《分子生物學(xué)》研究生課件核酸分子雜交(研究生)

核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

核酸分子雜交是目前分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一項應(yīng)用十分廣泛的技術(shù)。根據(jù)核酸雜交探測靶分子的不同，核酸雜交分為：

1、Southernblot：檢測經(jīng)凝膠電泳分開的DNA分子,

需轉(zhuǎn)印到膜上

2、Northernblot：檢測經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上

3、斑點雜交（dotblot)：檢測未經(jīng)分離的，固定在膜上的DNA或RNA分子

4、菌落或噬斑雜交(colony/plaqueblots):指檢測固定在膜上的，經(jīng)裂解后從細(xì)菌和噬菌體中釋放的

DNA分子

5、原位雜交（insituhybridization):檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子。

第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交是指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。在此過程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化。

探針（probe)：在雜交體系中帶有標(biāo)記的已知序列的DNA或RNA片段，通常先將待測的單鏈靶核酸固定在適當(dāng)?shù)妮d體上，然后置于含相應(yīng)單鏈核酸探針的雜交反應(yīng)體系中，通過堿基互補配對原則，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過對標(biāo)記探針的檢測，可以判定待檢測樣品中相應(yīng)序列的存在與否與分子量大小。

一、DNA變性與復(fù)性（denaturationand

renaturation)（一）變性：在理、化因素作用下（加熱、酸堿或紫外線照射下），兩條DNA鏈之間氫鍵斷裂，變成兩條單鏈。變性的本質(zhì)：雙鏈間氫鍵斷裂。未影響共價鍵（磷酸二酯鍵）。變性常用的方法：

1、熱變性

1）DNA分子中G=C含量越多，解鏈所需的溫度就越高

2）DNA變性后理化性質(zhì)改變黏度降低

A260升高增色效應(yīng)

3）Hyperchromiceffect:DNA變性后，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基暴露，對紫外光吸收增加的現(xiàn)象。

4）解鏈曲線：熱變性過程中，將溫度升高并以

O.D260作圖，可得一“S”型曲線，即解鏈曲線可見DNA變性是在一個狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的突躍過程，類似晶體的融化，所以又稱融解曲線（meltingcurve)5)融解溫度（Tm）：DNA變性50%時的溫度，多數(shù)在85-90度左右。

2酸堿變性：當(dāng)核酸溶液的pH<3，或pH>10時，核酸變性,分子雜交中常用堿變性（0.5mol/LNaOH溶液）

3化學(xué)試劑變性：尿素、甲酰胺、甲醛等可破壞氫鍵（二）復(fù)性：DNA的變性是可逆的，即兩條互補的單鏈

DNA分子在變性條件去除后如條件適宜，

DNA可恢復(fù)其雙螺旋結(jié)構(gòu)。減色效應(yīng)(hypochromiceffect)：伴隨復(fù)性會出現(xiàn)

DNA溶液紫外光吸收降低的現(xiàn)象。

二影響雜交的因素

1、核酸分子的濃度和長度核酸濃度越大，碰撞幾率越高，復(fù)性速度越快核酸分子越長，越難形成正確配對，復(fù)性速度越慢

2、溫度溫度不宜太低（少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈能解離）溫度也不宜太高（不能形成堿基配對）所以復(fù)性的最適溫度是較Tm低25℃3、離子強度足以消除兩條鏈P的靜電斥力，常用0.15-0.5mol/LNaCl高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，所以進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交液和洗膜液的高鹽濃度。

4、雜交液的甲酰胺：甲酰胺能破壞氫鍵，降低核酸雜交的Tm

含30%-50%甲酰胺的雜交溶液溫度能降低30-42℃5、核酸分子的復(fù)雜性：指DNA分子中不重復(fù)堿基的總量核酸分子的復(fù)雜性?。ㄖ貜?fù)順序多，分子量?。?，復(fù)性快

