分子生物學(xué)-8疾病與人類健康

疾病與人類健康

譚永林腫瘤與癌癥人免疫缺損病毒——HIV乙型肝炎病毒——HBV基因治療現(xiàn)代科學(xué)認為，疾病的發(fā)生直接或間接與基因有關(guān)人類疾病都是：“基因病”經(jīng)典單基因病多基因病獲得性基因病經(jīng)典單基因病：主要病因是某個基因位點上產(chǎn)生了缺陷等位基因，如：地中海貧血、白化病多基因?。荷婕岸鄠€基因及調(diào)控這些基因表達的環(huán)境因子之間的相互作用，如：高血壓、糖尿病獲得性基因?。褐饕怯刹≡次⑸锔腥疽鸬膫魅静。绺窝?、艾滋病反轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因原癌基因（細胞轉(zhuǎn)化基因）原癌基因的表達調(diào)控點突變LTR插入基因重排缺失基因擴增基因互作與癌基因表達染色體結(jié)構(gòu)原癌基因終產(chǎn)物抑癌基因產(chǎn)物外源信號第一節(jié)腫瘤與癌癥反轉(zhuǎn)錄病毒

放射線，烷化劑，亞硝酸

原癌基因

DNA水平調(diào)控

染色體結(jié)構(gòu)，蛋白水平調(diào)控

（一）化學(xué)致癌物

按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為：①亞硝胺類；②多環(huán)芳香烴類；③芳香胺類；④烷化劑類；⑤氨基偶氮類；⑥堿基類似物；⑦氯乙烯；⑧某些金屬，（二）生物性致癌因素

生物性致癌因素包括：

病毒、細菌、霉菌等（三）物理因素

1、電離輻射電離輻射可以引起染色體、DNA的突變，或激活潛伏的致癌病毒,引起人體各部位發(fā)生腫瘤，但據(jù)估計在所有腫瘤的總病例數(shù)中只占2%～3%左右。居里夫人的去世，日本原子彈爆炸后引起白血病的發(fā)病率增高，都是著名的例子。2、紫外線診斷腫瘤的診斷以病史和身體檢查為最基本、最重要的診斷手段。身體檢查包括X射線檢查、超聲檢查、內(nèi)窺鏡檢查、組織學(xué)活檢、血液檢查等腫瘤標志物（tumormarker）是指由腫瘤組織產(chǎn)生的反映腫瘤自身存在的化學(xué)物質(zhì)。可用于腫瘤的診斷、預(yù)后和療效觀察。腫瘤標志物腫瘤標志物（tumormarker）主要有以下幾類：①癌胚蛋白（oncofetalproteins），如甲胎蛋白、癌胚抗原；②腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associatedantigens），如CA19-9、CA125；③酶（enzyme），如乳酸脫氫酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、前列腺酸性磷酸酶；④特殊血漿蛋白（specialserumproteins），如β2-巨球蛋白、本周蛋白；⑤激素（hormone），如降鈣素、絨毛膜促性腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素；此外，原癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物也被越來越廣泛地用作腫瘤標志物。癌基因（oncogene）的分類（重要的事情說的第二遍）病毒癌基因：(viral-oncogene,v-onc)DNA病毒、RNA病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒）細胞轉(zhuǎn)化基因：(cellular-oncogene,c-onc)

癌（cancer）又稱惡性腫瘤，一群不受生長調(diào)控而繁殖的細胞(一)反轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因(revirusoncogene)（P294）Rous于1910-1911年首先發(fā)現(xiàn)雞肉瘤病毒（后稱勞斯肉瘤病毒RSV），研究證明它是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，在接種給雞后誘發(fā)肉瘤1966年，85歲的勞斯獲得諾貝爾獎。1、反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒結(jié)構(gòu)

調(diào)節(jié)和啟動轉(zhuǎn)錄

LTR

gag

pol

env

src

LTR

長末端重復(fù)序列癌基因正常的病毒基因產(chǎn)生病毒表面糖蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶

產(chǎn)生病毒

跨膜蛋白2、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)產(chǎn)生p60src蛋白質(zhì)，磷酸化蛋白。靶蛋白磷酸化（P295）Group-specificantigenenvelope3、反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制LTRLTRGAGPOLENVLTRLTRGAGPOLENVONC4、反轉(zhuǎn)錄病毒癌基因（v-onc)的起源

