stratagenemx3005熒光定量實(shí)驗(yàn)方法操作手冊(cè)

Stratagene定量PCR儀標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法定量PCR定量的基本原理就是用已知拷貝數(shù)梯度稀釋的樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較從而得到未知樣品的量。無(wú)論是在基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)還是在病原微生物檢測(cè)應(yīng)用中都有可能要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別用于絕對(duì)定量和相對(duì)定量。標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備1、絕對(duì)定量。絕對(duì)定量就是要確定未知樣品的拷貝數(shù)。對(duì)于這類(lèi)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)某種方法制備得到的已知拷貝數(shù)的含有目標(biāo)片段的核昔酸序列。最常見(jiàn)的是插入有目標(biāo)序列的質(zhì)粒，因?yàn)橘|(zhì)粒是環(huán)狀DNA有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，而且分子量比較大定量的時(shí)候比較準(zhǔn)確。也有用線狀的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品的，通常要比擴(kuò)增的目標(biāo)片段要大一些，這也是為了獲得分子量比較大的片段，提高拷貝數(shù)的準(zhǔn)確性。標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)是通過(guò)紫外定量的方法來(lái)確定，先得到標(biāo)準(zhǔn)品的濃度C（ng/uL）,因?yàn)闊o(wú)論是質(zhì)粒還是PCR產(chǎn)物它們的序列都是已知的，這樣通過(guò)核昔酸的相對(duì)分子量和標(biāo)準(zhǔn)品序列信息估算出標(biāo)準(zhǔn)品的分子量B,則標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)A（copy/uL）為：A=C/Bx+142、相對(duì)定量。主要是針對(duì)基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)而來(lái)的，因?yàn)橐蓝际窍鄬?duì)的數(shù)值（對(duì)照樣品和實(shí)驗(yàn)樣品中基因表達(dá)的比值），這樣就不需要知道精確的拷貝數(shù)，所以標(biāo)準(zhǔn)品也就無(wú)須知道精確的拷貝數(shù)，只需知道稀釋的倍數(shù)就可以了。實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)品可以是來(lái)源比較豐富的細(xì)胞或組織的RNA轉(zhuǎn)錄得到的cDNAo將這種cDNA進(jìn)行梯度的稀釋?zhuān)梢允窍♂?0倍，100,1000,10000等倍（具體實(shí)驗(yàn)要根據(jù)具體的情況來(lái)調(diào)整稀釋倍數(shù)。最好能作一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)看看什么樣的稀釋倍數(shù)比較適合這種基因的擴(kuò)增）。而對(duì)于各個(gè)稀釋倍數(shù)要對(duì)它的拷貝數(shù)進(jìn)行賦值，這個(gè)值當(dāng)然不是標(biāo)準(zhǔn)品中真實(shí)含有的基因數(shù)量，當(dāng)然在基因表達(dá)分析中也不需要，而是要求根據(jù)稀釋倍數(shù)給每一個(gè)稀釋度人為賦予的拷貝數(shù)，這只是為了方便實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的計(jì)算而已。比如可以把前面稀釋十倍的樣品賦值為10000個(gè)拷貝，100倍的賦值為1000個(gè)拷貝依次類(lèi)推把10000倍的賦為10等。要注意，賦值的數(shù)目的倍數(shù)差異和稀釋的倍數(shù)應(yīng)該是一樣的，比如前面是10稀釋?zhuān)竺尜x值也是10倍變化。如何做標(biāo)準(zhǔn)曲線在定量實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品是要和未知樣品一起進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)的，這樣在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)品還是未知樣品都將跑出曲線，獲得了Ct值。那么先可以把未知樣品放到一邊，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)說(shuō)，既獲得了Ct值，還知道他們的拷貝數(shù)（雖然對(duì)于相對(duì)定量來(lái)說(shuō)這個(gè)拷貝數(shù)是我們自己賦予的）。這樣可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值和拷貝數(shù)做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，而Ct值為縱坐標(biāo)）。一旦作出了標(biāo)準(zhǔn)曲線，而未知樣品的Ct值知道（通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得的），這時(shí)候就在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行定位，就可以得到未知樣品的拷貝數(shù)了。事實(shí)上，操作起來(lái)沒(méi)有那么復(fù)雜，只需要告訴軟件哪個(gè)孔是標(biāo)準(zhǔn)品，哪個(gè)是未知樣品，以及標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)等必要信息，軟件會(huì)自動(dòng)幫把標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣品的拷貝數(shù)計(jì)算出來(lái)了。

