第四章動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)

第四章動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)圖4－1微膠囊示意圖生物大分子代謝產(chǎn)物細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)二、研究發(fā)展歷程1、首次報(bào)道生物活性物質(zhì)的微囊化研究（1957）：

將酶、蛋白質(zhì)和激素等生物活性物質(zhì)包封在選擇性透過膜中，形成球狀微膠囊,稱之為“生物微膠囊”。通過微膠囊膜的選擇透過作用,使囊外大于某一分子量的物質(zhì)不能擴(kuò)散進(jìn)入,而生物環(huán)境中的營養(yǎng)成分和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)或細(xì)胞分泌的小分子產(chǎn)物可以自由出入微膠囊,從而達(dá)到免疫隔離目的。2、“人工細(xì)胞”——“人工胰腺”80年代初,Lim等人將微囊化技術(shù)與組織細(xì)胞移植相結(jié)合,制備了海藻酸鈉/聚賴氨酸(APA)微膠囊,包埋豬胰島細(xì)胞形成“人工細(xì)胞”,并移植入糖尿病大鼠體內(nèi),結(jié)果成功地調(diào)節(jié)了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被稱為“人工胰腺”。該成果較好地解決了組織細(xì)胞移植過程的免疫排斥問題,避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用,為組織細(xì)胞移植治療神經(jīng)/內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供了新思路。3、90年代以來,醫(yī)學(xué)界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具,利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能,治療相關(guān)疾病。微囊化人胰島培養(yǎng)15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞培養(yǎng)0d微囊化肝癌細(xì)胞培養(yǎng)40d4、目前，微膠囊的應(yīng)用研究涉及藥物控制釋放、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞和酶的固定化以及生化物質(zhì)分離等領(lǐng)域,已經(jīng)成為材料、化學(xué)、化工、生物和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域工作者的研究熱點(diǎn)。

SEM下微膠囊的顯微形貌

×200LSCM下微膠囊表面形貌的照片不同放大倍數(shù)的海藻酸鈣微膠囊的SEM照片不同放大倍數(shù)的殼聚糖/海藻酸鈉微膠囊的SEM照片三、性質(zhì)：曾是酶固定化技術(shù)中的一種（半透膜將酶包裹在球狀的微囊里，酶及大分子不能從微囊里透出，而小分子物質(zhì)可自由通過膜）。動(dòng)物細(xì)胞微囊化后，與游離細(xì)胞相比，降低了培養(yǎng)時(shí)對(duì)細(xì)胞的剪切力，同時(shí)也能提供很高的細(xì)胞密度，使得產(chǎn)物濃度增加，純度提高。動(dòng)物細(xì)胞微囊化培養(yǎng)的成功為干擾素、乙肝表面抗原(HBsAg)、單克隆抗體(MAb)等)的產(chǎn)生提供了廣泛應(yīng)用前景。

表4－1微膠囊制備材料

來源類型材料天然脂質(zhì)卵磷脂、神經(jīng)鞘髓磷脂等多糖海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂、淀粉等蛋白質(zhì)明膠、白蛋白、纖維蛋白半合成纖維素類衍生物羧甲基纖維素鈉、已基纖維素、醋酸纖維素及其酯等合成可降解型乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚內(nèi)酯、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸非降解型聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯等制備方法化學(xué)法界面聚合法、乳化法、輻射化學(xué)法物理化學(xué)法相分離法、溶劑蒸發(fā)法、界面沉積法、噴霧干燥法物理法靜電沉積法、氣相沉積法、流化床噴霧包衣法圖2制備方法使用率比較

1－－乳化法，2－－靜電法，3－－聚合法，4－－沉積法，

5－－相分離法，6－－噴霧干燥法，7－－溶劑蒸發(fā)法

四、

微囊化培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn):

在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。生長(zhǎng)介質(zhì)為1.4%海藻酸鈉溶液,半透膜由多聚賴氨酸形成。培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)，微囊直徑控制在200-400μm為宜。微膠囊膜生物大分子代謝產(chǎn)物細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)五、動(dòng)物細(xì)胞微囊化的制備主要是應(yīng)用海藻酸—聚氨基酸的方法簡(jiǎn)單過程：動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣(cacl2)溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其中。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。針頭CaCl2液微珠磁力攪拌器（微囊發(fā)生器）海藻酸/細(xì)胞懸浮液聚氨基酸檸檬酸聚賴氨酸/海藻酸微囊化步驟：1.懸浮細(xì)胞膠狀液；2.成滴器；3.膠化小珠；4.包被溶液；5.顯微鏡下微囊；6.多孔微囊膜；7.完成操作后的微囊。

制備注意事項(xiàng)：

●溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；

●所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無毒害；

●膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過；

●膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

①可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷;②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜,從而提高細(xì)胞密度和產(chǎn)物含量,并方便分離純化處理。①微囊制作復(fù)雜,成功率不高;②微囊內(nèi)死亡的細(xì)胞會(huì)污染正常產(chǎn)物;③收集產(chǎn)物必須破壁,不能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化。六、微囊化培養(yǎng)的優(yōu)、缺點(diǎn):七、微膠囊在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用研究

1、在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究采用一定材料、方法制成的微膠囊本身并不具備治療疾病的作用,但能保證囊內(nèi)包埋的細(xì)胞存活且正常代謝、應(yīng)答式分泌有效物質(zhì),如胰島素、多巴胺和甲狀腺激素等,從而治療疾病。微膠囊膜的選擇透過作用可以保證細(xì)胞分泌的有效物質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生理功能,而將免疫球蛋白等抗體阻隔在囊外,避免了異種移植中最棘手的免疫排斥問題。2、在生化藥物控制釋放中的應(yīng)用研究微膠囊膜能最大程度地保持囊內(nèi)生化物質(zhì)（生長(zhǎng)激素、胰島素、肝素、干擾素、促甲狀腺素、人類免疫缺損疫苗）活性,不同程度地提高了藥物的生物利用度。通