克隆基因的表達與產(chǎn)物純化外源基因在原核細胞中的表達

克隆基因的表達與產(chǎn)物純化外源基因在原核細胞中的表達第一頁，共九十四頁，2022年，8月28日一、原核生物基因表達的特點1.只有一種RNA多聚酶識別原核細胞的啟動子，催化所有的RNA合成。2.以操縱子為單位數(shù)個相關的結構基因與其調控區(qū)結合形成一個表達的協(xié)同單位。第二頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.轉錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。第三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四頁，共九十四頁，2022年，8月28日4.不含內(nèi)含子，缺乏轉錄后的加工系統(tǒng)。5.調控主要在轉錄水平上。6.mRNA的核糖體結合位點。Shine-Dalgarno（SD）sequence:含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3’末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（SD）序列。第五頁，共九十四頁，2022年，8月28日二、原核表達系統(tǒng)的注意事項1.外源基因不能帶有內(nèi)含子。2.必須用cDNA3.不能直接用真核基因組DNA。4.必須利用原核細胞的調控原件（啟動子等）5.防止外源基因產(chǎn)物對宿主細胞的毒害。第六頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調控1.啟動子是DNA上的能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。（1）啟動子序列大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensussequence）。-35Box和-10Box第七頁，共九十四頁，2022年，8月28日第八頁，共九十四頁，2022年，8月28日①-35boxRNA聚合酶δ亞基的識別位點。

5’

–TTGACA-3’②-10box（PribnowBox）

5’–TATAAT-3’5’TTGACATATAAT

轉錄起始位點17bp核糖體結合位點第九頁，共九十四頁，2022年，8月28日第十頁，共九十四頁，2022年，8月28日（2）翻譯的起始位點①核糖體結合位點（RBS）ribosomebindingsite1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：第十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日2）起始密碼：位于SD序列下游。AUG(91%)GUG(8%)UUG(1%)第十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.RNA多聚酶大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉錄tRNA，rRNA和mRNA。結構全酶是一個5聚體，含有兩個α小亞基，和2兩個大亞基（β和β′），一個σ亞基。第十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.轉錄終止子在表達載體克隆位點的下游一般設計一段轉錄終止子。啟動子操縱子S-D序列目的基因終止子內(nèi)終止子intrinsicterminator：E.coli中促使轉錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。第十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日原因：①莖環(huán)結構②多聚A/U反向回文順序被轉錄后，立即形成一個莖環(huán)結構，使轉錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA與DNA的互作。由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉錄物脫落而不利于轉錄延續(xù)。第十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日第十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日第十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日4.翻譯終止密碼5.翻譯增強子大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。Translationenhancer能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導序列（簡稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的區(qū)段。第十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日6.基因工程常用的原核啟動子（1）最佳啟動子必須具備的條件①必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的10%-30%以上。②應呈現(xiàn)低水平的基礎轉錄③應是可誘導型的便于表達毒性蛋白等。用溫度或化學試劑誘導。第十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日（2）乳糖啟動子lac來自大腸桿菌的乳糖操縱子。用乳糖或其類似物IPTG充當誘導物，與阻遏蛋白結合，解除抑制。Plac

O

目的基因第二十頁，共九十四頁，2022年，8月28日調控區(qū)CAP結合位點啟動序列操縱序列結構基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙酰基轉移酶ZYAOPDNA第二十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日mRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol沒有乳糖存在時阻遏基因第二十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日mRNA阻遏蛋白有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉錄mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶第二十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日①乳糖操縱子控制區(qū)的結構“可移動的lac啟動子小片斷”組成：阻遏物作用區(qū)CAP作用區(qū)RNA聚合酶作用區(qū)長度：203bp的HaeIII片斷（包括β-半乳糖苷酶的前8個密碼）。第二十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日大腸桿菌乳糖操縱子控制區(qū)的結構第二十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日（3）色氨酸啟動子trp來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。第三十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日（4）PL和PR啟動子第三十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十頁，共九十四頁，2022年，8月28日四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位1.細胞質中表達包涵體（inclusionbody）是存在于細胞質中的一種不溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物。形成原理未知。第四十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日①優(yōu)點②缺點使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞回收的蛋白生物活性差。例：在大腸桿菌細胞內(nèi)表達人生長激素（humangrowthhormone,hGH）。第四十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.周質中表達（1）周質（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結構部分。蛋白質從細胞質轉運到周質的復雜機理目前不完全清楚優(yōu)點：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。第四十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日①常用的原核信號肽（2）信號肽（signalpeptide）能帶領蛋白穿過膜到達周質。但以后需要正確切割掉。一般位于N端。①大腸桿菌的信號肽：phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等第四十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日②金黃色葡萄球菌的蛋白A。③枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）。④胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。②真核信號肽也能在細菌中起作用。鼠源RNase、人生長激素信號肽。第四十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.胞外表達使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。用溶血素（hemolysin）基因構建分泌性融合蛋白；或與細菌素釋放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表達。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。第四十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日五、幾種類型的原核表達載體1.非融合型表達載體載體表達出的外源基因蛋白質不與細菌的任何蛋白質融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG優(yōu)點：產(chǎn)物結構接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質結構。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。第五十頁，共九十四頁，2022年，8月28日pKK223-3載體哈佛大學Gilbert實驗室建立的。表達能力強。組成結構：①強啟動子:tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)②操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。lac操縱基因舉例第五十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日③調節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。如JM105菌。

LacI④終止子：rrnB的強終止子rrnB強終止子⑤S-D序列和插入位點區(qū)：S-D插入位點區(qū)第五十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑥載體的其余部分：來自pBR322質粒。⑦表達誘導物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）宿主lacItacPLacOS-D插入位點區(qū)rrnBT阻遏物IPTG第五十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第五十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.分泌型表達載體載體表達出的外源蛋白質與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質中。如：pINIII系列：pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,第五十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日組成結構①強啟動子：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。②調節(jié)基因：lacI③S-D序列和起始密碼ATG。④分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位點區(qū)（多克隆位點）。IpplacPlacOS-D/ATG

ompa

插入位點第五十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日第五十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)—pGEX系列表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。(1)優(yōu)點(2)組成結構便于融合蛋白的分離和純化。①啟動子：tac②操縱基因：lacP③調節(jié)基因：lacI④S-D序列第五十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉移酶）(3)產(chǎn)物提純GST融合蛋白用GlutathioneSepharose親和層析柱分離純化。lacItaclacPlacOS-D/ATG

GST

插入位點TGA第五十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日(4)產(chǎn)物分離用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。第六十頁，共九十四頁，2022年，8月28日第六十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日第六十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日(5)其他融合蛋白系統(tǒng)His-tag（組氨酸標簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質。第六十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第六十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日六、影響外源基因表達效率的因素1.啟動子的結構對表達效率的影響(1)一致順序第六十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日越接近一致順序，啟動子越強。(3)-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序(2)-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時，啟動子最強。第六十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.轉譯起始序列對表達效率的影響(1)S-D序列5’-AGGAGGU-3’S-D序列后面的4個堿基：如果是A（T）,翻譯效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。第六十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日(2)起始密碼AUGAUG左側的三個堿基也有影響。β-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側如果是UAU或CUU時，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時下降20倍。第六十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日(3)其它多順反子的mRNA與核糖體的結合位點有一個或幾個終止密碼。噬菌體外殼蛋白或核糖體蛋白mRNA的核糖體結合位點有多個U。第六十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.啟動子與外源基因之間的距離第七十頁，共九十四頁，2022年，8月28日4.轉錄終止區(qū)對表達效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響轉錄終止區(qū)的存在保證載體不會轉錄非必須基因，不必浪費源量和能量、不會干擾正常的表達。增加載體的拷貝數(shù)會增加轉錄出的mRNA數(shù)目。增加表達效率。但過度的外源基因的表達會影響宿主的正常生長。第七十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日七、提高表達水平常用的方法1.選擇強啟動子序列，如

tac

等2.調整S-D序列與AUG堿基的距離3.改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為5-9bp。距離過長或過短都影響真核基因的表達。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。能提高翻譯的起始效率。第七十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日5.減輕宿主細胞的代謝負荷4.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入“重復性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’→5’外切酶的攻擊。合理地調節(jié)代謝負荷與外源基因高效表達的關系。（1）誘導表達將宿主生長代謝與外源基因表達分開。一般采用溫度誘導或藥物誘導。第七十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日λPL啟動子是溫度誘導型32℃cI857(cI的溫度敏感突變等位基因)阻遏物有活性，抑制λPL啟動子，外源基因不表達，宿主大量生長。42℃:cI857阻遏物失活，PL啟動子啟動，外源基因高水平表達，宿主生長受到限制。cI857PL

PO

外源基因第七十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日λPL啟動子是藥物誘導型調節(jié)基因lacI（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無IPTG:阻遏物與lac操縱基因結合，抑制外源基因轉錄。宿主大量生長。有IPTG:阻遏物與IPTG結合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉錄。宿主生長受抑制。第七十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日（2）表達載體誘導復制將宿主的生長與載體的復制分開。當需要宿主大量生長時，抑制載體質粒的復制。當宿主大量生長后，再誘導載體質粒的復制，增加拷貝數(shù)。第七十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。（1）設計成融合蛋白這是避免被降解的最好措施。N末