分子生物學(xué)基因診斷與治

基因診斷與基因治療

GeneDiagnosisandGeneTherapy生物化學(xué)與分子生物學(xué)系林海燕l(xiāng)inda@據(jù)美國媒體消息，美國影星安吉麗娜·朱莉14日透露，她已經(jīng)接受了預(yù)防性的雙乳切除術(shù)，以降低其患癌的風險我母親與癌癥抗爭了近十年，最后還是在56歲的時候去世了。母親堅持了很久，總算如愿親手抱上第一個孫子。但其他孩子卻再也沒有機會了解她、感受她親切慈愛的人格魅力了。我總是跟孩子們說起“媽媽的媽媽”，而我也總是嘗試著向他們解釋奪走母親生命的疾病。他們會問，媽媽你會不會也這樣呢？我會勸他們別擔心，但事實上，我自己身上也有“惡性的”基因BRCA1，而這種基因極可能使我患上乳腺癌和卵巢癌。我的醫(yī)生估算過，我有87%的幾率罹患乳腺癌，50%的幾率罹患卵巢癌，..........................根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，單是乳腺癌每年造成45.8萬人死亡.每年中國乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2%和9.6%。2011年美國CA:ACancerJournalforClinicians雜志公布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國患乳腺癌的女性占新發(fā)惡性腫瘤的30%，而其中的大約10%的乳腺癌是遺傳性的。第一節(jié)

基因診斷學(xué)基礎(chǔ)

BasisofGeneDiagnostics簡悅威，美國華裔科院院院士，基因診斷之父。主要成就：確定了α地中海貧血患者的基因缺失情況；發(fā)現(xiàn)鐮刀狀細胞貧血的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP），并將此DAN檢測技術(shù)應(yīng)用于基因診斷和產(chǎn)前診斷。一、基因診斷的概念、特點及臨床意義

定義：利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢測基因及基因表達產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對人體疾病作出診斷的方法?；蛟\斷檢測的目標分子是DNA、RNA，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。

診斷依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變)DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達水平從低到高；基因結(jié)構(gòu)變化，如點突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交（Nucleicacidhybridization）Western免疫印跡（Westernblotting）聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）DNA序列測定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）免疫組織化學(xué)診斷全基因組關(guān)聯(lián)研究（GenomeWideAssociationStudies,GWAS）特點：等位基因特異性寡核苷酸(ASO)僅與完全互補的序列結(jié)合，故1個堿基錯配即足以阻止ASO探針與目的基因片段雜交。（一）等位基因特異性寡核苷酸

(allelespecificoligonucleotide,ASO）（二）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）

DNA的突變造成DNA片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來。PCR-SSCP分析原理示意正常人純合突變雜合突變+PCR-SSCP分析

－（三）限制性片段長度多態(tài)性分析

（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）

由于DNA變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切位點消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段?？山柚怂岱肿与s交或PCR進行檢測。

設(shè)計適當?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。PCR-RFLPABCDEFG－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點的變化全基因組關(guān)聯(lián)研究

（GenomeWideAssociationStudies,GWAS）GWAS：是指在人類全基因組范圍內(nèi)找出存在的序列變異，即單核苷酸多態(tài)性（SNP），從中篩選出與疾病相關(guān)的SNPs。SNP（singlenucleotidepolymorphism）：主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。GWAS工作原理：借助于SNP分子遺傳標記，進行總體關(guān)聯(lián)分析，在全基因組范圍內(nèi)選擇遺傳變異進行基因分型，比較異常和對照組之間每個遺傳變異及其頻率的差異，統(tǒng)計分析每個變異與目標性狀之間的關(guān)聯(lián)性大小，選出最相關(guān)的遺傳變異進行驗證，并根據(jù)驗證結(jié)果最終確認其與目標性狀之間的相關(guān)性。5June2011.Genome-wideassociationstudyidentifiesthreenewsusceptibilitylociforesophagealsquamous-cellcarcinomainChinesepopulations3July2011.Agenome-wideassociationstudyidentifiestwonewlungcancersusceptibilitylociat13q12.12and22q12.2inHanChinese30October2011.Agenome-wideassociationstudyidentifiesnewsusceptibilitylocifornon-cardiagastriccancerat3q13.31and5p13.125December2011.Agenome-wideassociationstudyinChinesemenidentifiesthreerisklocifornon-obstructiveazoospermia30June2013.Agenome-wideassociationstudyidentifiestwonewcervicalcancersusceptibilitylociat4q12and17q1226May2013.Agenome-wideassociationstudyidentifiestworisklociforcongenitalheartmalformationsinHanChinesepopulations27October2013.NewlociassociatedwithchronichepatitisBvirusinfectioninHanChinese南京醫(yī)科大學(xué)在Naturegenetics（29.648）上的論文發(fā)表情況

第二節(jié)

基因診斷的應(yīng)用

（一）鐮狀細胞貧血病一、血紅蛋白病的基因診斷1.

