馬傳染性貧血診斷技術(shù) 編制說明

PAGEPAGE21《馬傳染性貧血診斷技術(shù)》編制說明注：提交時黑色和藍色字均不可刪減。沒有的應(yīng)寫“無。一、工作簡況（一）任務(wù)來源本標(biāo)準(zhǔn)在國家重點研發(fā)計劃“驢規(guī)?；B(yǎng)殖疫病防控技術(shù)與快繁技術(shù)的集成與示范”項目中示范、推廣。項目編號為：2018YFD0502205。（二）起草單位和主要起草人及其所做的工作（三）主要工作過程處理情況進行總結(jié)說明。起草階段實時熒光PCRELISA2021年4月，我們初步完成了標(biāo)準(zhǔn)的修訂并送交同行專家審定。征求意見階段審查階段（此次不寫本部分）報批階段（此次不寫本部分）二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)的編寫原則主要闡述標(biāo)準(zhǔn)制定或修訂過程遵循的基本原則。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)專項的研究成果本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒病研究團隊近十年科學(xué)研究的積累。在國家重點研發(fā)計劃“驢規(guī)?；B(yǎng)殖疫病防控技術(shù)與快繁技術(shù)的集成與示范”項目的資助下完成方法的示范和推廣。標(biāo)準(zhǔn)引用GB/T17494-2009《馬傳染性貧血病間接ELISAGB19489GB/TNY/T《獸醫(yī)診斷樣品采集、保存和運輸技術(shù)規(guī)范》。實際科研和檢測工作經(jīng)驗修訂標(biāo)準(zhǔn)編寫人員為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病研究室和ELISA和免疫印跡試驗，并對實驗操作的具體細節(jié)進行編寫。（二）提出本標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)主要內(nèi)容包括技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等。依據(jù)包括試驗和統(tǒng)計數(shù)據(jù)。尤其注意本條不要寫成任務(wù)來源。ELISA（GB/T17494-2009）“馬傳染性貧血”569-2002馬傳染性貧血瓊脂凝膠免疫擴散試驗”“免疫印跡”（GBT1.1-2020）進行了修訂。（三）新舊標(biāo)準(zhǔn)對比（適用于修訂標(biāo)準(zhǔn)的情況）除編輯性修改外，主要技術(shù)變化如下：增加臨床診斷。PCR對“瓊脂擴散試驗”中采用的檢測抗原的原材料進行了替換。在“ELISA抗體檢測方法”的基礎(chǔ)上，增加“ELISA抗體檢測方法”。增加免疫印跡試驗。三、主要試驗或驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟論證，預(yù)期的經(jīng)濟效果（一）主要試驗或驗證的分析增加臨床診斷傳染性貧血》專著等補充了臨床診斷的部分，主要內(nèi)容如下：（很少有感染20～4030天。馬傳染性貧血的特征性癥狀是發(fā)熱、貧血、黃疽、出血、水腫和反復(fù)發(fā)3臨床上一般常將馬傳貧患畜分為急性、亞急性、慢性及隱性型四個類型。急性型急性型多見于新疫區(qū)流行初期，病毒感染的潛伏期一般在20天左右，病程121高。亞急性型1～2有的還出現(xiàn)逆溫差來愈短，則可能轉(zhuǎn)化為慢性型。慢性型某些無熱期甚長的慢性患畜的臨床癥狀很不明顯，甚至無法辨認。隱性型PCR（類型。迅速死亡。增加實時熒光PCR方法PCR方面的檢測，OIERNA力，普通實驗室難以操作。感染早期在病毒反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成雙鏈病毒DNA（通常稱為前病毒povirlDNAA在病毒編碼的整合酶的作用下進一步整合到RNA病毒，其基因組RNADNA兩種形式。所以，國內(nèi)外學(xué)者主要采用從外周血單核細胞中DNA。PCRDNA我國馬傳貧病毒的檢測。詳細過程如下：引物和探針的設(shè)計世界動物衛(wèi)生組織（OIE）PCRgag2.12.1所示。2.1.本研究對NCBI（16條EV在tat基因的第一外顯子區(qū)和gag基因的N26和探針的位置如圖2.1所示。