(二)細胞轉(zhuǎn)化基因/細胞癌基因

細胞轉(zhuǎn)化基因?qū)嵸|(zhì)上就是由一類原癌基因突變而來。當原癌基因在某些外界因素（如放射線、化學(xué)致癌物等）的作用下，發(fā)生基因突變，形成了致癌性的細胞轉(zhuǎn)化基因，從而使正常細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞。

原癌基因是細胞內(nèi)與細胞增殖相關(guān)的正常基因。

原癌基因（pro-oncogene）原癌基因的特點:廣泛存在于生物界中；基因序列高度保守；正常情況下表達水平很低;

原癌基因的分類：根據(jù)原癌基因產(chǎn)物在細胞中的位置，可分為：●與膜結(jié)合的蛋白，如src基因產(chǎn)物；膜蛋白●可溶性蛋白，如mos基因產(chǎn)物；質(zhì)蛋白●核蛋白，如myc基因產(chǎn)物。根據(jù)原癌基因表達產(chǎn)物的功能，可分為：●蛋白激酶類，如Src家族（酪氨酸蛋白激酶類）●生長因子類●生長因子受體類●GTP結(jié)合蛋白類，如Ras家族●核蛋白類（DNA結(jié)合蛋白），如Myc家族●未知功能類原癌基因：單拷貝、正常情況下低水平表達或根本不表達癌基因？病毒插入其他物理化學(xué)因素（三）原癌基因表達調(diào)控堿基缺失或單堿基突變基因擴增染色體重排蛋白質(zhì)活性大大提高蛋白質(zhì)未變化，但總量大大提高增強子功能使癌基因高效表達與強啟動子基因相融合，提高癌基因表達效率

原癌基因原癌基因的激活機制（1）點突變（2）LTR（longterminalrepeat)插入強啟動子強增強子（3）基因重排（rearrange)（4）缺失（Deletion）oncogene(-)cancer一些原癌基因5’上游存在負調(diào)控序列，該序列的缺失或突變，則喪失抑制癌基因表達的能力。Brukitt淋巴瘤中c-myc因負調(diào)控序列缺失或LTR插入而增強表達。（5）基因擴增

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)未變化，但總量大大提高基因擴增

原癌基因使每個細胞中基因拷貝數(shù)增加，從而直接增加可用的轉(zhuǎn)錄模板數(shù)以增加基因表達。（四）基因互作(Interactionofgene)與癌基因表達1.染色體構(gòu)象對原癌基因表達的影響基因表達不僅取決于基因本身及其相鄰區(qū)域的一級結(jié)構(gòu)，也取決于其空間構(gòu)象，即基因在染色體上的空間排列和染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。當兩個基因相距太近時，往往不易形成有利于高效轉(zhuǎn)錄的空間結(jié)構(gòu)?；蝾I(lǐng)域(geneterritory)：基因與基因之間的間隔距離基因領(lǐng)域效應(yīng)：同一DNA鏈上兩個具有相同轉(zhuǎn)錄方向的基因間隔小于一定長度時，影響有效轉(zhuǎn)錄所必需的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，從而使這兩個基因中的一個或兩個均不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。0.3kb-5kb，最佳間隔距離與兩個基因的總長度成正相關(guān)。正常人c-myc定位于第8號染色體兩側(cè)存在強表達的基因c-myc處于兩面受夾擊的地位。在Burkitt淋巴瘤中，由于發(fā)生基因重排使c-myc基因一側(cè)的強表達基因消失，從而消除了對c-myc的基因領(lǐng)域效應(yīng)，使后者的轉(zhuǎn)錄活性增強。小鼠細胞中，c-myc的5’上游區(qū)域也存在一個強表達基因，全長15kb，距c-myc只有3kb。這一間隔距離太短，c-myc表達受抑制。在小鼠乳腺癌細胞中，上述間隔距離被顯著拉長，激活c-myc轉(zhuǎn)錄。2.原癌基因終產(chǎn)物對基因表達的調(diào)控某種原癌基因產(chǎn)物對另一種原癌基因表達的調(diào)控作用；某種原癌基因產(chǎn)物對自身表達的反饋調(diào)控作用癌基因產(chǎn)物通過介質(zhì)傳遞生長刺激信號的部位有3處：①癌基因產(chǎn)物本身模擬了生長因子，因而與相應(yīng)的受體作用，以自分泌的方式刺激細胞生長；②癌基因產(chǎn)物模擬了已結(jié)合配體的生長因子受體，從而在無外源生長因子時提供了促進細胞分裂的信號；③癌基因產(chǎn)物作用于細胞內(nèi)生長控制途徑，解除此途徑對外源刺激信號的需求。人血小板衍生生長因子（PDGF）猴肉瘤病毒（SSV）的V-ras癌基因產(chǎn)物，上皮生長因子（EGF）Src及V-erb癌基因產(chǎn)物之間都存在著極高的相似性，表明生長因子與癌基因轉(zhuǎn)化有關(guān)。抑癌基因(tumorsuppressorgene)