6、非特異性雜交反應(yīng)：為減少非特異性雜交反應(yīng)，在雜交前先進(jìn)行預(yù)雜交封閉，以減少非特異性吸附。常用鮭魚精子DNA

或高分子化合物

第二節(jié)核酸分子雜交的基本方法一

Southern印跡雜交

Southern印跡雜交是E.Southern于1975年創(chuàng)立的雜交方法，是指DNA與DNA的雜交，屬固相雜交（一）待測核酸樣品的制備

1、制備待測DNA

DNA酶、蛋白酶

細(xì)胞或組織裂解細(xì)胞DNA

酚/氯仿

2、DNA的限制酶消化選擇一種或兩種限制酶，對DNA進(jìn)行部分或充分消化（二）待測DNA樣品的電泳分離通常用0.8-1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，對DNA片段進(jìn)行分離。（三）凝膠中核酸的原位變性

DNA樣品在制備和電泳過程中始終保持雙鏈結(jié)構(gòu)電泳后必須將DNA片段變性并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)墓滔嘀С治锷?，才能進(jìn)行Southern印跡雜交原位變性瓊脂糖凝膠電泳后將凝膠浸入1.5mol/LNaCl、

中和

0.5mol/LNaOH中，室溫30’用Tris-HCL、

Nacl溶液中和轉(zhuǎn)膜（四）Southern轉(zhuǎn)膜將凝膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上。常用的固相支持物：化學(xué)活化膜、硝酸纖維素膜（NC膜），尼龍膜，

Southern轉(zhuǎn)膜的方法：

1、毛細(xì)管虹吸法：利用高鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用和虹吸作用

2、電轉(zhuǎn)印法：利用電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到膜上適用于轉(zhuǎn)移大片段DNA3、真空轉(zhuǎn)移：原理同毛細(xì)管虹吸，需真空泵(3)真空轉(zhuǎn)移法：真空轉(zhuǎn)移法可在轉(zhuǎn)膜的同時進(jìn)行DNA的變性和中和，一般先用變性液轉(zhuǎn)移15～30分鐘，然后換用中和液轉(zhuǎn)移15～30分鐘，整個過程只需30分鐘至1小時左右。但應(yīng)注意兩個問題：①真空壓力不能太大，若壓力過大，凝膠被壓縮，轉(zhuǎn)移效率會降低；②真空轉(zhuǎn)移儀要密封嚴(yán)，防止漏氣影響壓力的產(chǎn)生。（五）探針的制備核素或非核素標(biāo)記的探針（六）

Southern預(yù)雜交和雜交預(yù)雜交的目的：將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點全部封閉預(yù)雜交液：不含探針的雜交液，其中含鮭魚精子DNA（該

DNA與哺乳動物的DNA同源性低，不會與探針雜交）、聚乙烯吡咯烷酮，牛血清白蛋白等大分子物質(zhì)。雜交：含有探針，通常在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中雜交過夜，雜交液按50μl/cm2加入

（七）洗膜目的：洗去未結(jié)合的、游離的放射性探針及可能非特異性結(jié)合的DNA

方法：將薄膜先高鹽后低鹽溶液進(jìn)行漂洗（八）雜交結(jié)果的檢測—放射自顯影將薄膜與X-光膠片接觸，暴光1—7天，顯影、定影，即可在

X光片上見到清晰的黑色條帶二Northern印跡雜交（一）類似于Southernblot的測定RNA分子的雜交技術(shù)稱為

Northernblot（二）與Southernblot的主要區(qū)別：在變性劑存在下，以瓊脂

糖電泳分離RNA（變性劑的作用是防止RNA分子形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，維持其單鏈線性狀態(tài)）（三）常用變性劑：乙二醛、甲醛、甲基氫氧化汞（四）轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，不需要再進(jìn)行變性和中和，直接轉(zhuǎn)膜三斑點及狹縫印跡雜交將DNA或RNA變性后直接點樣于NC膜優(yōu)點：簡單、快速、可在同一張膜上進(jìn)行多個樣品的檢測缺點：不能鑒別所檢測核酸的分子量，且特異性不高四原位雜交（insituhybridization）

核酸保持在細(xì)胞或組織中，經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚砑?xì)胞或組織后將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交。原位雜交不需要從組織或細(xì)胞中提取核酸，能完整的保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。

