免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)

免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)第一頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二十二章

免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)第二頁，共六十二頁，2022年，8月28日免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)又稱免疫細胞化學(xué)檢驗技術(shù)---是利用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）與組織細胞內(nèi)抗原（或抗體）進行的抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對組織和細胞抗原進行定性、定位、定量測定的免疫檢測方法。第三頁，共六十二頁，2022年，8月28日免疫組化的檢測原理第四頁，共六十二頁，2022年，8月28日免疫組化的檢測原理第五頁，共六十二頁，2022年，8月28日免疫組化的檢測原理第六頁，共六十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)

免疫組化檢驗技術(shù)基本知識第七頁，共六十二頁，2022年，8月28日免疫組化全過程第八頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、標(biāo)本制作標(biāo)本制作是獲得良好的免疫細胞組織化學(xué)分析的保障，良好的細胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確顯示和定位。

（一）標(biāo)本的主要來源主要有：①活體組織②各種體液及穿刺液③培養(yǎng)細胞等

第九頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）標(biāo)本的固定與保存

1．組織材料的固定目的

①防止組織細胞的死后變化，以保持其固有形態(tài)②使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)③使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，以便染色后易于鑒別和觀察④固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片⑤防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)⑥經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認(rèn)。第十頁，共六十二頁，2022年，8月28日

2．固定劑的選擇最佳固定劑的標(biāo)準(zhǔn)①最好地保持細胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)②最大限度地保存抗原的免疫活性

3．固定方法固定方法常用①浸泡法—主要適用于活檢和手術(shù)標(biāo)本以及其它不能進行灌注的組織固定。②灌注法—適用于動物實驗研究。第十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日第十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日（三）玻片的處理玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟之一一般用免疫組織化學(xué)的載玻片均需涂一定的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹脂膠、多聚賴氨酸和防脫片劑（四）切片方法的選擇第十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日第十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、抗原處理（一）進行抗原的暴露和修復(fù)的原因1.固定液的影響2.抗體制備的影響

（二）抗原的暴露主要采用酶消化的方法在選擇酶消化時，應(yīng)針對要顯示的不同的抗原成分而選用不同的酶

在日常工作中用胰蛋白酶消化即可

第十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日（三）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)抗原修復(fù)是以高溫、高壓對常規(guī)固定石蠟切片進行抗原修復(fù)以提高抗原抗體的陽性檢出率

微波處理法水浴鍋法壓力鍋法第十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日三、抗體處理抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要試劑

（一）抗體的選擇具有高度特異性和穩(wěn)定性的優(yōu)質(zhì)抗體

（二）抗體的稀釋抗原抗體反應(yīng)須有適當(dāng)?shù)谋壤?，過量或不足均不能達到預(yù)期結(jié)果

（三）抗體的合理保存要特別注意保持抗體的生物活性

第十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日四、常用標(biāo)記物（一）熒光素如：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等（二）酶如：辣根過氧化物酶(HRP)

（三）生物素-親和素系統(tǒng)（四）免疫金標(biāo)記技術(shù)（五）免疫鐵蛋白技術(shù)第十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷（一）對照染色設(shè)計為了保證免疫組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除某些非特異性染色，通常需針對第一抗體設(shè)立對照。1.陽性對照用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進行免疫組織化學(xué)染色。目的是證實所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。

2.陰性對照用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對照。目的是排除假陽性。第十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日3.陰性試劑對照是指用于證實在免疫組化染色中所用試劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性）而設(shè)立的同步免疫染色對照，包括有：空白對照、替代對照、吸收試驗和抑制試驗等。4.自身對照是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對照。

第二十頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）陽性結(jié)果陽性細胞的顯色可位于細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核免疫顯色強度和陽性細胞密度是定性、定量指標(biāo)陽性細胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、胞質(zhì)(漿)型等）及組織分布特點（如局灶型、彌漫型、片塊型等）主要是定位指標(biāo)哪怕只有少數(shù)細胞陽性（只要是抗原所在部位）也應(yīng)視為陽性表達第二十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日（三）陰性結(jié)果陰性結(jié)果不能簡單視為抗原不表達，由于染色方法靈敏度有高低之分，有時可因靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)。（四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別