隱性癌基因：是一種抑制細胞生長和腫瘤形成的基因。如：Rb抑癌基因、抑癌基因p53

3.抑癌基因產(chǎn)物對原癌基因的調(diào)控抑癌基因與原癌基因在生物學(xué)上有以下幾點差異：①在功能上，抑癌基因起負調(diào)控作用，原癌基因起正調(diào)控作用；②在突變發(fā)生的細胞類型上，抑癌基因突變在體細胞中，生殖細胞中并通過生殖細胞得到遺傳。原癌基因突變只發(fā)生在體細胞中;③在遺傳方式上，原癌基因是顯性的，抑癌基因在細胞水平上是隱性的。4.外源信號對原癌基因表達的影響。細胞外信號：生長因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物等。作用于靶細胞后，通過細胞膜受體系統(tǒng)或其它直接途徑被傳遞至細胞內(nèi)，再通過多種蛋白激酶的活化，對轉(zhuǎn)錄因子進行修飾，然后激活一系列基因轉(zhuǎn)錄。這些對細胞外信號反應(yīng)迅速的基因被稱為快速反應(yīng)基因。不受蛋白質(zhì)合成抑制劑的阻斷；激活維持的時間較短。圖8-11許多原癌基因參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程幾個關(guān)于癌癥的假說單克隆假說（monoclonality）兩次沖擊假說(two-hit)多階段假說(multi-stage)癌癥的多階段發(fā)生學(xué)說1.啟動階段2.促進階段3.發(fā)生階段第二節(jié)人免疫缺損病毒——HIVHIV病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)HIV基因組結(jié)構(gòu)HIV的復(fù)制HIV表達調(diào)控、致病機理、治療預(yù)防人類免疫缺損病毒（HIV）,俗稱艾滋病(AIDS)病毒1983年，法國巴斯德研究所和美國國立衛(wèi)生研究院癌癥研究所首次證實HIV是艾滋病的病因。HIV-Ⅰ歐洲和美洲致病力強。HIV-Ⅱ非洲

致病力弱。依靠血液、血液制品、以及人體分泌液進行傳播。P24CapsidproteinP18Matrixprotein一、HIV病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)HIV結(jié)構(gòu)(立體)

二、HIV基因組及其編碼的蛋白編碼病毒的核心蛋白編碼反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶編碼外膜蛋白TATandREVareessentialforHIVreplication

GAGgene-p55p17:innersurfacep24:capsidp9&p7:nucleocapsidassociatedwithRNA1.Polymerase(reversetranscriptase)2.Integrase3.Protease(cutspolyproteins)

POLgeneTwoglycoproteins:gp160gp120andgp41gp41spansthemembranegp120gp41ENVGenecoding3.HIV膜蛋白主要功能區(qū)（1）主要抗原決定簇：包括V3區(qū)（第301-324位的環(huán)狀肽段）的主抗原決定簇及若干個較弱的決定簇，其中有兩個分別位于Gp41的616-632位和724-751位。（2）T細胞決定簇：兩個輔助性T細胞決定簇T2和T1分別在105-117位的C1區(qū)和421-436位的C4區(qū)，一個主要細胞毒T細胞決定簇位于第308-322位。另有3個較弱的細胞毒T細胞決定簇在Gp41上。（3）CD4受體結(jié)合區(qū)：該區(qū)位于423-427位（C4區(qū)）。在上述功能區(qū)以外的某些氨基酸突變也能影響gp120的功能，說明上述各功能區(qū)發(fā)揮作用還依賴于整個分子特定的空間構(gòu)象。三、HIV的復(fù)制

