腎炎2號防治IgA腎病大鼠的實驗 4300字

腎炎2號防治IgA腎病大鼠的實驗4300字【摘要】［目的］察看腎炎2號對IgA腎病大鼠的防治作用，并探討其作用機(jī)理。［辦法］使用口服和尾靜脈注射牛血清白蛋白〔BSA〕的辦法制作大鼠IgA腎病模型，治療組、對照組造模同時分別給予腎炎2號〔15g/kg〕和福辛普利〔4.17mg/kg〕至12周末。察看尿常規(guī)、24h尿蛋白定量、血常規(guī)、肝腎功能的變化及腎組織的病理改變。［結(jié)果］1.各組大鼠尿常規(guī)均未見紅細(xì)胞。2.治療組、對照組第7～12周末24h尿蛋白定量較模型組明顯降低〔P0.05〕。3.各組血常規(guī)和肝腎功能相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差別〔P>0.05〕。4.與模型組比擬，治療組大鼠腎組織系膜區(qū)IgA沉積減少；系膜基質(zhì)、系膜細(xì)胞增生程度減輕，但治療組、對照組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差別〔P>0.05〕。［結(jié)論］腎炎2號具有降低蛋白尿、抑制系膜區(qū)IgA沉積、減少系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞增生的作用，與西藥福辛普利相比無明顯差別。

IgA腎病〔IgAN〕是世界范圍內(nèi)常見的進(jìn)展性的原發(fā)性腎小球疾病，診斷后每10年約有15%～20%的患者進(jìn)展到慢性腎功能衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)迄今尚無特異的治療辦法，而中醫(yī)藥在控制臨床病癥，減少蛋白尿，延緩腎功能衰竭進(jìn)程，提高病人的生活質(zhì)量上有一定的優(yōu)勢。

腎炎2號是浙江中醫(yī)藥大學(xué)從屬第一醫(yī)院李學(xué)銘主任醫(yī)師的經(jīng)驗根底方，多年的臨床察看說明對該方的辨證加減能有效減少IgAN患者的蛋白尿，并改善患者的臨床病癥。但未能知曉腎臟病理改善的情況，只能從某些血、尿指標(biāo)或與作用機(jī)制相關(guān)指標(biāo)的改善來大致推測其作用機(jī)理。為進(jìn)一步研究腎炎2號治療IgA腎病的效果及作用機(jī)理，我們構(gòu)想通過復(fù)制IgA腎病模型探討腎炎2號對實驗?zāi)I炎大鼠的防治作用及可能的機(jī)制。

1材料與辦法

1.1實驗動物及分組SD純種大白鼠,雌性40只,體重〔140±10〕g,12周齡，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將尿常規(guī)陰性動物隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥對照組、中藥治療組4組,每組各10只。

1.2試劑及儀器牛血清白蛋白〔BSA〕,寶靈曼公司。POLYCLONALANTIBODY,GOATANTIRATIgA：FTIC，SEROETLtd提供。鼠抗人α－平滑肌肌動蛋白單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二步法抗鼠/兔通用型免疫組化試劑盒，GeneTech〔Shanghai〕CompanyLimited提供。腎炎2號〔由生黃芪、雷公藤、制大黃、紅花、銀花等顆粒劑組成，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，浙江中醫(yī)藥大學(xué)從屬第一醫(yī)院中藥房配制〕，稀釋成1.5g/ml的溶液。福辛普利片劑〔劑量10mg〕，上海施貴寶有限公司，用蒸餾水稀釋成4.17mg/kg的溶液。LEICARMI135切片機(jī)、LEICACM1850冰凍切片機(jī)、LEICATCS《SP型激光共聚焦顯微鏡、LEICA病理圖象分析系統(tǒng)、LYMPUSBX60顯微鏡。

