實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)實(shí)用工具-mirna研究引物及相關(guān)

引物及miRNA相關(guān)設(shè)主要內(nèi) 2lncRNAqPCR物設(shè)3miRNAqPCR引物設(shè)長鏈非編碼RNAMIAT靶向調(diào)控DLG3 1,lncRNA2,DLG3目 SYBRGreen名點(diǎn)擊cDNA，然后點(diǎn)擊configurethis只勾選show 引物區(qū)域，F(xiàn)orward為1-1/2產(chǎn)物長度，Max與以 lncRNAqPCRlncRNANCBI查找lncRNA到NCBI 選擇選擇somewhatsimilarsequence， NCBI 源性較低時(shí)該對引物才可以使miRNAqPCR檢測成熟microRNAstem-loop或OligodTmiRNAqPCRSYBRgreen1.1.22用于3.3.

CAGC-

SYBRgreenqPCRPolyA化的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物為通用的OligodT 物二聚體，可在miRNA3端去除幾個(gè)堿基調(diào)整Tm如果miRNAGC含量太低，可以在上游引物5端加入GCGCC5’-GTGCAGGGTCCGAGGT

5′-AA24

miRNAmimic&miRNAmimicmiRNA5‘端第2-8位堿基里7個(gè) 序列，故Mimic必須含 Mimic與mRNA3‘如不要求內(nèi)源性剪切，則應(yīng)避免miRNA的5‘10-11位堿基與mRNA配對 3‘UTR內(nèi)存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可促進(jìn)miRmimic抑制效率Mimic與靶mRNA形成特殊構(gòu)象如突出環(huán)等下可增強(qiáng)抑制效率miRNAmimic針對mRNA3‘UTR內(nèi) 設(shè)計(jì)一個(gè)5端含有8個(gè)與靶mRNA配對堿基的含22個(gè)核苷酸的寡合甘酸鏈該寡合甘酸鏈同時(shí)含有5-6個(gè)堿基與靶mRNA3‘端互補(bǔ)在設(shè)計(jì)的mimi3末端加一個(gè)’AU‘NCBIgene搜索目 NCBIgeneNCBIgeneNCBIgeneNCBIgene搜索目 NCBIgene搜索目 5‘3‘粘貼3’UTR miRNAmimicsDLG33’UTR5’-cccctcccagggaagagaaacaaagattcaaagtaagcatg tagtgggtttaccagtgtttcttccaaggagacatatattttttaataaacgatagttgcaatgaactgtggctcgagaccttcttaaagtagttgagaagggagggcgtgggcaagcagtggaagaacatcccaaacttttgggggccagagggctctctccttagtgatgatcagctagccgagctgggccgtcctggggatcggtacagctccctggggtggtgacaggccctttgtgaaagttgtgtgcttggtcttccaccccagccccagacactgcttcaaatagcaccaaccagatgggagtcc-3’Mimic5’ DLG35’UTR5’-cccatcgcgcgcctcaggcgtctcctcctcctccctccttccccctcctctctcctcccc61tcctcccgcgcgccccgctttgtgtccgtggtctcccgcgcgggacggagggactggccg121gagctggcgctttctcagcactagatctggactccgaccc-3’Mimic3’ Mimic5Mimic3

miRNA---miRNAMinicMinic

inhibitorinhibitor

阻斷miRNA

miRNAMimicNC：改 InhibitorNC：與inhibitor具有相同核酸但不能與mimic互補(bǔ)的單鏈寡核甘酸或寡核脫氧核苷酸，通過打亂inhibitor順