舉例來(lái)說(shuō)如何進(jìn)行設(shè)置1、先進(jìn)入軟件，在板設(shè)置中選擇所放樣品的位置，并標(biāo)上unknow或standard等信息。2、選擇要使用的熒光染料。CollectfluorescencedataPCY5rHEXrROX▼*SYBRjAll1231456789101112ABUnknownLhknoivnUrknowiUnkiomUnkro^nUnknowUnknovnUnknowUnknotUnknowLhknoivnUrknowiStsndardstandardStandardCtandsrdstandardStandardStandardStandardStandardSt5ncfard及ocdardStandardCDNTCRTCE3、設(shè)置復(fù)孔。如果有些孔有重復(fù)就用用樣的數(shù)字標(biāo)明，這樣儀器就知道哪些是重復(fù)，最終結(jié)果處理的話也可以取平均等操作。IdentifyreplicatesReplicatesymbol:|<none>

有相同標(biāo)號(hào)的系統(tǒng)就認(rèn)為是同樣的樣品的重復(fù)。4、標(biāo)準(zhǔn)品賦值接下來(lái)要給標(biāo)準(zhǔn)品賦上值，系統(tǒng)要知道按照什么去計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品賦值要先選上要賦值的標(biāo)準(zhǔn)品，然后在工具面板中輸入相應(yīng)的值。Standardquantity:|<all>|1C|填入標(biāo)準(zhǔn)品的量有相同標(biāo)號(hào)的系統(tǒng)就認(rèn)為是同樣的樣品的重復(fù)。4、標(biāo)準(zhǔn)品賦值接下來(lái)要給標(biāo)準(zhǔn)品賦上值，系統(tǒng)要知道按照什么去計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品賦值要先選上要賦值的標(biāo)準(zhǔn)品，然后在工具面板中輸入相應(yīng)的值。Standardquantity:|<all>|1C|填入標(biāo)準(zhǔn)品的量Standardunits:自動(dòng)增加稀釋倍數(shù)為了方便設(shè)置系統(tǒng)有一個(gè)自動(dòng)增加稀釋倍數(shù)的設(shè)置，點(diǎn)開(kāi)后就可以選擇你的稀釋倍數(shù)，然后用鼠標(biāo)去選擇孔的時(shí)候會(huì)自動(dòng)增加Standardquantity:|<all>色|10Standardquantity:|<all>色|10Plateut。一工ncroment：10▼StandarcIdentifyReplic選擇稀釋倍數(shù)每次選擇不同的孔，在里面賦的值會(huì)自動(dòng)按照倍數(shù)增加5、設(shè)置溫度在這里提供一個(gè)對(duì)于SYBR染料常用的溫度的控制模板，可以參考。注意最后的溶解曲線制作過(guò)程在升溫的過(guò)程中選擇標(biāo)有alI的放大鏡，代表從55℃5、設(shè)置溫度在這里提供一個(gè)對(duì)于SYBR染料常用的溫度的控制模板，可以參考。注意最后的溶解曲線制作過(guò)程在升溫的過(guò)程中選擇標(biāo)有alI的放大鏡，代表從55℃到95℃逐漸升溫的過(guò)程中不停的檢測(cè)熒光信號(hào)。100ThermalProfile75-50-25-Segment1Segment2Segment31Cycle40Cycles1Cycle6、設(shè)好了之后可以運(yùn)行程序了，最后的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出，也會(huì)算出未知樣品的拷貝數(shù)。Stratagene熒光定■:PCR儀基因表達(dá)分析解決方案Stratagene熒光定量PCR儀和配套的Mxpro軟件在處理基因表達(dá)分析方面的功能比較強(qiáng)大，下面簡(jiǎn)要說(shuō)明如何使用該軟件來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)分析。例如要分析IL1基因的表達(dá)情況，用看家基因GAPDH作為內(nèi)參，采用的是SYBRGreenl染料法。1、板設(shè)置、專(zhuān)門(mén)的基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ健４蜷_(kāi)Mxpr。程序操作窗口，首先彈出的對(duì)話框是要用戶選擇要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型，做基因表達(dá)分析可以選擇第二項(xiàng)ComparativeQuantitation(CaIibrator)。NctExperiBentOptionsSelectexperimenttypeReal-time:「QuantitativePCR(MultipleStandards)??