整合

組裝釋放

宿主裂解HIV感染后三種不同后果高復(fù)制和表達量的時候，可以直接殺死細胞低水平復(fù)制和表達的時候，細胞功能失常不復(fù)制不表達時，與宿主長期共存TheLifeCycleofHIV1.Virusdestroysthecellasaresultofbudding四HIV-I基因的表達調(diào)控HIV最大的特點就是含有大量的調(diào)控基因。LTR序列調(diào)控元件6核心單位2反式激活因子應(yīng)答元件5

參與HIV復(fù)制的調(diào)控蛋白Tat正調(diào)控因子，增加所有基因表達Rev調(diào)控因子，增加gag,env表達Vif侵染因子Nef負調(diào)控因子（1）Tat蛋白的結(jié)構(gòu)由tat基因編碼，tat有兩個外顯子，前外顯子編碼67aa,后外顯子編碼34aa，共101aa。兩個外顯子所形成的肽共有6個結(jié)構(gòu)區(qū)。前外顯子有5個區(qū)，后外顯子為一個區(qū)。1.Tat蛋白（2）調(diào)控原理Tat與TAR是一個協(xié)同調(diào)控過程?！鑄AR序列及完整的高級結(jié)構(gòu)對調(diào)控的影響。若TAR序列發(fā)生突變，雖tat蛋白也能結(jié)合，但不能激活HIV表達?！杓闹饕蜃訁f(xié)同作用的影響

在不同的細胞中，tat的活性可有上千倍的差別，在人鼠雜交細胞中，只有在保持人第12號染色體的雜交瘤細胞中，tat才能有效地激活HIV-1的轉(zhuǎn)錄。說明其調(diào)控還需寄主細胞編碼蛋白的協(xié)助作用。