1.分布位置

特異性反應(yīng)必須分布于特定抗原部位非特異性反應(yīng)無一定的分布規(guī)律

第二十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日2.顯色強度特異性反應(yīng)由于細胞內(nèi)抗原含量不同，顯色強度不一。陽性細胞的染色常定位于細胞，并與陰性細胞間有明顯間隔而非特異性染色常不限于單個細胞，常為成片的細胞3.其他在過大的組織塊，中心固定不良也會導(dǎo)致非特異性顯色

第二十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日六、質(zhì)量控制質(zhì)量控制是免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)取得滿意結(jié)果的必要條件。（一）試劑質(zhì)量控制抗體的質(zhì)量是免疫組織化學(xué)染色成功的關(guān)鍵

（二）操作過程質(zhì)量控制

實驗操作標(biāo)本的質(zhì)量控制（三）儀器設(shè)備和器具的質(zhì)量控制第二十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)

酶免組織化學(xué)檢驗技術(shù)酶免組織化學(xué)檢驗技術(shù)是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識別出標(biāo)本中抗原（抗體）的分布和性質(zhì)；也可通過圖像分析技術(shù)達到定量的目的。第二十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、標(biāo)本制作常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細胞涂片酶免組織化學(xué)檢驗技術(shù)可分為酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色法非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色法第二十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法（一）原理酶標(biāo)記抗體的免疫組織化學(xué)染色法是借助交聯(lián)劑的共價鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標(biāo)抗體（或抗抗體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，通過酶對底物的催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達到對抗原定性、定位、定量檢測的目的。第二十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）技術(shù)類型

1.直接法形成抗原一抗體一酶復(fù)合物2.間接法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E復(fù)合物3.酶標(biāo)抗體三步染色法為間接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E復(fù)合物（三）方法評價第二十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法（一）原理該技術(shù)首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結(jié)合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3的Fc段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結(jié)合，經(jīng)酶催化底物的顯色反應(yīng)，達到對抗原的檢測。第三十頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）技術(shù)類型1.酶橋法用辣根過氧化物酶（HRP）免疫動物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經(jīng)Ab2（如羊抗兔）作橋，將結(jié)合在組織抗原上的Ab1(兔抗相應(yīng)組織抗原的抗體)與Ab3連接起來，最后將HRP與Ab3結(jié)合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復(fù)合物，加底物顯色第三十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日第三十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日2.PAP法即過氧化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良，技術(shù)要點基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過氧化物酶（AP））與酶（過氧化物酶（P））制成了可溶性復(fù)合物（PAP）,該復(fù)合物由2個抗酶抗體和3個過氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。通過橋抗體（Ab2）將特異性識別組織抗原的抗體（Ab1）與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來第三十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日第三十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日第三十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日3.雙橋PAP法該法是PAP法的改良，通過兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAP法更多的酶分子，大大增強了方法的敏感性。4.APAAP法APAAP法就是以堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶（AP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡稱APAAP法。技術(shù)要點與PAP法相似。第三十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日（三）方法評價該技術(shù)既可檢測抗原，又可檢測抗體。由于酶不是標(biāo)記在抗體上，而是經(jīng)抗原（酶）抗體反應(yīng)與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)抗體的缺點，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAP法，是當(dāng)今免疫組化技術(shù)中敏感性較高的方法。第三十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日四、臨床應(yīng)用酶免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測。組織切片中各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細胞、病毒、腫瘤抗原、漿細胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細胞表面標(biāo)志等均可檢測。第三十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)

熒光免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先用熒光素標(biāo)記已知抗體并以此作為探針，檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后，即會發(fā)出一定波長的熒光，進而對組織中的某種抗原進行定性、定位和定量分析。第三十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、標(biāo)本制作常見的臨床標(biāo)本材料主要有組織、細胞和細菌三大類，按不同標(biāo)本性質(zhì)可制作涂片、印片或組織切片等。（一）載玻片和蓋玻片的處理載玻片和蓋玻片要厚薄均勻、潔凈及透光性好