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????、,ComparativeQ113ntigtion(Calibrator!*???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????「SYBR?Green(withDissociationCurve)「AHeIeDiscrimination/SNP'$Real-Time''MolecularBeaconMeltingCurvePlateread:(QuantitativePlateRead(PlateRead/AlleleDiscriminationPTurnlamponforwarm-up?FDoMshowthis-ajain、方便的類(lèi)型選擇和孔設(shè)定。在板設(shè)置中選擇樣品的類(lèi)型，可以將樣品的名稱寫(xiě)成GAPDH和IL1,并將GAPDH設(shè)為看家基因(NORM),這樣設(shè)置非常清晰，有利于分析結(jié)果。如果實(shí)驗(yàn)中使用了復(fù)孔，則在復(fù)孔上標(biāo)上相同的數(shù)字，代表這些樣品是重復(fù)，下圖中每個(gè)樣品重復(fù)三次。All123456709101112AUnUncwnUnkTOunUnkno-wiUnknownUnknovnUnknownUnkrounUnk^o>A*nUnknoxvnUnknovn.UnknownUnkrounBUnknown111Unkn^wIL1UnknoivnIL1UMnownIL1UnknovnIL1UnknowIL1UnkrowiIL1UnkiomIL1UnknowIL1UnknovnIL1UnknowIL1Unkro^nIL1CD基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)同一個(gè)cDNA既要做目的基因，也要做看家基因?？醇一蚝湍康幕騺?lái)自同一樣本的用相同的字母來(lái)標(biāo)記，如果是對(duì)照樣品則標(biāo)上Calibrator。

、方便而快捷的反應(yīng)條件設(shè)定?？梢院苋菀自O(shè)定擴(kuò)增反應(yīng)條件和熔解曲線條件。Se^rent1Segrrierc2Se^rent1Segrrierc2Segment340Cycles2、結(jié)果分析、多種分析結(jié)果可供選擇擴(kuò)增曲線，其中紅色表示目的基因，綠色表示看家基因（和板設(shè)置中選擇的顏色相同）標(biāo)準(zhǔn)曲線，看家基因和待測(cè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線都能被作出來(lái)，并顯示出分別的擴(kuò)增效率。如果不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用戶也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)寫(xiě)入擴(kuò)增效率的值，這樣最后的計(jì)算結(jié)果也可以根據(jù)用戶寫(xiě)入的擴(kuò)增效率進(jìn)行計(jì)算。擴(kuò)增效率的引入方法是點(diǎn)軟件操作界面上方的Termsettings鍵△,打開(kāi)Analysistermsettings對(duì)話框，點(diǎn)里面的EfficiencySettings,在efficiency框中輸入不同基因的擴(kuò)增效率。AnalysisTeraSettings-RealTiaeBwsalinwCorrAction|Siaothinghplic?t?sEfftcier^ySetti&cs|ActivezottmgT：4npiif：siionAss47SlopeEfficiency)0\SKE阿Srw|-3.39忸.4WA11WA11WA11Defaults▼Iffaci4ncySetting:5。*os4dindat4msnixigCcaporativcConsequently?thesesettings4rewHl4blccnlyforthis熔解曲線，其中紅色表示目的基因，綠色表示看家基因，峰位置代表產(chǎn)物的Tm值的溫度,圖中可以看到看家基因和待測(cè)基因的產(chǎn)物基本具有相似的Tm值?；虮磉_(dá)差異柱壯圖顯示，程序可以自動(dòng)計(jì)算出基因表達(dá)的差異，并用柱壯圖顯示出來(lái)，每一個(gè)柱表示一個(gè)樣本，基因表達(dá)的趨勢(shì)清晰可見(jiàn)，對(duì)照樣本被算為1。柱壯圖還可以表示成Log的形式，這樣可以清楚分開(kāi)上調(diào)和下調(diào)的樣本。數(shù)據(jù)文本顯示，實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)可以以文本的形式顯示出來(lái)，用戶可以很直觀的看到用于計(jì)算的具體數(shù)據(jù)，自己也可以利用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。、數(shù)據(jù)導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的結(jié)果都可以方便地導(dǎo)出，圖片可以導(dǎo)成圖片格式、Excel圖片或Powerpoint等,數(shù)據(jù)也可以導(dǎo)入Excel或文本文件中。“KxPro-Kx3000P(Si皿-CuspaxativeQaaxititatiun-(D:\DocuAentaand5Instr(ncxl2o?lsSectionVie/\ioda、Me.ClrUP2Pm..Ctrl府Clave邀|?」Wsutts)SmCtrl^SSova4s...CuatkIr-joriV.llA.”?