ASO雜交法、PCR-ASO

2.限制性內(nèi)切酶譜分析（RFLP）

3.PCR-RFLP分析

正常的（N）的ASO探針：5′-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3′突變的（M）的ASO探針：5′-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3′1.鐮狀紅細胞貧血患者基因診斷

ASO雜交法斑點雜交結(jié)果N：正常；M突變鐮狀紅細胞貧血患者ASO雜交法檢測N-ASOM-ASO正常突變突變

純合子雜合子純合子5′3′正?；?.15kb(CCTGAGG)×5′3′突變基因1.35kb(CCTGTGG)鐮狀紅細胞貧病的限制性內(nèi)切酶譜分析MstⅡ酶切位點（CCTNAGG）2.限制性內(nèi)切酶譜分析目錄0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細胞貧血病的限制性內(nèi)切酶譜分析目錄3.PCR-RFLP分析

正常人的擴增產(chǎn)物經(jīng)MstⅡ消化可生成54bp和56bp兩個片段，而鐮狀細胞貧血癥患者的DNA片段不被酶切，仍為110bp，雜合子可見三條帶正常人雜合體患者Marker-珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點雜交分析PCR-ASO聯(lián)合反向斑點雜交（二）-珠蛋白生成障礙性貧血癥二、傳染性疾病的基因檢測甲型肝炎病毒（HAV）

乙型肝炎病毒（HBV）

丙型肝炎病毒（HCV）H5N1，H7N9......結(jié)核分枝桿菌幽門螺桿菌（HP）目錄PCRor熒光定量PCR2002-2003：SARS2014-?：埃博拉2015-?：寨卡癌基因、腫瘤抑制基因與生長因子的關(guān)系癌基因抑癌基因細胞生長因子正調(diào)控負調(diào)控產(chǎn)物三、腫瘤的基因診斷癌基因和腫瘤抑制基因在細胞增殖中的作用1．乳腺癌常見基因變異5%～10%乳腺癌患者有家族遺傳性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（breastcancergene）的突變。

BRAC1突變易致乳腺癌。突變分布于整個編碼序列，沒有明顯的突變簇或突變熱點。BRCA2基因在30%～40%的散發(fā)性乳腺癌有雜合性缺失（LOH）。突變提高乳腺癌易感性。（1）PCR法檢測BRCA1基因突變（2）熒光原位雜交（FISH）檢測BRCA2基因擴增2．乳腺癌基因診斷方法第四節(jié)

基因治療的概念及策略

ConceptandStrategyofGeneTherapy目錄基因治療：指將目的基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（病毒載體介導(dǎo)或者非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）導(dǎo)入靶細胞內(nèi)，目的基因表達產(chǎn)物對疾病起治療作用。

目錄基因治療分類體細胞(somaticcell)基因治療生殖細胞(germline)基因治療只限于某一體細胞的基因的改變只限于某個體的當代對缺陷的生殖細胞進行矯正當代及子代一、基因治療的策略基因置換（genereplacement）

基因添加（geneaugmentation）基因干預(yù)（geneinterference）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)基因免疫治療自殺基因的作用機制

丙氧鳥苷（GCV）GCV三磷酸核苷胸苷激酶TK基因治療的兩種途徑載體目的基因invivoexvivo靶細胞目錄二、基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(>70%)2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR。

反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點

LTR由U3、R和U5三部分組成。病毒有三個結(jié)構(gòu)基因5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。

含有負鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點。在U3內(nèi)有增強子和啟動子；

U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)

；

在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。

gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；pol基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

——由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體：其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號ψ，而缺失病毒的包裝蛋白基因。

輔助細胞株(如PA317)：由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信號ψ的反轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點

①反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細胞。

②反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒通過LTR高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點

隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。目錄（2）腺病毒(adenovirus)載體腺病毒載體的特點基因?qū)胄矢撸瑢θ祟惏踩?；宿主范圍廣；重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因。目錄有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。靶向性差。

不能整合到靶細胞的基因組DNA中。表達時間相對較短。（3）腺病毒相關(guān)病毒載體

一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒等）存在時，才能進行復(fù)制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticlesStructureofAAVVirusGenomicDNAREP：病毒復(fù)制基因,CAP：編碼衣殼蛋白的基因ITR：反向末端重復(fù)序列

AAV載體的缺陷

AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低,在40%~80%的成人中存在過感染;可能會引起免疫排斥。常用基因治療載體

整合致病性感染細胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機整合，效率高可能致病分裂細胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細胞、非分裂細胞

腺相關(guān)病毒載體定點整合(19號染色體特定區(qū)域)不致病分裂細胞、非分裂細胞<5kb<7.5kb脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖目錄

2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖目錄（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

（3）基因直接注射技術(shù)

不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。

將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子Ⅸ。（一）反義RNA（antisenseRNA）（二）核酶(ribozyme)（三）RNA干擾（RNAinterference，RNAi）

三、基因干預(yù)（geneinterference）

核酶錘頭狀的二級、三級結(jié)構(gòu)只要兩個RNA分子通過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。目錄核酶的作用機制

RNA干擾的機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默