植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)講解學(xué)習(xí)

植物細(xì)胞懸浮(xuánfú)培養(yǎng)技術(shù)第一頁(yè)，共50頁(yè)。單細(xì)胞的分離(fēnlí)由完整的植物器官分離單細(xì)胞由培養(yǎng)(péiyǎng)組織（如愈傷組織）中分離單細(xì)胞第二頁(yè)，共50頁(yè)。1由完整(wánzhěng)的植物器官分離單細(xì)胞機(jī)械(jīxiè)法酶解法葉片是分離(fēnlí)單細(xì)胞的最好材料第三頁(yè)，共50頁(yè)。1.1機(jī)械(jīxiè)法

方法A：用刀片刮葉片(yèpiàn)(花生成熟葉片(yèpiàn))第四頁(yè)，共50頁(yè)。具體方法:撕去表皮露出葉肉細(xì)胞用解剖刀刮下細(xì)胞第五頁(yè)，共50頁(yè)。方法B：葉片(yèpiàn)研碎、離心輕輕研磨加研磨介質(zhì)過(guò)濾、離心第六頁(yè)，共50頁(yè)。研磨介質(zhì)(jièzhì)：40ml20umolSucrose10umolMgCl220umoltris—HCL(三羥甲基氨基甲烷)PH7.8注意：只有薄壁組織排列松散，細(xì)胞間結(jié)觸點(diǎn)很少時(shí)用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成功。第七頁(yè)，共50頁(yè)。注意：大麥、小麥和玉米很難通過(guò)酶解法(jiěfǎ)使細(xì)胞分離。（葉肉細(xì)胞伸長(zhǎng)，并在許多地方收縮，細(xì)胞間形成一種互鎖結(jié)構(gòu)）第八頁(yè)，共50頁(yè)。事例分離籬天劍葉肉(yèròu)細(xì)胞的機(jī)械方法葉片消毒勻漿過(guò)濾離心植板75％酒精，7％次氯酸鈉10ml培養(yǎng)基1.5克1cm2葉片(yèpiàn)低速(dīsù)，去碎屑，游離細(xì)胞沉降第九頁(yè)，共50頁(yè)。1.2酶解法(jiěfǎ)Takebe等（1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉(yèròu)細(xì)胞加果膠酶過(guò)濾、離心第十頁(yè)，共50頁(yè)。1.3機(jī)械(jīxiè)法和酶解法比較機(jī)械(jīxiè)法酶解法(jiěfǎ)細(xì)胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量低；細(xì)胞易破。細(xì)胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞不易破。第十一頁(yè)，共50頁(yè)。2由培養(yǎng)(péiyǎng)組織（愈傷組織）分離單細(xì)胞材料(cáiliào)：胡蘿卜肉質(zhì)根步驟(bùzhòu)：1誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織2愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；第十二頁(yè)，共50頁(yè)。搖床用于振蕩(zhèndàng)繼代懸浮3Subculture將愈傷組織在液體(yètǐ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞團(tuán)成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣(kōngqì)交流。第十三頁(yè)，共50頁(yè)。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(péiyǎng)技術(shù)（Suspensionculture）特點(diǎn)：細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。必須指出(zhǐchū)：懸浮培養(yǎng)中既有單細(xì)胞，也有小細(xì)胞團(tuán)。概念：是指一種在受到不斷搖動(dòng)的液體(yètǐ)培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。第十四頁(yè)，共50頁(yè)。1、起始(qǐshǐ)懸浮液的制備愈傷組織液體培養(yǎng)基搖床振蕩懸浮培養(yǎng)質(zhì)地疏松，細(xì)胞分散程度大；質(zhì)地緊密，細(xì)胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)速30～150rpm防細(xì)胞破裂第十五頁(yè)，共50頁(yè)。第十六頁(yè)，共50頁(yè)。2、懸浮培養(yǎng)的基本(jīběn)形式分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)第十七頁(yè)，共50頁(yè)。2.1分批培養(yǎng)（Batchculture）2.1.1含義：將細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中除了氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(chǎnwù)可以同外界空氣交換外，一切都是密閉的。它是進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。第十八頁(yè)，共50頁(yè)。2.1.2特點(diǎn)(tèdiǎn)培養(yǎng)基體積固定當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞的分裂(fēnliè)和生長(zhǎng)也停止必須適當(dāng)攪拌第十九頁(yè)，共50頁(yè)。2.1.3繼代(jìdài)的方法和最佳時(shí)期繼代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。注意(zhùyì)：要適當(dāng)稀釋第二十頁(yè)，共50頁(yè)。繼代第二十一頁(yè)，共50頁(yè)。最佳繼代時(shí)期(shíqī)：選擇指數(shù)生長(zhǎng)期和直線生長(zhǎng)期。第二十二頁(yè)，共50頁(yè)。2.1.4細(xì)胞(xìbāo)生長(zhǎng)曲線在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)目不斷(bùduàn)發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長(zhǎng)停止的細(xì)胞周期。