_L加“hold血)Ctl/ttr.jIR<1Qu*r.tto1i口7”，Tx<trtr.tnt>[ExpertTnK?rua*r.tDat*taEreel?Expertgiat。F316?Expori：InstritentDatdtoDTLFile?IxjoriO.4T1DNa)t?7ortTextE3rt)Sotri“rojgrsnt?Ctrl>Yt?7ortt?pkdceFileCtrl*-1CcagrltoNwBxpfrrie4ntYypaIxpcrartal□.LEfil339。.儂121.學(xué)O.I&l20.79FrtaiFm￡?S?txp.trial..Ctrl^FFriatScraanAlt*?hridttQorlFrtat77回"1Co?pSybrerupleZJ:XDXW!fv)\\rMip\ctrpl2Co?p?-itive0J-20-0X6,J^tr涮c1O1-3&-2OK.12HrISV.n50k1勿20電l2Hrl6V)n6I2-OC-2005.22Hr39WinExit多種數(shù)據(jù)的導(dǎo)出形式。

基因表達(dá)分析板設(shè)置方法Stratagene熒光定量PCR儀的應(yīng)用軟件MxPro提供了比較強(qiáng)大的基因表達(dá)差異分析功能，要很好的運(yùn)用這些功能的前提是要告訴儀器一些必要板設(shè)置信息。下面舉例子來(lái)說(shuō)明如何來(lái)進(jìn)行板設(shè)置。在這里舉一個(gè)例子，用SYBRGreenl染料法，用GAPDH作內(nèi)參，檢測(cè)不同樣品中LI1的基因表達(dá)差異，在這里要設(shè)置各自的標(biāo)準(zhǔn)品樣品和陰性對(duì)照等信息。首先打開(kāi)分析軟件，選擇基因表達(dá)分析一項(xiàng)HewExperiaentOptioitsSelectexperimenttypeReal-time:'QuantitativePCR(MultipleStandards)C^ComparativeQuantitation(CalibratoriCSYBR?Green(withDissociationCurve)「AlleleDiscrimination/SNR'sReal-Time'MolecularBeaconMeltingCurvePlateread:'QuantitativePlateRead「PlateReadIAlleleDiscrimination廠Don'tshowthisagain基本信息設(shè)量:軟件首先出現(xiàn)的界面就是板信息設(shè)置界面。先選中要放置反應(yīng)管的位置A-D四行，接下來(lái)就是在程序界面的右邊的設(shè)置命令面板上給選中的孔上填入信息。信息的輸入順序一般是從上到下的。首先要選擇孔的類(lèi)型（Welltype）。在孔類(lèi)型中可以選擇Unknow（未知樣品），Standard（標(biāo)nov/o準(zhǔn)品），NTC（陰性對(duì)照）等。為了方便起見(jiàn)，我先將所有的孔都設(shè)置nov/o準(zhǔn)品），NTC（陰性對(duì)照）等。為了方便起見(jiàn)，我先將所有的孔都設(shè)置設(shè)置命令面板然后再選擇使用的熒光染料，這里由于只用到了SYBRGreenI一種熒光染料，所以就選上SYBRo如果實(shí)驗(yàn)當(dāng)中用了幾種熒光染料，就可以將這幾種熒光染料都選中。CollectfluorescencedatarCY5rHEX▼▼/???????????????rROXJ75YBRT：▼當(dāng)選中了熒光染料之后，板設(shè)置的基本信息已經(jīng)輸入電腦了，實(shí)驗(yàn)可以運(yùn)行了。以下信息可以在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前設(shè)置，也可以在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后再設(shè)置。不同基因設(shè)置：由于做基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)通常要做目的基因和看家基因，所以接下來(lái)要告訴軟件目的基因和看家基因的名字，軟件才能加以區(qū)分。點(diǎn)Assignassayname打開(kāi)如下對(duì)話Referencedye:司AssignAssayNames...Referencedye:司AssignAssayNames...框二寫(xiě)看家基因和目的基因名由于用SYBR染料做兩種基因，所以應(yīng)該在SYBR后面的Assay欄中寫(xiě)入看家基因和目的基因名稱。假設(shè)前兩排是GAPDH,后兩排是IL1,則可以在assignassayswithinselectedweIIs中選擇SYBR并輸入GAPDH和IL1的名稱，同時(shí)你可以選擇一個(gè)顏色代表不同的基因。這樣系統(tǒng)就可以分辨哪個(gè)孔是什么基因了。

用紅色代表IL1All123I456789101112AUrt<noxvnLrikno(vriUrknownUnknovmUnkrounUnknownUnknownUnknownUnknownUnknownUiknoTvnUrknown|fzrtpriuGAPDHGAPDHGPPDHGAPDHGAPDHGAPDHGAPDHGAPDHUCO^/T^Unkf-QxcUckUnknovT^JokoOUnkn0VUcRcov<t'BGWPOHG/口HCAPOHOX?PDHOAPDH0Ai0卜OAPDHOAPDHOAPDHOAPDHO/V^DHGAPDHCIL1IL1IL1IL1IL1IL1IL1IL1IL1IL1IL1IL1LcknowT1^UnknownUnkcoUcXcoxw^no-vr^DIL1IL1IL1IL1IMIL1IMIL1IMIL1IL1IL1■■■■■■■這時(shí)候軟件只知道在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了兩個(gè)基因，而哪個(gè)基因是看家基因并不知道，下一步是要告訴系統(tǒng)哪一個(gè)是看家基因，在Normalizingassay中選擇GAPDH就可以了AssignAssayNames...yNormalizingassay:<none>:Standardquantity:<none>CY5ROXHEX|1.00e4-003皿t:10▼]luuiiulyr~9■,?iiUi這時(shí)候原來(lái)圖上的GAPDH就變成了NORM重復(fù)設(shè)置：接下來(lái)設(shè)置重復(fù)，每一個(gè)樣品設(shè)置了三個(gè)重復(fù)。