第十二章 基因工程與藥物蛋白生產(chǎn) Genetic Engineering in

第十二章基因工程與藥物蛋白生產(chǎn)

GeneticEngineeringinMedicineandIndustrySometherapeuticproductsforusedinhumansGenentech公司1976年，27歲的風險投資人RobertSwanson與UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術(shù)的商業(yè)前景。討論結(jié)束時，他們決定建立一個公司，并取名為Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一個基因工程公司在學術(shù)界和商業(yè)界的滿腹懷疑中誕生了！Genentech的驕人業(yè)績1976Genentech創(chuàng)立1977首次在微生物里生產(chǎn)了人蛋白生長激素抑制素1978克隆了人胰島素基因1979克隆了人生長激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一個基因重組藥（人胰島素）上市（轉(zhuǎn)讓給Lilly公司）1984第一個VIII因子，轉(zhuǎn)讓給CutterBiological1985第一個自己生產(chǎn)的產(chǎn)品（人生長激素）1987生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑（tPA）1990生產(chǎn)interferon1

1990與瑞士Roche醫(yī)藥公司合并（$2.1billion）美國已批準上市的基因工程藥物（1997.7）中文名稱商品名稱英文名縮寫開發(fā)公司胰島素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生長激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干擾素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience白細胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒細胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒細胞巨噬細胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex紅細胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho組織溶纖原激活劑ActivaserhuTPAGenentech生長激素SerostinsomatotropinSerono促生長素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSeronoPharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral抗血友病因子VIIIKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄腦苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脫氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline體內(nèi)用單克隆抗體ReoproOrthoOKT-3OncoScintCR/OVOncoScintOC103OncoScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocorOrthoBiotechCytogenCytogenCytogenCytogen鼠單克隆抗體PanorexMurineMABGlaxoWelcome1中國已經(jīng)批準上市的基因工程藥物（1998.5）藥品名縮寫開發(fā)生產(chǎn)公司批準時間適應(yīng)癥rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a長春生研所上海生研所深圳興科長春生研所長生藥業(yè)三生藥業(yè)1989試1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖銳濕疣，皰疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲藥業(yè)里亞哈爾華立達安科華新1997正1996正1997正1997試1997試HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuINF

上海生研所克隆麗珠生物工程1994試1995試1995試類風濕類風濕類風濕rhuIL2長春生研所長春藥業(yè)四環(huán)制藥華新三生藥業(yè)深圳興科中華合通金絲利康利制藥1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995試1995試1995試癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療rhuG-CSF九源1997試化療生白血病rhuGM-CSF特寶1997試化療生白血病rSK醫(yī)大實業(yè)1996試心梗溶栓rhuEPO華欣永銘維沃1997試1997試再生障礙性貧血再生障礙性貧血bFGF（外用）珠海東大1996試創(chuàng)傷，燒傷1.Insulin:ConversionofpreproinsulintoinsulinThestructureofinsulinProinsulinandproductionofrecombinant-derivedinsulinbyseparatefermentationsforA-andB-chainsProcessusedtomakehumaninsulanfromfusionproteinssynthesizedinE.coliExpressionofhumaninsulininE.coli2.Growthhormone:DwarfismHumangrowthhormonedeficiencyStructureofthefirstvectorusedtoproducehumangrowthhormone(hGH)inE.coliBacterialproductionofhumangrowthhormone(hGH)Bacterialproductionofhumangrowthhormone(hGH)3.HBVvaccineProductionofasubunitvaccineinyeastProductionofasubunitvaccineinyeast4.tPAProductionoftissueplasminogenactivator(tPA)bymammaliancellcultureProductionofamonoclonalantibody(MAb)抗體攻擊病毒凝集細菌抗SARS的單抗SARS-CoV抗體是對其抗原有極強專一性的魔彈或巡弋飛彈研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測

特定抗原醫(yī)療 以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細胞檢驗 以ELISA偵測特定

病原體抗體生成技術(shù)Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基●

每個

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個以上氨基酸整體水平抗體生成技術(shù)細胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達技術(shù)多克隆抗體多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。

實際意義：（1）預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風抗毒素血清抗破傷風，胎盤球蛋白抗病毒感染等副作用：超敏反應(yīng)（2）臨床診斷，如：肥達氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點：特異性差。傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細胞

傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123單克隆抗體可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細胞

若與

癌細胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細胞株。癌細胞可培養(yǎng)生長漿細胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個Bcell只產(chǎn)生一種抗體

●

一個

B細胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一

抗原決定基?！?/p>

若有許多抗原決定基，則需許多株

B細胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開1234mmmm1234YYYYYYYYYm核酸補救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細胞株由脾臟收集B細胞抗原通常有多個抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX-d細胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細胞（Subcloning）

(確定只有一種細胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細胞Bcell脾細胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗專一性對抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原基因工程抗體1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。

構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。構(gòu)建重組表達載體克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。2鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應(yīng)。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。

經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進一步即可用于構(gòu)建和表達改形抗體。

定點突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。

研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進行操作。小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點:

可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力強;不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。

3小分子抗體FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽

Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。

連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法;在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時，可用定點突變法在其兩端造成適當?shù)膬?nèi)切酶位點，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達載體中;如果從雜交瘤細胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當?shù)谋磉_載體上。

單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式:一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達細菌蛋白總量的5%-20%，但需進行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性;二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。(3)單域抗體VH約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR4雙特異抗體和多價抗體

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。

雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。

即能結(jié)合靶腫瘤細胞又能結(jié)合高細胞毒性的效應(yīng)細胞,將效應(yīng)細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。

Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達質(zhì)粒,目前報道的表達質(zhì)粒均為雙順反子。表達后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細胞再導(dǎo)向至腫瘤細胞處,從而使效應(yīng)細胞的抗腫瘤活性增強,發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。

抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達，然后篩選出所需的特異基因和抗體。

PCR技術(shù);免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達;噬菌體表面展示文庫技術(shù)。5抗體庫技術(shù)

初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達后篩選。

它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與PⅢ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。噬菌體抗體庫技術(shù)

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。噬菌體表面展示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)

噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點: