半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)

目錄抗原與半抗原偶聯(lián)蛋白人工抗原合成的方法影響人工抗原質(zhì)量的因素人工抗原的質(zhì)量評定第一頁，共五十頁?？乖c半抗原第二頁，共五十頁。抗原抗原

——能與淋巴細(xì)胞抗原受體（TCR/BCR）特異性結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（指抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)、外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。第三頁，共五十頁。抗原的分類天然抗原如：細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等。人工抗原如：人工結(jié)合抗原、人工合成抗原、基因工程抗原第四頁，共五十頁。常見的天然抗原-細(xì)菌鏈球菌痢疾桿菌霍亂弧菌傷寒桿菌第五頁，共五十頁。常見的天然抗原-病毒狂犬病病毒腺病毒口蹄疫病毒流感病毒第六頁，共五十頁。常見的其他天然抗原真菌白色念珠菌

(1,000Xoil)

瘧原蟲第七頁，共五十頁。常見的其他天然抗原

異種動物血清異嗜性抗原血型抗原主要組織相容性抗原腫瘤抗原超抗原第八頁，共五十頁。人工抗原

人工結(jié)合抗原

——將無免疫原性的簡單化學(xué)基團(tuán)與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，或?qū)o免疫原性的有機(jī)分子與蛋白質(zhì)載體結(jié)合，形成載體-半抗原結(jié)合物，均屬人工結(jié)合抗原。

第九頁，共五十頁。人工抗原

人工合成抗原

——用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽。（應(yīng)用這種人工合成多肽可研究氨基酸種類、序列與蛋白質(zhì)抗原性及免疫原性的關(guān)系。）

第十頁，共五十頁。人工抗原基因工程抗原——通過基因重組、再表達(dá)制備的抗原物質(zhì)。如：目的基因（編碼抗原）+載體（質(zhì)粒等）

重組DNA

細(xì)胞（真核或原核）

表達(dá)

純化

基因工程疫苗第十一頁，共五十頁。抗原的性質(zhì)1.免疫原性：抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，誘生相應(yīng)抗體和效應(yīng)淋巴細(xì)胞的能力。2.抗原性:

抗原可在體內(nèi)、外與相應(yīng)的抗體/效應(yīng)淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。第十二頁，共五十頁?？乖ò凑彰庖咴约懊庖叻磻?yīng)性）分類1、完全抗原:既有免疫原性又有抗原性的物質(zhì)，如多數(shù)蛋白質(zhì)分子。2、半抗原:又稱不完全抗原，單獨存在時只具有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)，如二硝基酚、青霉素。第十三頁，共五十頁。完全抗原半抗原與載體結(jié)合后可使其具有免疫原性。半抗原+載體完全抗原第十四頁，共五十頁。半抗原

+載體抗體BT完全抗原BBBT第十五頁，共五十頁。常見的偶聯(lián)蛋白第十六頁，共五十頁。常見的偶聯(lián)蛋白常用來作為合成人工抗原的載體蛋白質(zhì)有：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)

人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等。

第十七頁，共五十頁。常見的偶聯(lián)蛋白牛血清白蛋白（BSA）包含583個氨基酸殘基，分子量為66.43kDa，等電點為4.7。

BSA結(jié)構(gòu)第十八頁，共五十頁。常見的偶聯(lián)蛋白卵清蛋ovalbvmin

是一種糖蛋白。含有微量的磷。是卵清中蛋白質(zhì)的主要成分，約占65％。雞的卵清蛋白分子量約45kDa。a.牛血清白蛋白b.磷酸酪氨酸血清白蛋白c.卵清蛋白d.磷酸酪氨酸卵清蛋白第十九頁，共五十頁。常見的偶聯(lián)蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)由于KLH質(zhì)量大，復(fù)雜性高，與其他載體蛋白相比KLH會引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。來源于軟體動物，它在系統(tǒng)發(fā)生上遠(yuǎn)離哺乳動物物種，在測定過程中產(chǎn)生會與典型靶點樣品發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的可能性較小。第二十頁，共五十頁。常見的偶聯(lián)蛋白

人血清白蛋白（簡稱HSA），是人血漿中的蛋白質(zhì)，其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸，分子量為66kD。在血漿中其濃度為42g/L，約占血漿總蛋白的60%。第二十一頁，共五十頁。常見的偶聯(lián)蛋白ε-多聚賴氨酸是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能的微生物類食品防腐劑。它是由25～30賴氨酸殘基聚合而成，具有強(qiáng)烈的抑菌能力，可以作為防腐劑用于食品的保鮮。

第二十二頁，共五十頁。偶聯(lián)蛋白的性質(zhì)

載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有化學(xué)活性基團(tuán)，這些基團(tuán)可以直接與抗生素或農(nóng)藥分子偶聯(lián)，這是化學(xué)偶聯(lián)制備抗原的前提；其次，載體應(yīng)具備一定的容量，可以偶聯(lián)足夠的分子；載體還應(yīng)該是惰性的，不應(yīng)干擾偶聯(lián)分子的功能；而且載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性，且應(yīng)該是廉價易得的。第二十三頁，共五十頁。人工抗原合成方法第二十四頁，共五十頁。人工抗原合成方法

小分子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)效果會受到偶聯(lián)物的濃度及其相對比例、偶聯(lián)劑的有效濃度及其相對量、緩沖液成分及其純度和離子強(qiáng)度、pH以及半抗原的穩(wěn)定性、可溶性和理化特性等因素的影響。一般是由半抗原上的活性基團(tuán)決定偶聯(lián)合成的方法。第二十五頁，共五十頁。半抗原上的活性基團(tuán)第二十六頁，共五十頁。人工抗原合成方法1、分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶聯(lián)A、混合酸酐法。B、碳化二亞胺法。C、N-羥琥珀酰亞胺酯法

第二十七頁，共五十頁?；旌纤狒ń宦?lián)原理第二十八頁，共五十頁?；旌纤狒ń宦?lián)原理第二十九頁，共五十頁。碳化二亞胺法交聯(lián)原理第三十頁，共五十頁。碳化二亞胺法交聯(lián)原理第三十一頁，共五十頁。碳化二亞胺法交聯(lián)原理第三十二頁，共五十頁。人工抗原合成方法2、含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)1）戊二醛法：雙功能試劑戊二醛的兩個醛基分別與半抗原和蛋白質(zhì)上的氨基形成schiff鍵(-N=C<，在半抗原和蛋白質(zhì)間引入一個5碳橋。這一反應(yīng)條件溫和，可在4～40℃及pH6.0～8.0內(nèi)進(jìn)行，操作亦簡便，因此應(yīng)用廣泛。2）重氮化法：用于活性基團(tuán)是芳香胺基的半抗原，芳香胺基與NaNO2和HCl反應(yīng)得到一個重氮鹽，它可直接接到蛋白質(zhì)酪氨酸羧基的鄰位上，形成一個偶氮化合物。第三十三頁，共五十頁。戊二醛法合成人工抗原的原理第三十四頁，共五十頁。鹽酸克倫特羅重氮化反應(yīng)原理第三十五頁，共五十頁。人工抗原合成方法3、含羥基半抗原的偶聯(lián)1）琥珀酸酐法；2）羰基二咪唑法。第三十六頁，共五十頁。人工抗原合成方法4、含巰基半抗原的偶聯(lián)

1)馬來酰亞胺法。

2)將載體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸緩沖液中，通過過氧化氫的作用形成二硫鍵，也可以將半抗原連接到蛋白質(zhì)分子上。

第三十七頁，共五十頁。影響人工抗原質(zhì)量的因素第三十八頁，共五十頁。影響人工抗原質(zhì)量的因素

偶聯(lián)比過去人們認(rèn)為，聯(lián)接到蛋白質(zhì)分子上的半抗原數(shù)目要盡可能多。但實驗證明，過多的半抗原并不能得到預(yù)期的結(jié)果，這是因為載體上覆蓋的半抗原分子過多時，可能不利于載體與淋巴細(xì)胞表面結(jié)合，不能使載體引起免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)各種載體的分子量不論是否接近，最佳結(jié)合比都不盡相同，并建議為了取得最佳免疫效果，應(yīng)逐個確定各種載體的最佳結(jié)合比。第三十九頁，共五十頁。影響人工抗原質(zhì)量的因素偶聯(lián)橋有研究者認(rèn)為，一定長度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所產(chǎn)生抗體專一性的增強(qiáng)．但也有一些研究者發(fā)現(xiàn)，手臂結(jié)構(gòu)對免疫檢測經(jīng)常有不利的影響，有時產(chǎn)生的抗體對手臂結(jié)構(gòu)親和力特別強(qiáng)，對待測小分子親和力卻很弱，因此造成對特異性抗體檢測的干擾?？梢圆扇煞N方法來避免因偶聯(lián)橋而造成的不足：一是半抗原上相同位點結(jié)合蛋白質(zhì)，但免疫原和包被抗原用不同的偶聯(lián)橋；二是免疫原和包被抗原用相同的偶聯(lián)橋，但與不同半抗原位點結(jié)合。最好的偶聯(lián)橋是3～6個直鏈的碳原子結(jié)構(gòu)。第四十頁，共五十頁。影響人工抗原質(zhì)量的因素半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)用來作半抗原的分子最好有分支結(jié)構(gòu)，直鏈分子難以產(chǎn)生抗體。此外，有些抗生素或農(nóng)藥有多個可供蛋白質(zhì)偶聯(lián)的位點，但據(jù)研究報道，不同位點與蛋白質(zhì)結(jié)合制備的人工抗原產(chǎn)生的抗體效價及親合力都有差別，這可能是因為不同位點結(jié)合導(dǎo)致半抗原呈現(xiàn)的空間結(jié)構(gòu)不一樣的原因。因此，如果一個分子內(nèi)有多個不同的結(jié)合位點時，最好盡可能利用不同位點都合成出人工抗原，然后，通過比較，篩選出最好的人工抗原用于制備抗體作為檢測。第四十一頁，共五十頁。半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)第四十二頁，共五十頁。半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)第四十三頁，共五十頁。半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)第四十四頁，共五十頁。人工抗原的質(zhì)量評定第四十五頁，共五十頁。人工抗原的質(zhì)量評定合成成功鑒定鑒定農(nóng)藥人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法，如果人工抗原的紫外吸收圖譜不同于原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜，則可初步證明人工抗原合成成功。

第四十六頁，共五十頁。紫外分光光度法測定人工抗原偶聯(lián)質(zhì)量第四十七頁，共五十頁。人工抗原的質(zhì)量評定濃度測定人工抗原的絕對含量常以蛋白質(zhì)的相對濃度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白質(zhì)多少mg）。因此測定人工抗原的濃度與測定人工抗原溶液中蛋白質(zhì)的相對含量