第四十頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）制片1．組織切片組織材料可制備成冰凍切片或石蠟切片。

2．印片組織材料也可制成印片。3．涂片細胞或細菌要制成涂片，涂片應(yīng)薄且均勻。第四十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日（三）標(biāo)本的固定主要目的是：

1.防止細胞或切片從玻片上脫落

2.去除妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂

3.便于保存。除活細胞外，其他標(biāo)本應(yīng)在染色前以適當(dāng)?shù)姆绞焦潭ā?/p>

（四）標(biāo)本片的保存固定好的標(biāo)本片應(yīng)盡快熒光染色檢查，如需保存，置-20℃下低溫干燥保存。第四十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、熒光抗體標(biāo)記及染色熒光抗體是熒光免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，是將熒光素與特異性抗體通過共價鍵的方式結(jié)合而成。其制備過程通常包括抗體的標(biāo)記、純化和鑒定三步。在已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體，置于帶蓋的濕盒內(nèi)，37℃溫育30min。檢測不耐熱抗原以4℃過夜為宜。溫育后充分洗滌、干燥、鏡檢。第四十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日三、臨床應(yīng)用

1.在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

2.各種病原微生物的快速檢查和鑒定

3.寄生蟲感染的診斷

4.白細胞分化抗原的檢測此外還應(yīng)用于HLA、腫瘤組織中的腫瘤抗原、組織中的免疫球蛋白和補體組分、激素和酶的定位等。第四十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)親和組織化學(xué)檢驗技術(shù)親和組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價或多價結(jié)合力的物質(zhì)如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，對某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質(zhì)、糖類、熒光素和酶等多種類型的大小分子結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)等技術(shù)，在細胞或亞細胞水平進行對應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性或定量分析。用于親和組織化學(xué)的物質(zhì)有生物素與親和素、植物凝集素與糖類、SPA與IgG、鏈霉親和素與生物素等。第四十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、生物素-親和素法生物素可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素也稱抗生物素，每個親和素分子有生物素結(jié)合的4個位點，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。第四十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日常用的技術(shù)類型有：1.標(biāo)記親和素-生物素法（LAB法）將親和素與標(biāo)記物（HRP）結(jié)合，一個親合素可結(jié)合多個HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結(jié)合，一個抗體分子可連接多個生物素分子，抗體的活性不受影響。細胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親和素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大，提高了檢測抗原的敏感性。第四十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日第四十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日2.橋連親和素-生物素法（BAB法）先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達到多層放大效果。第四十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日第五十頁，共六十二頁，2022年，8月28日3.親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）此法是前兩種方法的改進，即先按一定比例將親和素與酶（辣根過氧化物酶）標(biāo)生物素結(jié)合在一起，形成親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物（ABC復(fù)合物），當(dāng)其與檢測反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時，ABC中未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測抗原的靈敏度。

第五十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日第五十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、SPA法SPA具有和人及許多動物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的IgGFc結(jié)合的能力，這種結(jié)合不會影響抗體的活性。每個SPA分子可同時結(jié)合兩個IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。第五十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日第五十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日三、鏈霉親和素—生物素技術(shù)鏈霉親和素與生物素的結(jié)合是已知自然界中最強的非共價相互作用之一，其功能類似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白就組成酶標(biāo)鏈霉親和素-生物素方法（LSAB）。

LSAB法的特點:①特異性強；②分子量小，穿透力強，放大效應(yīng)遠超ABC法，故其敏感性更強；③等電點中性更適合組織，可明顯減少非特異性染色，低背景著色使特異性著色更清晰；④操作時間縮短，更簡便。第五十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日第五十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日四、凝集素法一種凝集素具有專一性結(jié)合某種特異性糖基的能力，同時所有生物膜都含有一定量的糖類，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作為一種探針來研究細胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。第五十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日一般認(rèn)為細胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細胞的類型并反映細胞在分化、成熟和細胞病變中的變化。標(biāo)記了相應(yīng)示蹤物的凝集素可用來：①