三七皂苷R1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的表達(dá) 4400字

三七皂苷R1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的表達(dá)4400字【摘要】［目的］探討三七皂苷R1對人白血病細(xì)胞株HL《60細(xì)胞凋亡作用及其機制。［辦法］光鏡下察看三七皂苷R1作用下HL《60細(xì)胞形態(tài)，采用MTT比色法察看三七皂苷R1對人白血病細(xì)胞株HL《60細(xì)胞增殖的抑制作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡改變,并以RT《PCR檢測凋亡調(diào)節(jié)基因survivin、bcl《2mRNA的敘述。［結(jié)果］三七皂苷R175《1200μg·ml-1可抑制人白血病細(xì)胞株HL《60細(xì)胞的生長,且呈時間和濃度依賴性。三七皂苷R1作用后人白血病細(xì)胞株HL《60細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡特征，流式細(xì)胞術(shù)顯示凋亡細(xì)胞比例升高，凋亡率隨作用劑量的增高而升高。RT《PCR檢測可見三七皂苷R1150μg/ml作用下survivin、bcl《2mRNA敘述減少。［結(jié)論］三七皂苷R1能誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞株HL《60細(xì)胞凋亡，其作用可能與凋亡調(diào)節(jié)基因survivin、bcl《2的下調(diào)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是評估抗腫瘤藥物療效的一個重要指標(biāo)，中藥抗腫瘤機制中的凋亡因素也受到很大重視，三七皂苷R1是中藥三七總皂甙的主要成分，有研究認(rèn)為：三七皂苷R1可抑制HL《60細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡，具體機制尚有待深入研究［1］。本研究主要察看三七皂苷R1誘導(dǎo)HL《60細(xì)胞凋亡時survivin、Bcl《2基因敘述變化并探討凋亡發(fā)生的機制。

1材料與辦法

1.1實驗材料RPMI《1640培養(yǎng)基為美國Hyclone產(chǎn)品，新生牛血清杭州四季青生物公司，膜聯(lián)蛋白V〔AnnexinⅤ〕為PharMingen公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)瓶和6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Falcon公司產(chǎn)品，二甲基亞砜〔DMSO〕、四甲基偶氮唑藍(lán)〔MTT〕為AMRESCO產(chǎn)品。三七皂苷R1對照品購自中國生物制品鑒定所，人白血病細(xì)胞株HL《60購自上海細(xì)胞庫。

1.2實驗辦法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：HL《60細(xì)胞株懸浮生長于RPMI1640培養(yǎng)液中,內(nèi)含10%小牛血清,1mmol·L-1谷胺酰胺及青鏈霉素各100U·L-1。于37℃，5%CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng),每2～3d傳代1次，于對數(shù)生長期細(xì)胞做后續(xù)實驗。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)察看收集經(jīng)三七皂苷R1誘導(dǎo)的HL《60細(xì)胞，離心洗滌，制細(xì)胞薄片，枯燥后瑞氏染色，鏡下察看細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.2.3MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率：調(diào)取HL《60細(xì)胞1.0×105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μl,每組各設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照孔。參加三七皂苷R1使終濃度分別為75、150、300、600、1200μg·ml-1。分別誘導(dǎo)培養(yǎng)至24h、48h和72h,于終止培養(yǎng)前4h每孔加MTT〔5mg/ml〕10μl,繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)后，離心，吸去上清,每孔加150μlDMSO〔二甲亞砜〕，搖勻振蕩。使結(jié)晶充沛溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔吸光值,波長490nm。根據(jù)細(xì)胞抑制率=1-〔試驗組OD值-空白組OD值〕/〔對照組OD值-空白孔OD值〕×100%公式,分別求得各組的細(xì)胞存活率。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測AnnexinⅤ改變收集空白對照組和藥物組〔三七皂甙R1150、300和600μg·ml-1作用72h〕細(xì)胞,經(jīng)預(yù)冷的PBS離心洗滌2次后，重懸于100μl的PBS中，加AnnexinⅤFITC標(biāo)記液5μl，混勻，4℃避光30min，加200μl1×緩沖液，用流式細(xì)胞儀〔FACScan，BectonDickinson〕檢測并分析結(jié)果。

1.2.5RT《PCR檢測survivin、Bcl《2基因mRNA的敘述：收集對照組和藥物作用組〔三七皂苷R1150μg·ml-1作用48h〕細(xì)胞,TRIzol裂解〔GIBCO公司〕提取細(xì)胞總RNA，特定蛋白分析儀測定RNA純度〔A260/A280>1.75〕。參加隨機引物及M《MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶〔MBI,FERMENTAS〕合成cDNA鏈。取cDNA0.1μg，參加10×Buffer2.5μl，25mM/LMgCl21μl、10Mm/LdNTP0.5μl，20pmol/μl的高低游引物各0.5μl，TaqDNA聚合酶〔Promega,5U/μl〕0.5μl，滅菌雙蒸水將反饋體系補足至25μl。ThermoPX2型PCR儀進行擴增，以β《actin作為內(nèi)參照。Survivin反饋條件為：預(yù)變性95℃2min；94℃變性45s，61℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后延伸10min。Bcl《2反饋條件為：預(yù)變性95℃2min；變性94℃45s,退火67℃45s,延伸72℃1min；最后延伸10min,共35個循環(huán)。β《actin反饋條件為：預(yù)變性95℃2min；變性94℃45s，退火58℃45s，延伸72℃1min；最后延伸10min，共35個循環(huán)。各引物序列分別為:survivin上游引物：5′《CTTTCTCAAGGACCACCGCATC《3′;下游引物：5′《CAATCCATGGCAGCCAGC《TGC《3′，目的基因393bp；Bcl《2上游引物為：5’《CAGCGACTTCTCCCGCCGCTACCGC《3’,下游引物為5’《CCGCATGCTGGGGCCGTACA《GTTCC《3’，擴增產(chǎn)物為318bp。β《actin上游引物為：5’《CGCTGCGCTGGTCGTCGACA《3’，下游引物為5’《GTCACGCACGATTTCCCGCT《3’，擴增產(chǎn)物為619bp。擴增產(chǎn)物行1.7％瓊脂糖凝膠電泳，于BIO《RADGel2000凝膠成像儀上成像，QuantityOne軟件作半定量分析。

2結(jié)果

2.1三七皂苷R1對HL《60細(xì)胞增殖的影響三七皂苷R1對HL《60細(xì)胞的生長抑制與藥物濃度有明顯的依賴關(guān)系，隨著藥物濃度時間增加,生長抑制率增加,見圖1。表明三七皂苷R1抑制HL《60細(xì)胞生長有濃度時間依賴性。

圖1MTT比色法檢測三七皂苷R1對HL《60細(xì)胞的增殖抑制〔略〕

2.2三七皂苷R1誘導(dǎo)HL《60細(xì)胞AnnexinⅤ敘述：HL《60細(xì)胞經(jīng)150、300、600μg/ml三七皂苷R1誘導(dǎo)72h，流式檢測AnnexinⅤ即呈陽性敘述，其陽性率為29.95％、42.71％、72.52％；600μg/ml三七皂苷R1作用組陽性率達(dá)72.52％,見圖2。研究說明，在相同作用時間下，HL《60細(xì)胞凋亡率隨作用劑量的增高而升高。

圖2三七皂甙RI作用HL《60細(xì)胞72hAnnexinV分析〔略〕

〔a〕空白對照；〔b〕150μg/ml作用組；〔c〕300μg/ml作用組；〔d〕600μg/ml作用組

2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)察看HL《60細(xì)胞與300～1200μg·ml-1的三七皂苷共同孵育72h。在光鏡下出現(xiàn)典型的調(diào)亡形態(tài)特征,即細(xì)胞體積縮小，胞膜皺縮，核固縮，凝聚，碎裂，并有凋亡小體形成，見圖3、4。

圖3空白對照組HL《60細(xì)胞〔略〕

圖4經(jīng)三七皂甙R1處理的HL《60細(xì)胞〔略〕

2.4survivin、Bcl《2mRNA敘述的變化RT《PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,三七皂苷R1作用48h后，HL《60細(xì)胞survivin、Bcl《2基因的mRNA水平下降，見圖5、6。

圖5HL《60細(xì)胞Survivin、β《actinmRNA敘述〔略〕

1為100bpladder；2為空白對照組；3～6為分別為150μg/ml三七皂甙R1誘導(dǎo)HL《60細(xì)胞12h、24h、48h和72h的Survivin與P53mRNA敘述

圖6HL《60細(xì)胞Bcl《2mRNA敘述〔略〕

1為100bpladder；2為空白對照組；3～6為分別為150μg/ml三七皂甙R1誘導(dǎo)HL《60細(xì)胞12h、24h、48h和72h的Bcl《2mRNA敘述3討論

細(xì)胞凋亡是一種主動的,由遺傳控制的程序性死亡，對正常細(xì)胞影響小，屬不可逆死亡，不存在復(fù)發(fā)和耐藥問題［2］；有觀點認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞可能起源于正常情況下本應(yīng)該走向凋亡而未發(fā)生凋亡的細(xì)胞，為了維持整體的高度增殖，腫瘤細(xì)胞群會保存抗拒細(xì)胞凋亡而存活的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的高增殖一方面來自于腫瘤細(xì)胞的高增殖能力和低分化程度，另一方面來自于癌細(xì)胞的凋亡被抑制、生存延長，這在濾泡型B淋巴瘤中已得到證實［3］。三七皂苷R1為中藥三七總皂甙的主要成分之一，石雪迎等報告認(rèn)為：三七總皂甙有促進MNNG轉(zhuǎn)化的人胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的作用［4］；據(jù)報導(dǎo)三七皂苷可增加小鼠脾細(xì)胞內(nèi)cAMP含量,從而提高脾細(xì)胞殺傷力,增強免疫功能［5］；采用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù),通過細(xì)胞形態(tài)學(xué),細(xì)胞化學(xué),外表膜抗原的檢測,徐羅玲［1］等研究說明三七皂苷R1能誘導(dǎo)HL《60細(xì)胞向粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化；王國俊等研究認(rèn)為三七皂苷R1可明顯抑制HL《60細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡［6］。

我們研究說明三七皂苷R175～1200μg·ml-1,可明顯抑制HL《60細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，并與誘導(dǎo)時間根本呈正相關(guān)。MTT法測三七皂苷R1對HL《60細(xì)胞的生長抑制率顯示75-1200μg·ml-1三七皂苷R1作用48h可顯著抑制HL《60細(xì)胞增殖,且隨著藥物濃度及時間增加抑制作用增強,有藥物濃度時間依賴性。HL《60細(xì)胞經(jīng)150、300μg/ml、600μg/ml三七皂苷R1誘導(dǎo)72h時，流式檢測AnnexinⅤ陽性率為29.95％、42.71％、72.52％，研究說明，在相同作用時間下，HL《60細(xì)胞凋亡率隨作用劑量的增高而升高。這些結(jié)果均說明三七皂苷R1可誘導(dǎo)HL《60細(xì)胞凋亡。

survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡基因，它定位于17q25,結(jié)構(gòu)獨特，分子中不含環(huán)指狀結(jié)構(gòu)，其敘述的蛋白質(zhì)通過抑制Caspase《3、Caspase《7等途徑抑制細(xì)胞的程序化死亡［7］，survivin基因在分化組織不敘述,在胎組織