細(xì)胞的生長(zhǎng)呈S形曲線第二十三頁(yè)，共50頁(yè)。滯后(zhìhòu)期(lagphase)指數(shù)(zhǐshù)生長(zhǎng)期(exponentialphase)直線(zhíxiàn)生長(zhǎng)期(linearphase)減慢期(progressivedecelerationphase)靜止期(stationaryphase)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1234512345第二十四頁(yè)，共50頁(yè)。滯后(zhìhòu)期(lagphase)細(xì)胞很少分裂，其時(shí)間長(zhǎng)短(chángduǎn)取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123451第二十五頁(yè)，共50頁(yè)。指數(shù)(zhǐshù)生長(zhǎng)期(exponentialphase)細(xì)胞(xìbāo)分裂活躍，細(xì)胞(xìbāo)數(shù)目迅速增加培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123452第二十六頁(yè)，共50頁(yè)。直線(zhíxiàn)生長(zhǎng)期(linearphase)細(xì)胞(xìbāo)生長(zhǎng)和發(fā)育最快的時(shí)期培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123453第二十七頁(yè)，共50頁(yè)。減慢(jiǎnmàn)期(progressivedecelerationphase)由于(yóuyú)培養(yǎng)基中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)耗盡，或是由于(yóuyú)有毒代謝產(chǎn)物的積累，細(xì)胞的增長(zhǎng)逐漸減慢培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123454第二十八頁(yè)，共50頁(yè)。生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)(zhuàngtài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開(kāi)始死亡。靜止(jìngzhǐ)期(stationaryphase)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123455第二十九頁(yè)，共50頁(yè)。小結(jié)：（1）滯后期的長(zhǎng)短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少。（2）加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過(guò)一段時(shí)間組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基。（3）縮短兩次繼代時(shí)間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一直保持指數(shù)生長(zhǎng)期。（4）如果使處在靜止期的細(xì)胞懸浮液保持時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞的大量死亡(sǐwáng)和解體。第三十頁(yè)，共50頁(yè)。操作注意事項(xiàng)：對(duì)懸浮(xuánfú)培養(yǎng)細(xì)胞繼代時(shí)，進(jìn)液口的孔徑要小，只能通過(guò)單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)（2～4細(xì)胞），使用吸管或注射器。繼代前，培養(yǎng)容器靜置短時(shí)間，大細(xì)胞團(tuán)沉降，再吸上層懸浮(xuánfú)液。依此，多次，可建立良好的細(xì)胞懸浮(xuánfú)培養(yǎng)物。第三十一頁(yè)，共50頁(yè)。2.2連續(xù)培養(yǎng)（Continuousculture）加入(jiārù)培養(yǎng)基排出(páichū)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物二者體積(tǐjī)相等分：開(kāi)放式連續(xù)培養(yǎng)封閉式連續(xù)培養(yǎng)第三十二頁(yè)，共50頁(yè)。開(kāi)放式和封閉式區(qū)別(qūbié)封閉式中：排出液中的細(xì)胞用機(jī)械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目(shùmù)不斷增加；開(kāi)放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞隨同培養(yǎng)液一起流出。第三十三頁(yè)，共50頁(yè)。連續(xù)培養(yǎng)意義：植物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的研究(yánjiū)某種生長(zhǎng)限制因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響次生物質(zhì)的大量生產(chǎn)紫杉醇是獲得美國(guó)FDA(1992)認(rèn)證的優(yōu)良抗腫瘤藥物。紅豆杉樹(shù)皮中紫杉醇的含量為萬(wàn)分之二，其在國(guó)際市場(chǎng)上售價(jià)為20萬(wàn)美元/kg第三十四頁(yè)，共50頁(yè)。由懸浮(xuánfú)細(xì)胞再生植株的途徑由懸浮細(xì)胞直接形成體細(xì)胞胚先將懸浮細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)(yòudǎo)形成愈傷組織，然后再由愈傷組織分化植株第三十五頁(yè)，共50頁(yè)。3細(xì)胞(xìbāo)懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基3.1懸浮培養(yǎng)(péiyǎng)對(duì)培養(yǎng)(péiyǎng)基的要求能用來(lái)建立生長(zhǎng)快、易散碎的愈傷組織的培養(yǎng)(péiyǎng)基，一般也適用于建立該物種的懸浮培養(yǎng)(péiyǎng)。在活躍生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)(péiyǎng)物中，無(wú)機(jī)磷酸鹽的消耗很快，不久成為限制因子。