如果一個(gè)樣品重復(fù)三次，這些相同重復(fù)的樣品可以標(biāo)上同樣的一個(gè)數(shù)字，這時(shí)系統(tǒng)就知道標(biāo)有同樣數(shù)字的孔是重復(fù)樣品，將來(lái)在分析數(shù)據(jù)的時(shí)候可以對(duì)這些樣品進(jìn)行取平均等操作。

All123456789101112AUnknovm■LhkiownUnknownUnknovmUnkno-mUr-kro'AnUnkncvmUnknovnUnknovmLh心ownKUnkrovnUnkno\yr*BUnknowLhkiomUnkro^nUnknowIhknomUfkrDMiUnkncwnUnknovnUnknoxvnLhkiomUnknovn一CUnknownIL1LnknownIL1UnknownIL1UnknownIL1UiknoivnKIL1UrkrowiIL1UnknownIL1UnknovnIL1Urt<no師IL1LriknoMiIL1UnkrovnIL1UnknownIL1DUnknowIL1Unkrox^nIL-1UnknownIMLKknomIUUNrowiIL1Unknc<wnIL1UnknovnIL1IL,1IhilIL1IL1IME標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)■:先將標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品分開(kāi)，在本實(shí)驗(yàn)中A行為看家基因的標(biāo)準(zhǔn)品，C行為目的基因的標(biāo)準(zhǔn)品。分別選擇A行和C行，在WeIItype下拉菜單中選擇Standard將其設(shè)置成標(biāo)準(zhǔn)品類(lèi)型。在設(shè)置命令面板Standardquantity中寫(xiě)入標(biāo)準(zhǔn)品的量。可以利用Auto-Increment來(lái)自動(dòng)設(shè)置稀釋的倍數(shù)。Standardquantity:|<^||>三］|l.00e+001/??????????????????????????????????????????????????加t。一工ncremeRt：1C▼、??????????????????????????????????????????????????All1235G7I89101112^ESEj33II■■界:《■]Standard1334BUrknowiunmomUnkrowiUnknowri二UnKnowUnknovnUnxnowunknomLnmomUnkD3wCStandardStanda-dStandardStandardStandardSiardardStandardStandardStandardStandard1.0Qe林00100€40001OOe-iOOO1DOe-KOI1OOe-KOI1COe+OO?1.0G?-H)02|1.00e*0021.00鞏I031.0M4003D■lidJE■■■樣品組織分類(lèi)：看家基因和目的基因未知樣品應(yīng)該對(duì)應(yīng)起來(lái)，即同一個(gè)cDNA樣品應(yīng)該既作了目的基因也作了看家基因。再接下來(lái)把來(lái)自同一個(gè)cDNA的樣品的目的基因和看家基因擴(kuò)增標(biāo)出來(lái)?？梢栽贗dentifyassociations中的下拉菜單中選擇一個(gè)字母來(lái)標(biāo)記用同一個(gè)cDNA模板分別擴(kuò)增目的基因和看家基因的孔。identifpassociationsAssoc,symbol:<none>usetogroupgenesnormalizersfromdiffidentifpassociationsAssoc,symbol:<none>usetogroupgenesnormalizersfromdiff上圖中的ABCD表示標(biāo)號(hào)相同是來(lái)自同一份組織，這樣就把同一份組織中的看家基因和目的基因?qū)?yīng)了起來(lái)。選擇對(duì)照樣本：在基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中總要選擇一個(gè)cDNA樣本作為基因表達(dá)的基準(zhǔn)，比如實(shí)驗(yàn)中會(huì)有一個(gè)正常樣本，最后的表達(dá)結(jié)果作為1,所有其他的樣本的基因表達(dá)量都和它相比較,這個(gè)作為基準(zhǔn)的樣品稱為Calibratoro在板上選中這個(gè)cDNA樣品對(duì)應(yīng)的目的基因和看家基因,在weIItype中選擇caIibrator。這樣板設(shè)置就完成了。熔解曲線設(shè)置方法熔解曲線的原理定量PCR的熒光標(biāo)記方法通常有兩種，一種是探針?lè)?，一種是染料法。染料法通常指的是用SYBRGreenI染料作為熒光標(biāo)記。SYBRGreenI這種染料之所以可以用來(lái)定量，是因?yàn)樗奶厥庑再|(zhì)決定的。第一，它可以非特異性地結(jié)合到雙鏈DNA的小溝處，和單鏈DNA以及蛋白都不結(jié)合。第二，SYBRGreenI這種染料游離存在的情況下它沒(méi)有熒光，一旦它和雙鏈DNA結(jié)合了，再用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)它時(shí)就可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光（大概是游離狀態(tài)的1000倍）。我們?cè)傧隤CR的過(guò)程，PCR的最終產(chǎn)物正是雙鏈DNA,隨著每次的循環(huán)雙鏈DNA產(chǎn)物的數(shù)量成指數(shù)增長(zhǎng)。如果把SYBRGreenI這種染料加入到反應(yīng)體系中，就可以隨著每次循環(huán)結(jié)合到雙鏈DNA產(chǎn)物上。產(chǎn)物的量越多，結(jié)合的染料就越多，染料發(fā)出的熒光就和產(chǎn)物的量成正比，因此通過(guò)檢測(cè)SYBRGreenI的熒光就可以時(shí)實(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的產(chǎn)物變化。SYBRGreenI染色法的優(yōu)越性是使用方便，不用專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)探針。想檢測(cè)不同的基因只用在PCR體系中加入同一種熒光物質(zhì)就可以。而且價(jià)格非常便宜，因此在科研領(lǐng)域里還是非常常用的。但它主要的缺點(diǎn)是靈敏度不夠。因?yàn)镾YBRGreenl可以和DNA雙鏈非特異性的結(jié)合，那么如果PCR反應(yīng)有非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物或引物二聚體的話也會(huì)結(jié)合這種染料，因此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果往往就會(huì)受到一些因素的干擾。當(dāng)采用SYBRGreenl染料法做定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)為了確定實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物中有沒(méi)有引物二聚體或非特異性的引發(fā)，一般要在反應(yīng)結(jié)束之后做一個(gè)熔解曲線。熔解曲線的原理是根據(jù)SYBRGreenl染料只和雙鏈DNA結(jié)合的特性，設(shè)計(jì)一個(gè)從55℃到95℃逐漸升溫的過(guò)程，隨著溫度的升高,雙鏈DNA在不斷的解鏈，SYBRGreenI染料的結(jié)合數(shù)量也在減少，發(fā)出的熒光也越來(lái)越少，當(dāng)?shù)竭_(dá)產(chǎn)物Trn值的時(shí)候，熒光信號(hào)突然下降，然后趨于平緩，這時(shí)雙鏈完全解開(kāi)，不發(fā)熒光。一個(gè)典型的熔解曲線如下（縱坐標(biāo)是熒光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)是溫度）：通過(guò)數(shù)學(xué)換算，熒光信號(hào)變化最快的溫度就可以換算出一個(gè)峰，這個(gè)峰的位置就代表產(chǎn)物的Tm值。如果產(chǎn)物當(dāng)中有多種組分比如引物二聚體（如下圖），這樣就會(huì)出現(xiàn)多個(gè)峰，這樣就可以判斷出是否有引物二聚體或其他組分，反應(yīng)條件是否需要優(yōu)化。Stratagene軟件如何進(jìn)行熔解曲線設(shè)定Stratagene軟件熔解曲線實(shí)驗(yàn)方法設(shè)定有兩種1、利用AlIpoint檢測(cè)。Stratagene軟件具有兩種檢測(cè)熒光檢測(cè)方式，一種是Endpoint另一種是AlIpointEndpoint是在整個(gè)反應(yīng)步驟的末尾檢測(cè)熒光信號(hào),Allpoint是在整個(gè)反應(yīng)步驟中盡可能多的檢測(cè)熒光信號(hào)。所以就可以利用AlIpoint在55℃到95℃升溫過(guò)程中檢測(cè)熒光信號(hào)。設(shè)置方法是將AlIpoint標(biāo)志式從設(shè)置命令面板上拖到溫度曲線上。2、利用循環(huán)升溫設(shè)置。這是利用PCR儀每個(gè)循環(huán)溫度可以升高一定溫度的特性來(lái)做的。先設(shè)計(jì)出如下的溫度曲線形式：在40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)結(jié)束后，又設(shè)計(jì)了兩個(gè)Segment,3和4。Segment3是升溫到95'C,1個(gè)循環(huán)。接著設(shè)置Segment4中的溫度，可以雙擊55'C的溫度平臺(tái)打開(kāi)如下對(duì)話框：113K|113K|Duration:|皿題min:$ecOneel|Temperature:|553degreeSjyi/DiriuiciiDieTime:阿嗚[TTndegreesTemperature:|uu二|/cycle(negativettfordecrement]Tppe:|<rione>二Jitofendpoints:31JPlateauProperties拖到溫度曲線上在Cycleincrements中設(shè)置循環(huán)溫度升高幅度。如果設(shè)計(jì)每個(gè)循環(huán)升高0.20C,則在Temperature中輸入0.2℃,如果從55℃升溫，每次增高0.2℃則需要進(jìn)行201個(gè)循環(huán)才能到達(dá)95℃,所以循環(huán)數(shù)應(yīng)為201a在Datacollection中選擇Type為Endpoint,#ofendpoints設(shè)定為1（只采集一次熒光信號(hào)），設(shè)定結(jié)果如下：