¤上游啟動子和增強子對調(diào)控的影響

當TAR遠離啟動子時，它的活性迅速下降。而且這種依賴作用對非激活和激活細胞并不一樣，SP1對激活細胞作用非常大，而NF-κB的作用恰與上述依賴作用相反。

Rev蛋白由兩個外顯子組成，分別編碼一個25個氨基酸和91個氨基酸的肽段，這兩個肽段最終組成一個116個氨基酸。其主要功能是促進HIV基因表達由早期（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白mRNA）向晚期（轉(zhuǎn)錄HIV結(jié)構(gòu)蛋白mRNA）的轉(zhuǎn)化，并促進晚期轉(zhuǎn)錄的進行。2.Rev蛋白3.Nef蛋白一般認為，Nef是一個負調(diào)控因子。五、HIV的感染和致病機理HIV除在細胞內(nèi)大量繁殖造成細胞死亡外，還可通過以下幾種途徑導(dǎo)致免疫功能下降：①gp120蛋白脫落與正常細胞CD4結(jié)合，使該細胞被誤認為病毒感染細胞而遭殺滅；②因T細胞CD4受體被gp120封閉，影響了其免疫輔助功能；③gp120蛋白可刺激機體產(chǎn)生抗CD4結(jié)合部位的特異性抗體，阻斷T細胞功能；④帶有病毒包膜蛋白的細胞可與其他細胞融合形成多核巨細胞而喪失功能。六、艾滋病的治療與預(yù)防核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑非核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑蛋白酶抑制劑圖8-21核苷酸型和非核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的作用機制分析。a.核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。由于它在結(jié)構(gòu)上與脫氧核苷酸的相似性，摻入后使病毒DNA的合成不能進行。b.非核苷酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。與反轉(zhuǎn)錄酶相結(jié)合，通過限制該酶的移動性而影響它的活性。第四節(jié)基因治療人類疾病的發(fā)生，其實都是人體細胞中自身基因的改變或由外源病原體的基因產(chǎn)物與人體基因相互作用的結(jié)果。8.4.1基因治療的歷史沿革1990年，科學(xué)家第一次用反轉(zhuǎn)錄病毒為載體把腺苷脫氨酶基因（ADA）導(dǎo)入來自病人自身的T淋巴細胞，經(jīng)擴增后輸回患者體內(nèi)，獲得了成功。5年后，患者體內(nèi)10%的造血細胞呈ADA基因陽性?；蛑委煹膬纱笸緩絜xvivo與invivo方式。exvivo途徑將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體（異種）被“基因工程化的”細胞，經(jīng)體外細胞擴增后輸回人體。這種方法易于操作，而且因為細胞擴增過程中對外源添加物質(zhì)的大量稀釋，不容易產(chǎn)生副作用。同時，治療中用的是人體細胞，尤其是自體細胞，安全性好。invivo途徑將外源基因裝配于特定的真核細胞表達載體上，直接導(dǎo)入人體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸DNA，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。這種方式導(dǎo)入的治療基因以及其載體必須證明其安全性，而且導(dǎo)入體內(nèi)之后必須能進入靶細胞，有效地表達并達到治療目的。體內(nèi)法基因治療：直接注射含治療基因的載體于患者；體外法基因治療：需要從患者體內(nèi)取出細胞，并以治療基因修飾，回輸表達治療基國的修飾細胞于患者；8.4.2基因治療中的病毒載體用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：攜帶外源基因并能裝配成病毒顆粒；介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達；對機體沒有致病力。1、病毒載體的產(chǎn)生將適當長度的外源DNA插入病毒基因組的非必需區(qū)，包裝成重組病毒顆粒。將4.5kb的lacZ基因表達盒插入HSV-1病毒的UL44（編碼糖蛋白C）基因的XbaI位點中，構(gòu)建成重組HSV病毒。由于UL44基因產(chǎn)物對于HSV病毒在培養(yǎng)細胞中產(chǎn)毒性感染是非必需的，該重組病毒可以在細胞中增殖傳代。2個缺點2、重組型病毒載體在不改變病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件的情況下，有選擇性地刪除病毒的某些必需基因尤其是前早期或早期基因以控制其表達，所缺失的必需基因的功能由同時導(dǎo)入細胞中的外源基因表達單位提供。一般通過同源重組方法將目的基因插入到病毒基因組中。3、無病毒基因的病毒載體在輔助系統(tǒng)的作用下，重組載體以特定形式（單鏈或雙鏈DNA或RNA）被包裝到不含有任何病毒基因的病毒顆粒中。這類載體的優(yōu)點在于載體病毒本身安全性好，容量大。缺點在于往往需要輔助病毒參與載體DNA的包裝，造成終產(chǎn)品中輔助病毒污染。4、基因治療中的問題基因?qū)胂到y(tǒng)基因表達的可控性需要更多的治療基因1）基因?qū)胂到y(tǒng)?；蛑委熤械年P(guān)鍵問題是必須將治療基因送入特定的靶細胞，并在該細胞中得到高效表達。這對于惡性腫瘤治療尤為重要，如果不能有效地將治療基因?qū)氪蠖鄶?shù)腫瘤細胞，則至少要求它盡可能不進入或較少進入正常細胞。2）外源基因表達的可控性。最理想的可控性是模擬人體內(nèi)基因本身的調(diào)控形式，需要全基因或包括上下游的調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子序列，將對導(dǎo)入基因的載體系統(tǒng)產(chǎn)生嚴峻的挑戰(zhàn)，因為今后設(shè)計的載體須有幾十kb甚至上百kb的包裝能力。圖8-26導(dǎo)入基因的表達誘導(dǎo)框架圖3）治療基因過少。目前用于臨床試驗的治療基因數(shù)量很少。絕大部分多基因疾病，如惡性腫瘤、高血壓、糖尿病、冠心病、神經(jīng)退行性疾病的致病基因還有待闡明，因此，可選擇的靶基因不多8.4.3.非病毒載體裸DNA脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物（lipolex）多聚物/DNA復(fù)合物（polylex）§8.2裸DNA

裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝的質(zhì)粒載體，是結(jié)構(gòu)最簡單的非病毒載體。由于在體內(nèi)易被降解破壞（缺乏保護性外包裝）又無靶向性（缺乏可被靶細胞識別的成分），故多采用直接注射或基因槍等物理方法直接導(dǎo)入靶組織或靶器官,如皮膚、骨骼肌、心肌或腫瘤等。利用本法將編碼抗原的基因?qū)肫は拢杉ぐl(fā)機體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，被稱為DNA疫苗（DNAvaccine），是一種較有前途的免疫方法。顯微注射法（microinjection）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細胞或細胞核

微粒子轟擊法

利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進入靶細胞，達到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細胞中表達?！?.3脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物

脂質(zhì)體(liposome)是用人工方法將磷脂和相似的兩性脂質(zhì)在水溶液中形成一種脂質(zhì)雙層包圍水溶液的微球。常用脂質(zhì)：膽固醇(能減少通透性并增加磷脂雙層的穩(wěn)定性)，二油酰磷脂酰乙醇酯（DOPE）和二油酰磷脂