第三十六頁(yè)，共50頁(yè)。Noguchi等(1977)證明，把煙草懸浮培養(yǎng)物保存在一種含有標(biāo)準(zhǔn)的MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)開(kāi)始3d之內(nèi)無(wú)機(jī)磷酸鹽的濃度就幾乎下降為零，即使把培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度提高到原來(lái)(yuánlái)的水平的3倍，5d之內(nèi)也會(huì)被細(xì)胞全部用完。高等植物的懸浮培養(yǎng)，B5和ER培養(yǎng)基。第三十七頁(yè)，共50頁(yè)。3.2條件(tiáojiàn)培養(yǎng)基把在液體培養(yǎng)(péiyǎng)基里培養(yǎng)(péiyǎng)4～6周的高濃度細(xì)胞濾掉，而用他的培養(yǎng)(péiyǎng)基制成懸滴或薄層來(lái)培養(yǎng)(péiyǎng)單細(xì)胞或低密度細(xì)胞群體。第三十八頁(yè)，共50頁(yè)。3.3培養(yǎng)基的振蕩(zhèndàng)防治細(xì)胞缺氧死亡(sǐwáng)防治大的細(xì)胞團(tuán)的形成第三十九頁(yè)，共50頁(yè)。3.4懸浮(xuánfú)培養(yǎng)細(xì)胞的同步化同步培養(yǎng)(péiyǎng)：指在培養(yǎng)(péiyǎng)中大多數(shù)細(xì)胞都能同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的各個(gè)階段。

應(yīng)用：為了便于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝第四十頁(yè)，共50頁(yè)。3.4.1物理(wùlǐ)方法A按細(xì)胞團(tuán)的大小通過(guò)對(duì)細(xì)胞物理特性（細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的大?。┑目刂疲詫?shí)現(xiàn)高度的同步化B低溫(dīwēn)休克法通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，以實(shí)現(xiàn)高度的同步化第四十一頁(yè)，共50頁(yè)。3.4.2化學(xué)(huàxué)方法A饑餓法先對(duì)細(xì)胞斷絕一種細(xì)胞分裂所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的饑餓后，當(dāng)重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會(huì)同步(tóngbù)進(jìn)入分裂。第四十二頁(yè)，共50頁(yè)。細(xì)胞周期（cellcycle)是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞分裂期：前期，中期(zhōngqī)，后期，末期第四十三頁(yè)，共50頁(yè)。3.4.2化學(xué)(huàxué)方法B抑制法使用DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶(mìdìnɡ)、羥基尿和胸腺嘧啶(mìdìnɡ)脫氧核苷當(dāng)細(xì)胞受到化學(xué)藥物抑制時(shí)，細(xì)胞周期只能進(jìn)行到G1，細(xì)胞滯留在G1期S期的邊界上。第四十四頁(yè)，共50頁(yè)。4懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞(xìbāo)生長(zhǎng)量的計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞密實(shí)(mìshi)體積（PCV）5％鉻酸或0.25％果膠酶使懸浮細(xì)胞團(tuán)分散(fēnsàn)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行。將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個(gè)15ml的離心管中，3000rpm離心，用每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的毫升數(shù)表示。細(xì)胞鮮重細(xì)胞干重第四十五頁(yè)，共50頁(yè)。細(xì)胞鮮重：細(xì)胞培養(yǎng)物過(guò)濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽濾，稱重。細(xì)胞干重：60℃干燥(gānzào)12h，稱重。以每毫升培養(yǎng)物或106個(gè)細(xì)胞的重量表示。第四十六頁(yè)，共50頁(yè)。5培養(yǎng)細(xì)胞活力(huólì)的測(cè)定相差顯微術(shù)法

TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）FDA法（熒光(yíngguāng)素雙醋酸酯法）伊凡藍(lán)法(Evan’sblue)（FDA的互補(bǔ)法）根據(jù)細(xì)胞質(zhì)環(huán)流(huánliú)和細(xì)胞核存在與否，鑒別細(xì)胞的死活。環(huán)流(huánliú)正常、核存在表明有活力；在活細(xì)胞中，TTC被還原成紅色甲鐟，提取甲鐟用分光光度計(jì)檢測(cè)?；盍κ軗p的細(xì)胞能夠攝取這種染料，完整的活細(xì)胞則不能，凡染藍(lán)色的細(xì)胞是不具有活力的細(xì)胞第四十七頁(yè)，共50頁(yè)。FDA法的原理(yuánlǐ)FDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細(xì)胞(xìbāo)膜。在活細(xì)胞(xìbāo)中，F(xiàn)DA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光素。熒光素不能