定規(guī)律，pH值的異常就意味著發(fā)酵的異常。發(fā)酵過程中的溶解氧水平發(fā)生異常變化一般就是發(fā)酵染菌發(fā)生的表現(xiàn)。由于污染的雜菌好氧性不同，產(chǎn)生溶解氧異常的現(xiàn)象也是不同的。對于特定的發(fā)酵過程，工藝確定后，排出的氣體中CO2含量的變化是規(guī)律的。雜菌是好氧性微生物時(shí)，溶解氧的變化是在較短時(shí)間內(nèi)下降，直到接近于零，且在長時(shí)間內(nèi)不能回升；雜菌是非好氧性微生物，而生產(chǎn)菌由于受污染而抑制生長，使耗氧量減少，溶解氧升高。正常發(fā)酵過程中，發(fā)酵初期菌體處于適應(yīng)期，耗氧量很少，溶解氧基本不變；當(dāng)菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，耗氧量增加，溶解氧濃度很快下降，并且維持在一定的水平，這階段中操作條件的變化會(huì)使溶解氧有所波動(dòng)，但變化不大；發(fā)酵后期菌體衰老，耗氧量減少，溶解氧又再度上升；當(dāng)感染噬菌體后，生產(chǎn)菌的呼吸作用受抑制，溶解氧濃度很快上升。發(fā)酵過程感染噬菌體后，溶解氧的變化比菌體濃度更靈敏，能更好的預(yù)見染菌的發(fā)生。染菌后，培養(yǎng)基中糖的消耗發(fā)生變化，引起排氣中CO2含量的異常變化，如雜菌污染，糖耗加快，CO2含量增加；噬菌體污染后，糖耗減慢，CO2含量減少。因此，可根據(jù)CO2含量的異常變化來判斷是否染菌。溶解氧水平異常一般在發(fā)酵過程中泡沫的消長是有一定規(guī)律的。但是，由于菌體生長差、代謝速度慢、接種物嫩或種子未及時(shí)移種而過老、蛋白質(zhì)類膠體物質(zhì)多等都會(huì)使發(fā)酵液在不斷通氣、攪拌下產(chǎn)生大量的泡沫。除此以外，培養(yǎng)基滅菌時(shí)溫度過高或時(shí)間過長，葡萄糖受到破壞產(chǎn)生的氨基糖會(huì)抑制菌體的生長，也會(huì)使泡沫大量產(chǎn)生，從而使發(fā)酵過程的泡沫發(fā)生異常。泡沫過多在發(fā)酵生產(chǎn)過程中菌體或菌絲濃度的變化是按其固有的規(guī)律進(jìn)行的。但是，如罐溫長時(shí)間偏高，或停止攪拌時(shí)間較長造成溶氧不足，或培養(yǎng)基滅菌不當(dāng)導(dǎo)致培養(yǎng)條件較差，種子質(zhì)量差菌體或菌絲自溶等均會(huì)嚴(yán)重影響到培養(yǎng)物的生長，導(dǎo)致發(fā)酵液中菌體濃度偏離原有規(guī)律，出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。菌體濃度過高或過低（二）染菌的檢查和判斷發(fā)酵過程是否染菌應(yīng)以無菌試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行判斷。在發(fā)酵過程中，如何及早發(fā)現(xiàn)雜菌的污染并及時(shí)采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要手段。因此，生產(chǎn)上要求能準(zhǔn)確、迅速的檢查出雜菌的污染。目前常用于檢查是否染菌的無菌試驗(yàn)方法主要有顯微鏡檢查法、肉湯培養(yǎng)法、平板（雙碟）培養(yǎng)法、發(fā)酵過程的異常觀察法（如溶氧量）等。用革蘭氏染色法（Gramsstain）對樣品進(jìn)行涂片、染色，然后在顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)特征，根據(jù)生產(chǎn)菌與雜菌的特征進(jìn)行區(qū)別、判斷是否染菌。如發(fā)現(xiàn)有與生產(chǎn)菌形態(tài)特征不一樣的其它微生物的存在，就可判斷為發(fā)生了染菌。此法檢查雜菌最簡單、最直接、最常用。必要時(shí)還可進(jìn)行芽胞染色或鞭毛染色。1、顯微鏡檢查法（鏡檢法）通常用葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基，將待測樣品直接接入經(jīng)完全滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中，分別于37℃、27℃進(jìn)行培養(yǎng)，隨時(shí)觀察微生物的生長情況，并取樣進(jìn)行鏡檢，判斷是否有雜菌。肉湯培養(yǎng)法常用于檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌，同時(shí)此法也可用于噬菌體的檢查。2、肉湯培養(yǎng)法葡萄糖酚紅肉湯0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％NaCl、0.8％蛋白胨、0.4％酚紅溶液，pH7.2將待測樣品在無菌平板上劃線，分別于37℃、27℃進(jìn)行培養(yǎng)，一般24h后即可進(jìn)行鏡檢觀察，檢查是否有雜菌。有時(shí)為了提高平板培養(yǎng)法的靈敏度，也可將需要檢查的樣品先置于37℃培養(yǎng)6h，使雜菌迅速增殖后再劃線培養(yǎng)。3、平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法注意點(diǎn)無菌試驗(yàn)時(shí)，如果肉湯連續(xù)三次發(fā)生變色反應(yīng)（紅色→黃色）或產(chǎn)生混濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有異常菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌。有時(shí)肉湯培養(yǎng)的陽性反應(yīng)不夠明顯，而發(fā)酵樣品的各項(xiàng)參數(shù)確有可疑染菌，并經(jīng)鏡檢等其它方法確認(rèn)連續(xù)三次樣品有相同類型的異常菌存在，也應(yīng)該判斷為染菌。一般來講，無菌試驗(yàn)的肉湯或培養(yǎng)平板應(yīng)保存并觀察至本批（罐）放罐后12h，確認(rèn)為無雜菌后才能棄去。無菌試驗(yàn)期間應(yīng)每6h觀察一次無菌試驗(yàn)樣品，以便能及早發(fā)現(xiàn)染菌。（三）發(fā)酵染菌原因分析發(fā)酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以總結(jié)防治發(fā)酵染菌的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，積極采取必要措施，把雜菌消滅在發(fā)生之前。如果對已發(fā)生的染菌不作具體分析，不了解染菌原因，未采取相應(yīng)的措施來防治染菌，將會(huì)對生產(chǎn)造成嚴(yán)重的后果。造成發(fā)酵染菌的原因很多，且因工廠不同而有所不同，但設(shè)備滲漏、空氣凈化達(dá)不到要求、種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底和技術(shù)管理不善等造成各廠污染雜菌的普遍原因。染菌原因染菌百分率/％染菌原因染菌百分率/％空氣系統(tǒng)染菌32.05補(bǔ)料、取樣帶菌4.30設(shè)備問題15.46種子帶菌1.72管理和操作不當(dāng)11.34環(huán)境污染及原因不明35.13上海天廚味精廠谷氨酸發(fā)酵染菌分析對于每一個(gè)發(fā)酵過程而言，污染的雜菌種類的影響是不同的。發(fā)酵產(chǎn)品危害大的雜菌危害小的雜菌青霉素細(xì)短產(chǎn)氣桿菌粗大桿菌鏈霉素細(xì)短桿菌、假單胞菌、產(chǎn)氣桿菌粗大桿菌四環(huán)素雙球菌、芽胞桿菌、莢膜桿菌檸檬酸青霉谷氨酸噬菌體1、染菌的雜菌種類分析雜菌原因耐熱的芽胞桿菌培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備存在死角等球菌、無芽胞桿菌等種子帶菌、空氣過濾效率低、除菌不徹底、設(shè)備滲漏、操作問題等真菌設(shè)備或冷卻盤管滲漏、無菌室滅菌不徹底、無菌操作不當(dāng)、糖液滅菌不徹底（糖液放置時(shí)間較長）等2、發(fā)酵染菌的規(guī)模分析大批量發(fā)酵罐染菌部分發(fā)酵罐染菌個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌（如果采用間歇滅菌工藝，一般不會(huì)發(fā)生）連續(xù)染菌染菌時(shí)期原因發(fā)酵前期種子帶菌、連消設(shè)備染菌發(fā)酵中、后期如雜菌類型相同，一般是空氣凈化系統(tǒng)存在空氣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)不合理、空氣過濾介質(zhì)失效等問題染菌時(shí)期原因發(fā)酵前期種子帶菌、連消系統(tǒng)滅菌不徹底發(fā)酵后期中間補(bǔ)料染菌，如補(bǔ)料液帶菌、補(bǔ)料管滲漏大都由于設(shè)備滲漏造成，應(yīng)仔細(xì)檢查閥門、罐體或罐器是否清潔等。一般設(shè)備滲漏引起的染菌，會(huì)出現(xiàn)每批染菌時(shí)間向前推移地現(xiàn)象。染菌發(fā)生在種子培養(yǎng)階段，或稱種子培養(yǎng)期染菌。通常是由種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底，以及接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素等原因而引起染菌。在發(fā)酵過程的初始階段發(fā)生染菌，或稱發(fā)酵前期染菌。大部分也是由于種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底，以及接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素、無菌空氣等原因而引起。發(fā)酵后期染菌大部分是由空氣過濾不徹底、中間補(bǔ)料染菌、設(shè)備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題而引起。3、不同污染時(shí)間分析三、雜菌污染的預(yù)防1、種子帶菌及其防治2、空氣帶菌及其防治3、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治4、設(shè)備滲漏或“死角”造成的染菌及其防治原因措施一、種子帶菌及其防治保藏斜面試管菌種染菌、培養(yǎng)基和器具滅菌不徹底、種子轉(zhuǎn)移和接種過程染菌、種子培養(yǎng)所涉及的設(shè)備和裝置染菌。嚴(yán)格控制無菌室的污染，根據(jù)生產(chǎn)工藝的要求和特點(diǎn)，建立相應(yīng)的無菌室，交替使用各種滅菌手段對無菌室進(jìn)行處理。在制備種子時(shí)對砂土管、斜面、三角瓶及搖瓶均嚴(yán)格進(jìn)行管理，防止雜菌的進(jìn)入而受到污染。為了防止染菌，種子保存管的棉花塞應(yīng)有一定的緊密度，且有一定的長度，保存溫度盡量保持相對穩(wěn)定，不宜有太大變化。對每一級種子的培養(yǎng)物均應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的無菌檢查，確保任何一級種子均未受雜菌污染后才能使用。對菌種培養(yǎng)基或器具進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理，保證在利用滅菌鍋進(jìn)行滅菌前，先完全排除鍋內(nèi)的空氣，以免造成假壓，使滅菌的溫度達(dá)不到預(yù)定值，造成滅菌不徹底而使種子染菌。要杜絕無菌空氣帶菌，就必須從空氣的凈化工藝和設(shè)備的設(shè)計(jì)、過濾介質(zhì)的選用和裝填、過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統(tǒng)。二、空氣帶菌及其防治加強(qiáng)生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生管理，減少生產(chǎn)環(huán)境中空氣的含菌量，正確選擇采氣口，如提高采氣口的位置或前置粗過濾器，加強(qiáng)空氣壓縮前的預(yù)處理，如提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度。設(shè)計(jì)合理的空氣預(yù)處理工藝，盡可能減少生產(chǎn)環(huán)境中空氣帶油、水量，提高進(jìn)入過濾器的空氣溫度，降低空氣的相對濕度，保持過濾介質(zhì)的干燥狀態(tài)，防止空氣冷卻器漏水，防止冷卻水進(jìn)入空氣系統(tǒng)等。設(shè)計(jì)和安裝合理的空氣過濾器，防止過濾器失效。選用除菌效率高的過濾介質(zhì)，在過濾器滅菌時(shí)要防止過濾介質(zhì)被沖翻而造成短路，避免過濾介質(zhì)烤焦或著火，防止過濾介質(zhì)的裝填不均而使空氣走短路，保證一定的介質(zhì)充填密度。當(dāng)突然停止進(jìn)空氣時(shí)，要防止發(fā)酵液倒流入空氣過濾器，在操作中要防止空氣壓力的劇變和流速的急增。通常對于淀粉質(zhì)培養(yǎng)基地滅菌采用實(shí)罐滅菌較好，一般在升溫前先通過攪拌混合均勻，并加入一定量的淀粉酶進(jìn)行液化；有大顆粒存在時(shí)應(yīng)先經(jīng)過篩除去，再行滅菌；對于麩皮、黃豆餅一類的固形物含量較多的培養(yǎng)基，采用罐外預(yù)先配料，再轉(zhuǎn)至發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行實(shí)罐滅菌較為有效。在滅菌升溫時(shí)，要打開排氣閥門，使蒸汽能通過并驅(qū)除罐內(nèi)冷空氣，一般可避免“假壓”造成染菌。要嚴(yán)防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫的大量產(chǎn)生。避免蒸汽壓力的波動(dòng)過大，應(yīng)嚴(yán)格控制滅菌溫度，過程最好采用自動(dòng)控溫。發(fā)酵過程越來越多的采用自動(dòng)控制，一些控制儀器逐漸被應(yīng)用。一般常采用