PlateauProperties最后得到的溫度曲線設(shè)置圖是:SNP檢測(cè)應(yīng)用熒光定量做SNP檢測(cè)的原理SNP(singlenucleotidepolymorphisms)即單核昔酸多態(tài)性,是人類(lèi)基因組中最簡(jiǎn)單的一種多態(tài)性形式，是指在不同的基因樣本中，的某一位點(diǎn)只有一個(gè)堿基的不同。雖然DNA的組成中有4種堿基，但在SNP中一般只有兩個(gè)堿基的互換，所以它是一種二態(tài)性的標(biāo)記。正因?yàn)镾NP的這些特點(diǎn)，要用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)某一未知樣品是否有某一位點(diǎn)的SNP,就只需要設(shè)計(jì)兩條探針?lè)謩e用不同的熒光標(biāo)記，這兩條探針只在這個(gè)SNP位點(diǎn)有一個(gè)堿基的不同。最后用定量PCR反應(yīng)檢測(cè)是哪一種熒光被釋放出來(lái)了，就可以說(shuō)明該位點(diǎn)應(yīng)該是怎樣的SNPo最后介紹如何用定量PCR的辦法來(lái)檢測(cè)未知樣品的SNP位點(diǎn)。如圖，例如我們已知某一位點(diǎn)可能發(fā)生A到C的SNP變化，因此我們可以設(shè)計(jì)兩種探針在該位點(diǎn)分別設(shè)成T,Go只有一個(gè)堿基的差異，分別把這兩種探針標(biāo)記成不同的熒光。這樣在PCR反應(yīng)過(guò)程中，探針只有和模板完全匹配熒光才能被釋放出來(lái)，所以根據(jù)檢測(cè)到是哪種熒光就可以確定是否有相應(yīng)的SNP位點(diǎn)。這是檢測(cè)結(jié)果，左邊的檢測(cè)到一種熒光，說(shuō)明這個(gè)樣本的該位點(diǎn)只含有一種堿基。而右邊的圖中兩種熒光都被檢出，說(shuō)明這些樣本中兩種堿基的SNP都有。Mx3000P中SNP分析功能Mx3000P定量PCR軟件中提供了專(zhuān)門(mén)的強(qiáng)大的SNP分析功能。當(dāng)用戶打開(kāi)軟件后首先看到的是實(shí)驗(yàn)類(lèi)型的選擇包括：普通定量，相對(duì)定量，SNP分析，只讀板實(shí)驗(yàn)等，根據(jù)用戶的需要可以選擇不同的實(shí)驗(yàn)，就可以進(jìn)入不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ介_(kāi)展實(shí)驗(yàn)了。如果要進(jìn)行SNP分析可以有兩種選擇，可以選擇第四項(xiàng)AlleleDiscrimination/SNP,sReal-Time,就進(jìn)入專(zhuān)業(yè)的定量SNP分析程序界面，也可以選擇最后一項(xiàng)PlateRead/AIleleDiscrimination進(jìn)行專(zhuān)業(yè)的SNP終點(diǎn)判別。定量SNP分析是指利用定量PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)SNP,可以選擇實(shí)驗(yàn)類(lèi)型對(duì)話框中的第四項(xiàng)AlleleDiscrimination/SNP'sReaI-Time在板設(shè)置框中用戶可以輕松設(shè)置樣品類(lèi)型、名稱、所用熒光素等必要信息。由于SNP分析中需要進(jìn)行類(lèi)型的判定，所以必須設(shè)立可靠的對(duì)照，一般實(shí)驗(yàn)當(dāng)中要設(shè)立兩種熒光的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，還要有空白對(duì)照才能進(jìn)行結(jié)果判定。結(jié)果運(yùn)行后有強(qiáng)大的分析功能，包括擴(kuò)增曲線分析、雙點(diǎn)圖分析、板數(shù)據(jù)計(jì)算、板結(jié)果顯示和結(jié)果文本顯示等功能。非常方便易用用戶可輕松掌握。用戶如果只想通過(guò)終點(diǎn)判讀的方法分析SNP也可以選擇最后一項(xiàng)PlateRead/AHeleMx3000P只讀板定量分析是指在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，利用定量PCR的熒光讀取功能，對(duì)反應(yīng)的終點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，再通過(guò)軟件來(lái)判斷SNP分型的方法。Mx3000P軟件提供了PlateRead/AHeleDiscrimination功能，進(jìn)入只讀板模式來(lái)分析SNP,Mx3000P同樣提供強(qiáng)大的分析功能。一般實(shí)驗(yàn)當(dāng)中也要設(shè)立兩種熒光的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，還要有空白對(duì)照才能進(jìn)行結(jié)果判定。熒光定量PCR在基因表達(dá)分析中的常見(jiàn)問(wèn)題所謂基因表達(dá)就是指在特定的時(shí)刻某種感興趣的基因在組織或細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)數(shù)量。眾所周知，很多的疾?。ㄈ缒[瘤）的發(fā)生發(fā)展，很多藥物的作用機(jī)理，很多生物的代謝調(diào)控作用等都和基因表達(dá)的變化有關(guān)，因此對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精確定量是十分重要的。