臨床免疫學檢驗-第7章熒光技術(shù)

第七章熒光免疫技術(shù)

第一節(jié)概述

熒光（fluorescence）

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。

一、熒光的基本知識發(fā)射光譜和激發(fā)光譜

發(fā)射光譜是指固定激發(fā)波長，在不同波長下記錄的樣品發(fā)射熒光的強度。（激發(fā)時所用光譜）激發(fā)光譜是指固定檢測發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品記錄的相應(yīng)的熒光發(fā)射強度。（激發(fā)后所得光譜）

熒光的基本知識熒光效率定義:熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率計算公式:

熒光效率=

熒光的基本知識熒光壽命定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。

熒光的基本知識熒光淬滅

定義:熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。熒光的基本知識熒光偏振

FH－FLP＝──────

FH＋FL熒光的基本知識熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標記FAT、流式細胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍色）雙標記或多標記FATEu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定熒光物質(zhì)是一類能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。

常用的熒光物質(zhì)二、熒光物質(zhì)

第二節(jié)

熒光抗體技術(shù)

熒光抗體技術(shù)的基本原理

熒光素標記抗體與切片中組織細胞抗原反應(yīng)，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其部位，對組織細胞抗原進行定性和定位檢測，或?qū)ψ陨砜贵w進行定性和滴度測定。熒光抗體技術(shù)的內(nèi)容

熒光抗體制備標本制作熒光抗體染色熒光顯微鏡檢查抗體要求

高特異性高親和力經(jīng)純化提取IgG

一、熒光抗體的制備有能與蛋白質(zhì)形成共價健的化學基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。標記方法簡單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。熒光素要求熒光抗體的制備抗體的熒光素標記標記原理:利用抗體蛋白的自由氨基與FITC的異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。標記方法:

攪拌法：適于標記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標記時間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。

透析法：適于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體。標記比較勻，非特異染色較低。熒光抗體的制備去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動物肝粉吸收或固相抗原吸收熒光抗體的純化熒光抗體的制備熒光素與蛋白結(jié)合率：

F/P=抗體效價：雙向免疫擴散試驗抗體特異性：吸收試驗、抑制試驗抗體抗體特異性染色滴度：倍比稀釋熒光抗體的鑒定熒光抗體的制備-20℃：保存1～2年真空干燥：長期保存熒光抗體的保存熒光抗體的制備組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織

涂片：各種體液、穿刺液、細菌培養(yǎng)物和細胞懸液培養(yǎng)細胞：單層培養(yǎng)細胞標本的類型二、標本的制作冷凍切片：操作簡單，抗原損失少，組織細胞結(jié)構(gòu)欠清晰。

石蠟切片：組織細胞結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)清楚，抗原損失多。組織切片的類型標本的制作固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃標本的固定和保存標本的制作直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。三、熒光抗體染色及結(jié)果判斷間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖熒光抗體染色及結(jié)果判斷雙標記法

兩種熒光素分別標記的兩種不同的特異性抗體，與同一標本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。熒光抗體染色及結(jié)果判斷

設(shè)立實驗對照:陽性對照和陰性對照

區(qū)分特異和非特異染色

陽性細胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷

“-”：無或僅見極微弱熒光。

“+”：熒光較弱但清楚可見。

“++”：熒光明亮。

“+++”：耀眼強熒光。特異熒光強度“+”以上判定為陽性，對照光應(yīng)呈“-”或“±”。根據(jù)呈"+"的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。

熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷熒光顯微鏡

利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素燈濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭

熒光顯微鏡熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)

第三節(jié)

熒光免疫分析的類型

熒光免疫分析的基本原理

將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復合物中特異性熒光強度，對液體標本中微量或超微量物質(zhì)進行定量測定。熒光抗體技術(shù)熒光免疫測定均相熒光免疫測定（F/B不分離）（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相熒光免疫測定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測。熒光免疫技術(shù)的類型熒光免疫測定的方法類型

非均相熒光免疫測定：

時間分辨熒光免疫測定、熒光酶免疫測定均相熒光免疫測定：

熒光偏振免疫測定自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光基本原理時間分辨檢測原理示意圖時間分辨一、時間分辨熒光免疫測定發(fā)射光譜帶較窄：613nm±10nm，干擾少激發(fā)光譜帶較寬：300nm～350nm，靈敏度高基本原理發(fā)射光譜和激發(fā)光譜時間分辨熒光免疫測定

鑭系元素銪(Eu3+)（最常用）釤(Sm3+)鋱(Tb3+)釹(Nd3+)鏑(Dy3+)標記物熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000細胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA1000羅丹明B3.0常見熒光物質(zhì)的熒光壽命時間分辨熒光免疫測定方法類型

雙抗體夾心法固相抗體競爭法固相抗原競爭法時間分辨熒光免疫測定方法類型時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖雙抗體夾心法固相抗體和Eu3+標記抗體與待檢抗原結(jié)合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標記抗體復合物，酸性增強液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。時間分辨熒光免疫測定方法類型固相抗體競爭法待檢抗原和Eu3+標記抗原與固相抗體競爭結(jié)合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。時間分辨熒光免疫測定方法類型固相抗原競爭法待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的Eu3+標記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。時間分辨熒光免疫測定靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個數(shù)量級標記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化易受污染，本底增高方法評價時間分辨熒光免疫測定光線通過偏振濾光片后，形成一個方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(綠光,525nm～550nm)偏振光(藍光,485nm)熒光物質(zhì)基本原理二、熒光偏振免疫測定

抗原抗體競爭反應(yīng)AgF分子小，轉(zhuǎn)動速度快，偏振熒光弱AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動速度慢，偏振熒光強若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強度成反比熒光偏振免疫測定原理示意圖基本原理熒光偏振免疫測定方法評價

樣品用量少熒光素標記試劑穩(wěn)定，使用壽命長重復性好快速，易自動化適于小、中等分子物質(zhì)檢測靈敏度較非均相熒光免疫測定法低熒光偏振免疫測定基本原理熒光酶免疫測定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖

堿性磷酸酶標記抗體或抗原，固相載體包被抗原或抗體，酶分解4-MUP，脫磷酸根基團形成4-MU，360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm熒光。三、熒光酶免疫測定酶和熒光底物熒光酶免疫測定標記用酶及熒光底物

標記酶底物熒光產(chǎn)物激發(fā)光(nm)熒光(nm)相應(yīng)信號堿性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根過氧化物酶HPA二聚體3174140.03熒光酶免疫測定方法類型

雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法熒光酶免疫測定方法類型雙抗體夾心法固相抗體和酶標記抗體與待檢原反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，加入底物進行酶促發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光量與待檢抗原含量成正比。熒光酶免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖熒光酶免疫測定方法類型雙抗原夾心法固相抗原和酶標抗原與待檢抗體反應(yīng)，形成固相抗原-待檢抗體-酶標抗原復合物，加入底物進行酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。

熒光酶免疫測定方法類型固相抗原競爭法待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的酶標抗體，洗滌除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標抗體形成的復合物被留下來，加入底物進行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強度與待檢抗原含量成反比。熒光酶免疫測定方法評價

用酶和熒光底物的化學反應(yīng)作為放大系統(tǒng)，提高靈敏度背景熒光干擾測定，用固相熒光酶免疫測定效果好熒光酶免疫測定

第四節(jié)

熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應(yīng)用

①自身抗體檢測抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用②病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細胞內(nèi)弓形蟲）細菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用③免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用④細胞表面抗原和受體檢測將游離細胞作熒光抗體特