表2.1OIE推薦的引物和探針序列引物探針名稱序列EIAV1572FGGAGCCTTRAAAGGAGGGCCACTAAAEIAV1769RTTGTTGTGCTGACTCTTCTGTTGTATCGGGEIAVProbeFAM-ACGGGAAGCAAGGGGCTCAAGGGAGGCC-BHQ-1注：R=A/G表2.2本研究的引物探針序列引物/探針名稱序列EIAVuk.gag.409.P1_rc（簡稱為FAM-AAGACKTCTGTAAGTTCTCCTCTGCTP1_rc）G-MGBEIAVuk.340.F1（簡稱為F1）AGACCCTRCCTGYTGAACCTGGCTEIAVuk.455.R1-1（R1-1）TCCCATCTTACCTGTCMTCCTGTGEIAVuk.455.R1-2（R1-2）YCCCATYTTACCTGTCMTCCTGTGEIAVuk.455.R1-3（R1-3）YYCCATYTTACCTGTCMYCYTGTGEIAVuk.343.F2（簡稱為F2）CCCTRCCTGYTGAACCTGGCTEIAVuk.453.R2-1（R2-1）CCATCTTACCTGTCMTCCTGTGEIAVuk.453.R2-2（R2-2）CCATYTTACCTGTCMTCCTGTGEIAVuk.453.R2-3（R2-3）CCATYTTACCTGTCMYCYTGTG注：K=G/T;R=A/G;Y=C/T;M=A/C樣本的處理細胞培養(yǎng)物的處理：將細胞培養(yǎng)物用細胞刮刀刮下來，然后利用血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（天根）進行組織DNA的提取。全血樣品的處理：為了得到外周血單核細胞（PBMC），將全血在室溫自然沉降30（例較高/組織/（天根進行組織DNA提取。PCRPCR試劑：stirePCR（探針（天根反應(yīng)體系：2×FastFireqPCRPreMix:12.5μl上游特異性引物(10μM):0.75μl下游特異性引物(10μM):0.75μl探針(10μM):0.5μl基因組DNA模板:2ul50×ROXReferenceDye:0.5μlRNase-FreeddH2O補水至25μl總體系25μl反應(yīng)條件：981min 預(yù)變性;955sec 15sec退火/40光。引物的篩選利用血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（天根）提取EIAV遼寧毒株病毒感染的細胞培養(yǎng)物的組織DNA，獲得的DNA樣品命名為S1，分別用不同的引物和探針組合進行擴增，擴增結(jié)果如圖2.2所示。結(jié)果分析：經(jīng)對比，不同的引物和探針組合對相同模板（S1）擴增產(chǎn)生的Ct值差別不大，其中F1/R1-3和F2/R2-2與探針P1_rc組成的引物探針組合擴增獲得的Ct值略低，擴增效果略好；其中F1/R1-3含有的簡并堿基的序列能夠囊括所有EIAV的毒株，F(xiàn)2/R2-2中R2-2比R2-3少一個簡并堿基，Ct值差別也很?。ㄐ∮?.5個Ct）,因此選擇含有簡并堿基的引物，即F1/R1-3/P1_rx和F2/R2-3/P1_rx進行后續(xù)試驗。圖2.2引物的篩選結(jié)果目的基因的克隆F1/R1-3（340bp-455bpF2/R2-3343-453bp所對應(yīng)的序列）GelExtractionKitDNA回收試劑DNApMD18TDH5α，100%，說明克隆的序列正確。擴增效率10F1/R1-3/P1_rxPCR22.3。2.3F1/R1-3/P1_rxPCR10F2/R2-3/P1_rxPCR22.4。2.4F2/R2-3/P1_rxPCR結(jié)果表明，F(xiàn)1/R1-3/P1_rxF2/R2-3/P1_rxF1/R1-3/P1_rx。敏感性檢測10105、104、103102101100/μlEIAVDNA10倍倍比稀F1/R1-3/P1_rx進行熒光PCRH2O作為陰性對照。結(jié)果表明，該引物探針組合F1/R1-3/P1_rx的敏感性為10拷貝/μl的模板和145pg/ul細胞樣品中的組織DNA。特異性檢測I型病毒、馬流產(chǎn)沙門氏菌以及馬鏈球菌的核酸作為模板，以引物探針組合F1/R1-3/P1_rxPCR的擴增。2.5所示。2.5F1/R1-3/P1_rx重復(fù)性檢測（10^7（10^5（10^32.32.42.3組內(nèi)重復(fù)試驗?zāi)０蹇截悢?shù)組內(nèi)重復(fù)三次（Ct值）MSDCV10^716.7016.2816.2516.410.25159491.53%10^523.3722.9122.5222.930.42548011.86%10^329.6628.9628.8829.170.42910761.47%2.4組間重復(fù)試驗?zāi)０蹇截悢?shù)組間重復(fù)三次（Ct值）MSDCV10^716.4116.8617.0116.760.31224991.86%10^522.9323.0523.223.060.13527750.59%10^329.1728.9630.2529.460.69217052.35%EIAV由于本實驗室僅保存有的中國毒株（liaoning株、株以及等UK3OIE擴增方法得到的目的片段相應(yīng)位置的不同毒株上的序列（兩端目10T進行連接，這些代表性毒株的特定基因序列均被插pMVPCR3-5ug1mlDEPC100倍PCR的模板。DNAliaoning株、株、UK3血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（天根）DNA的提取。結(jié)果如下表2.3所示。表2.3使用本研究及OIE引物探針組合對不同來源的毒株的檢測結(jié)果毒株名稱/模板類型引物探針組合F1/R1-3/P1_rx擴增結(jié)果（CT值）OIE引物/探針組合擴增結(jié)果（CT值）BauGardco/質(zhì)粒+-cornwall/質(zhì)粒+-DEItaly/質(zhì)粒+-Devon/質(zhì)粒+-EclGardco/質(zhì)粒+-F2/質(zhì)粒+-Ita-1/質(zhì)粒+-Miyazaki2011-A/質(zhì)粒+-Newmarket/質(zhì)粒+-POCONE-BRA1/ 質(zhì)粒+-SA-Italy/質(zhì)粒+-V26/質(zhì)粒++UK3/質(zhì)粒++DLV2-6/基因組DNA+-Liaoning/基因組DNA+-Vaccine/基因組DNA+-UK3傳代毒/基因組DNA++由表2.3可見，使用OIE推薦的引物探針組合僅能檢測到美洲毒株UK3F1/R1-3/P1_rx毒株，具有能夠?qū)崿F(xiàn)廣譜檢測的特點。臨床樣品的檢測將72PCR綜上內(nèi)容已申報國家發(fā)明專利，專利名稱為：馬傳染性貧血病毒熒光PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用，專利申請?zhí)枮椋?021101436145。瓊脂擴散試驗（NY/T569-2002馬傳染性貧血瓊脂凝膠免疫擴散試驗傳貧特異性p26蛋白，并進行純化，大大提高了檢測的特異性，沒有假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。詳細過程如下：目的基因的擴增提取馬傳貧病毒的RNA，用EIAVp26蛋白特異性引物進行RT-PCR擴增，獲得大小為705bp的目的片段，詳見圖3.1。705bp圖3.1EIAVp26蛋白編碼基因PCR擴增結(jié)果目的基因的克隆將目的基因與pET-30a（+）質(zhì)粒分別用BamHI和HindIII進行酶切，凝膠回收酶切獲得的目的片段和空載體；然后利用T4DNA連接酶，將目的基因插入到pET-30a(+)空載體中，將獲得重組質(zhì)粒分別進行酶切鑒定，獲得了與目的條帶大小一致的5391bp和717bp的條帶片段，詳見圖3.2。圖3.2EIAVp26基因克隆獲得重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果目的蛋白的表達預(yù)增菌培養(yǎng)16小時，以1：100比例接種于Kan/LB液體培養(yǎng)基中，37℃170r/min培養(yǎng)，等到菌液OD600nm為0.6左右時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG37℃進行誘導(dǎo)表達4小時。，將獲得的重組蛋白。對誘導(dǎo)表達的重組蛋白進行SDS試驗，結(jié)果在34kDa處有明顯條帶，詳見圖3.3。圖3.3誘導(dǎo)蛋白SDS檢測圖目的蛋白的純化誘導(dǎo)表達完成后，離心富集菌體，用PBS重懸超聲破碎；破碎后，4℃條件下12000r/min離心5minHighAffinityNi-ChargedResinFF說明書進行純化。重組蛋白作為瓊擴試驗的檢測抗原將重組蛋白加于梅花孔中央，將原商品化瓊擴檢測用抗體加入到第1,3,5孔，將陽性血清樣品加入到第2,4,6孔中，48小時觀察結(jié)果時，均產(chǎn)生肉眼可見的沉淀線。詳見圖3.4。圖3.4重組蛋白作為瓊擴試驗的檢測抗原的驗證結(jié)果重組蛋白進行瓊擴試驗的特異性檢測1,3,5個梅花孔的第2,4,648特異性血清均無沉淀線。與原檢測用抗原的比較花孔的1,3,52,6448以重組蛋白為抗原的梅花孔在第2,6孔處未出現(xiàn)沉淀線，結(jié)果正確；而用原檢測用抗原，在花孔在第2,6孔處出現(xiàn)與毗鄰孔交叉的沉淀線，該沉淀線為假陽性結(jié)果。詳見圖3.5。圖3.5分別使用原檢測用抗原（A）和重組蛋白（B）加入到梅花孔進行瓊擴試驗的結(jié)果3.4.5 與國際上同類產(chǎn)品的比較利用本項目的試劑美國VMRD時間在24~48小時，而VMRD時間在48~72小時，這表明本項目采用的試劑好于國外同類產(chǎn)品。詳見3.6.圖3.6A.本項目采用的試劑，B.美國VMRD公司的瓊擴試劑盒臨床樣品的檢測將臨床50010份已知陽性樣品檢測為陽性，490份樣品為陰性，所以，本項目采用的試劑診斷敏感性和診斷特異性均為100%。競爭ELISA原國標(biāo)中采用間接ELISAELISA成假陽性結(jié)果。單克隆抗體的制備以純化后的原核表達的重組天然p26蛋白免疫小鼠，共免疫3次，分別在二免（4300010min接ELISA3BALB/c小鼠再進行加強免疫，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。BALB/c96SP2/04:1PEG于準(zhǔn)好的飼養(yǎng)層細胞之上。利用國標(biāo)推薦的間接ELISA檢測方法篩選陽性雜交瘤細胞株，對反應(yīng)陽性的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，同時用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆，克隆3輪，將克隆好的陽性雜交瘤細胞及時凍存。p26蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，命名為，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北1CGMCCNO.9106，2014421日。單克隆抗體的純化256~8BALB/C小鼠，均腹腔注射弗氏不完全佐劑，0.5ml/245000r/min10HiTrapproteinG體進行進行BandScan5.0255kb25kb87.5%4.1。圖4.1單克隆抗體SDS電泳試驗結(jié)果酶標(biāo)抗原的制備利用Lightning-LinkHRPConjugationKit試劑盒將純化的p26蛋白標(biāo)記HRP（辣根過氧化物酶。ELISA3720.5370.5TMB450nmOD450nm值，記錄結(jié)果帶入抑制率計算公式：抑制率=100×（陰性對照血清平均OD450nm值-OD450nm值OD450nm值-陽性對照血清OD450nm值。ELISACutoff選取樣品檢測結(jié)果抑制率的平均值為11.60%，所有樣品檢測結(jié)果抑制率的標(biāo)準(zhǔn)差為（11.60%+3×14.37%=54.7%約等于55%，+3×（11.60%+3×14.37%=54.7%）約等于55%，作為陽性樣品的判定標(biāo)準(zhǔn)。ELISA用競爭ELISA方法檢測3份陽性血清（Positiveserum1,2,3）和2份陰性血清Netiveserum1,23份陽性血清的效價分別為16,8和24.2。圖4.2競爭ELISA的檢測敏感性分析ELISA用競爭ELISAH3H74清等非特異性血清，結(jié)果均為陰性。ELISAELISA方法檢測馬傳染性貧血病毒強陽性血清、陽性血清、弱陽性1.435%~0.059%0.111%~0.660%與瓊脂擴散試驗的比較將1份馬傳貧弱陽性血清進行2倍倍比稀釋，分別進行瓊脂擴散試驗和競爭ES1ELSA的效價為8，這表明競爭ELISA的敏感性高于瓊脂擴散試驗。與國外檢測試劑盒的比較將本實驗室留存的5份陽性血清和200份陰性血清分別用美國IDEXX公司生產(chǎn)的cELISA試劑盒和本項目建立的競爭ELISA進行檢測，檢測結(jié)果均一致。將從美國NVSL購買的902和903馬傳貧陽性血清，以及從美國VMRD買的Strong,Medium和馬傳貧陽性血清分別用美國IDEXX公司生產(chǎn)的cELISA試劑盒和本項目建立的競爭ELISA進行檢測，IDEXX試劑盒檢測902和903為陽性，其他3份血清均為陰性，而本項目建立的競爭ELISA方法檢測5份血ELISA方法的檢出率高于國外同類試劑盒。詳見表4.1。表4.1國外馬傳貧血清的檢測結(jié)果樣品名稱本項目建立的競爭ELISA美國IDEXX試劑盒902++903++Strong+-Medium+-Weak+-臨床樣品的檢測將臨床50010利用上述檢測用抗原進行馬傳貧競爭ELISA份已知陽性樣品檢測為陽性，490份樣品為陰性，所以，本項目采用的試劑診斷敏感性和診斷特異性均為100%。2017ELISA3000為100%。免疫印跡試驗p26將30、40、50μg的p26重組蛋白分別進行SDS電泳，轉(zhuǎn)印后進行免疫印跡試驗，以1:200倍的陽性血清作為一抗，以抗馬二抗作為二抗，結(jié)果在34kD處檢測到目的條帶，詳見圖5.1。圖5.1陽性血清識別p26蛋白的免疫印跡試驗結(jié)果樣品的檢測將美國VMRD公司銷售的馬傳貧強陽（Strong、中陽（Medium）和弱陽性Weak商品化血清（詳見表4.1）利用瓊脂擴散和競爭ELISA方法進行檢測，結(jié)果表明，這3份血清瓊脂擴散試驗結(jié)果均為陰性，競爭ELISA檢測結(jié)果均為陽性，進一步用免疫印跡試驗進行確認，結(jié)果均在p26重組蛋白大小處檢測到了目的條帶，證明該3份血清為馬傳貧抗體陽性。詳見圖5.2。圖5.2免疫印跡試驗檢測待檢血清結(jié)果（二）綜述報告（馬傳貧（2012-2020界動物衛(wèi)生組織（OIE）OIE快