過(guò)去為了對(duì)mRNA進(jìn)行定量有了各種各樣的方法，如Southern雜交、Northern雜交、原位雜交、傳統(tǒng)PCR等，但是我們也都知道這些技術(shù)靈敏性較差，重復(fù)性不好，操作比較煩瑣，已經(jīng)無(wú)法滿足現(xiàn)在科研和檢測(cè)的需要，于是熒光定量PCR技術(shù)也就應(yīng)運(yùn)而生了。熒光定量PCR技術(shù)能對(duì)核酸進(jìn)行精確定量，因此大大提高了在基因表達(dá)的準(zhǔn)確性和靈敏度，廣泛的應(yīng)用于腫瘤研究、藥物篩選、功能基因組研究等各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)成了很多科研文章發(fā)表的重要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。基因表達(dá)分析中常見(jiàn)到的問(wèn)題1、采用什么樣的熒光標(biāo)記方法？熒光標(biāo)記方法一般有兩種，一種是探針?lè)?，另一種是染料法，即使用SYBRGreen染料。由于探針合成的成本比較高，探針設(shè)計(jì)也有一定的難度，所以在基因表達(dá)分析中經(jīng)常采用SYBRGreen染料法進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。檢測(cè)的原理是SYBRGreenI游離狀態(tài)下不發(fā)熒光，但當(dāng)反應(yīng)體系中有雙鏈DNA存在的情況下SYBRGreenI就可以非特異性的結(jié)合到DNA雙螺旋的小溝處，發(fā)出很強(qiáng)熒光。這樣隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物也在不斷積累，結(jié)合到雙鏈PCR產(chǎn)物上的熒光也就越來(lái)越多。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度就可以反映出反應(yīng)體系中產(chǎn)物的積累變化情況。這種SYBRGreenI染色法的優(yōu)越性是使用方便，不需要針對(duì)不同的基因?qū)ｉT(mén)設(shè)計(jì)探針。想檢測(cè)不同的基因只用在PCR體系中加入同一種熒光物質(zhì)就可以。而且價(jià)格非常便宜。但它主要的缺點(diǎn)是靈敏度不夠，如果PCR反應(yīng)中產(chǎn)生了引物二聚體也同樣會(huì)造成熒光信號(hào)的積累，因此在做實(shí)驗(yàn)前往往需要對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索。2、要檢測(cè)的基因有哪些？基因表達(dá)分析的目的就是檢測(cè)某種我們感興趣的基因在不同組織或細(xì)胞中的表達(dá)差異。熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)核酸物質(zhì)的含量進(jìn)行精確的定量，也就成了研究基因表達(dá)差異的一把利器。在基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)中要檢測(cè)兩個(gè)基因，一個(gè)是目的基因另一個(gè)是看家基因。之所以要引入看家基因最主要是由于不能確定要比較的樣品所用的組織起始量相同。就是說(shuō)比如提取正常樣品的基因時(shí)用了100個(gè)細(xì)胞，而提取病變樣品時(shí)只用了10個(gè)細(xì)胞，這時(shí)候的基因表達(dá)差異可能是由于提取時(shí)候的樣品細(xì)胞數(shù)不同引起的。為了糾正這種誤差，選用認(rèn)為在兩個(gè)樣本中表達(dá)量不變的看家基因作為內(nèi)參照，來(lái)去除樣品細(xì)胞數(shù)不同而帶來(lái)的干擾。例如，要研究某個(gè)基因在腫瘤樣品和正常樣品中的基因表達(dá)差異。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)要研究的正常樣品中的看家基因的表達(dá)量是腫瘤樣品中的10倍，就認(rèn)為正常樣品的細(xì)胞數(shù)就是腫瘤樣品細(xì)胞數(shù)的10倍，那么在腫瘤樣品中目的基因的基因表達(dá)量應(yīng)該乘以10倍，才能和正常樣品進(jìn)行比較。3、什么是擴(kuò)增效率？從理論上來(lái)說(shuō)PCR的擴(kuò)增應(yīng)該按照2的倍數(shù)向上遞增,這樣的擴(kuò)增效率我們認(rèn)為是100%,但是實(shí)際上的實(shí)驗(yàn)不能保證擴(kuò)增效率是100%,甚至有時(shí)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件、選用試劑、稀釋等存在的問(wèn)題擴(kuò)增效率還有可能高過(guò)100%。擴(kuò)增效率可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算出來(lái)，它只和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率有關(guān)。

PCR擴(kuò)增效率=1O'1slope)-4、基因表達(dá)差異如何計(jì)算？基因表達(dá)差異的計(jì)算是通過(guò)所得到的Ct值來(lái)計(jì)算的，要計(jì)算兩個(gè)樣品（待測(cè)樣品和對(duì)照樣品）的目的基因的表達(dá)差異必須檢測(cè)得到4個(gè)Ct值：待測(cè)樣品和對(duì)照樣品中目的基因和看家基因的Ct值。待測(cè)樣品對(duì)照樣品待測(cè)樣品對(duì)照樣品>ACt1AACt2基因表達(dá)差異二>ACt1AACt2基因表達(dá)差異二2(△Ct1-ACt2)目的基因看