細(xì)胞內(nèi)原位雜交雜交反應(yīng)在載玻片上進(jìn)行組織切片原位雜交原位雜交的步驟：

1、組織或細(xì)胞的固定用10%甲醛、4%多聚甲醛、乙醇：冰乙酸（3：1）等將組織或細(xì)胞固定在載玻片上

2、雜交前的預(yù)處理目的：降解核酸表面的蛋白，提高探針的穿透力方法：蛋白酶、去垢劑（TritonX-100、SDS）

注意：蛋白酶不能含有核酸酶消化時間不宜過長、否則會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞、脫片

3、探針的選擇核素標(biāo)記探針：DNA、RNA、寡核苷酸探針均可非核素標(biāo)記

4、雜交取10-20μL雜交液滴在預(yù)處理過的玻片上，蓋上硅化蓋玻片排除氣泡，用液體石蠟或膠泥封片，以防雜交液流失。

5、雜交結(jié)果檢測：同位素：放射自顯影生物素或地高辛配基標(biāo)記的探針：顯色反應(yīng)五液相雜交液相雜交是指待測核酸分子與核酸探針都存在于雜交液中堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子第三節(jié)探針的標(biāo)記一探針的種類（一）cDNA探針：經(jīng)RT-PCR可制備大量的cDNA探針

cDNA探針是目前應(yīng)用最廣泛的一種探針（二）基因組DNA探針：此類探針來源于染色體DNA，一般是從G-文庫中獲取或利用PCR擴增基因組中某特定片段（三）寡核苷酸探針：根據(jù)已知的核酸序列，人工合成一定長度的寡核苷酸片段（20-50個堿基的單鏈）作為探針（四）RNA探針：較少應(yīng)用，可從細(xì)胞中直接提取RNA或以目的基因為模板，轉(zhuǎn)錄合成出高放射性的RNA探針二、標(biāo)記物（一）核素標(biāo)記物（放射性同位素）：靈敏度高，常用

32P,35S,3H,125I,14C（二）非核素標(biāo)記物：靈敏度低，但無放射性污染，探針標(biāo)記后可長期保存（2年以上），常用生物素、地高辛、辣根過氧化物酶（HRP）、熒光素（FITC、羅丹明類）、化學(xué)發(fā)光劑三、標(biāo)記方法主要介紹DNA探針的體外酶促標(biāo)記法（一）缺口平移法（nicktranslation）

1、利用DNase

Ⅰ在DNA雙鏈上隨機切割，造成單鏈缺口

2、缺口處一個5’-末端，一個3’-末端，3’-OH可作為引物，在DNApolⅠ的催化下，按5’3’方向合成新的DNA單鏈

3、DNApolⅠ的5’3’外切酶活性在切口處將舊鏈5’-端逐步切除，新合成鏈不斷合成，因為新合成鏈的底物是帶標(biāo)記的*dNTP,從而使原DNA分子上的部分核苷酸被標(biāo)記的核苷酸所取代

（二）隨機引物法（randomprimer）

隨機引物是人工合成的長度為6個核苷酸殘基的寡聚核苷酸的混合物，對于任意一個DNA片段，隨機引物混合物中都含有

一些核苷酸片段與之結(jié)合，起到引物的作用。以帶標(biāo)記的

*dNTP

為底物，合成帶有標(biāo)記的探針（三）PCR標(biāo)記法在PCR反應(yīng)底物中，將一種

dNTP換成帶標(biāo)記的*dNTP（四）末端標(biāo)記法只標(biāo)記DNA的5’-端或3’-端，而非DNA全長，標(biāo)記活性低四探針的純化（一）乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，而dNTP等小分子物質(zhì)則留在上清中，所以用無水乙醇沉淀2-3次即可達(dá)到純化的目的。此法由于操作簡便，一般常被用來純化探針。

（二）

SephadexG-50柱層析法：利用

SephadexG-50凝膠的分子篩作用，將DNA探針與

dNTP等小分子物質(zhì)分離。（大分子探針隨著流動相流出，而小分子物質(zhì)則滯留在凝膠層

析柱中。SephadexG-50層析柱的柱床不宜過大，以防第一峰體積過大，影響雜交液的配制。如果體積過大，可用乙醇沉淀