1.3實驗辦法

1.3.1造模及治療IgA腎病模型制備參照Emancipator等［1］報道辦法，即隔日口服含0.1%BSA的酸化水，6周后定期尾靜脈注射1%BSA緩沖液〔每日1次，連續(xù)3次〕，然后察看至第12周末。中藥治療組、西藥對照組的造模與模型組相同，并于造模開始即分別用腎炎2號〔劑量為15g/kg〕、福辛普利片〔4.17mg/kg〕灌胃給藥，至第12周末。正常組隔日口服酸化水，共12周。在上述12周內(nèi),各組動物進(jìn)食進(jìn)水量不限。從第7周末起用代謝籠留尿，每周查尿常規(guī)及24h尿蛋白定量。實驗動物在12W周末，禁食12h，3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，剖腹，腹主靜脈取血，測血常規(guī)、血清肌酐、尿素氮、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶。然后取出雙腎組織進(jìn)行光鏡、免疫熒光觀測。

1.3.2檢測工程及辦法尿常規(guī)及沉渣鏡檢：尿常規(guī)采用LINITEK500尿常規(guī)分析儀檢測；24ｈ尿蛋白定量：比色法。血常規(guī)：COULTERLH750ANALYZER血常規(guī)自動分析儀。血液生化：血清肌酐〔SCR〕、尿素氮〔BUN〕、血白蛋白〔ALB〕、谷丙轉(zhuǎn)氨酶〔ALT〕、谷草轉(zhuǎn)氨酶〔AST〕:采用SYNCHRONclinicalsystemLX20全自動生化分析儀檢測。腎組織光鏡察看所取組織用10％福爾馬林固定液固定,切成3μｍ厚的切片,用HE常規(guī)染色，最后在olympusBX60光學(xué)顯微鏡下察看腎組織的病理形態(tài)學(xué)的改變。腎組織免疫熒光察看：用組織包埋劑OCT將新鮮組織包埋后，液氮速凍，由LEICACM1850冰凍切片機(jī)切成4μｍ后的切片，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上室溫晾干。放入PBS內(nèi)輕洗1min×3次。滴加羊抗大鼠免疫熒光IgA〔異硫氫熒光素標(biāo)記〕抗體稀釋液，37℃避光孵育45min。用蒸餾水輕洗1min〔三道〕后用紙吸干切片外表的水液，即刻在LEICATCS《SP型激光共聚焦顯微鏡顯微鏡下察看。

1.4統(tǒng)計辦法運用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，本文資料均用〔x±s〕表示，采用單因素方差分析，組間比擬采用S《N《Q檢驗。

2結(jié)果

2.1尿常規(guī)見圖1。實驗結(jié)果顯示第7周末起模型組中尿常規(guī)可見有蛋白尿，到第9周末達(dá)100％，對照組、治療組亦可見蛋白尿，但隨著用藥時間的延長，蛋白尿逐漸減少。正常組蛋白尿陰性。

〔1-模型組，2-對照組，3-治療組〕

圖1尿常規(guī)〔略〕

2.224h尿蛋白定量情況見表1。

表1各組大鼠24h尿蛋白定量檢測情況〔略〕

▲模型組24hUPro與其它各組比擬，P0.05?！竦?、8、12周末對照組、治療組24hUPro與正常組比擬，P0.05

2.3血清Scr、BuN、Alb、ALT、AST檢測結(jié)果:見表2。

表2各組大鼠Scr、BUN、Alb、ALT、AST檢測情況〔略〕

△＊★●◆各組Scr、BUN、Alb、ALT、AST相比不具有統(tǒng)計學(xué)上的差別，P>0.05

2.4血常規(guī)見表3。

表312周末各組大鼠血常規(guī)檢測情況〔略〕

2.5腎組織免疫熒光實驗顯示模型組中IgA中重度彌漫性地沉積于系膜區(qū)，呈散在顆粒狀，個別呈團(tuán)塊狀，說明造模成功，按熒光分級屬于++～+++。正常組、對照組、治療組大鼠腎組織系膜區(qū)IgA無或微弱的沉積。

2.6腎組織光鏡HE染色顯示正常組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)，未見明顯異常。模型組病變主要表現(xiàn)為彌漫的中重度系膜組織增生，也可見局部毛細(xì)血管襻受壓，管腔狹小及球囊粘連的現(xiàn)象。對照組、治療組系膜基質(zhì)增生程度較模型組為輕，系膜細(xì)胞數(shù)較模型組少。

3討論

近年來大量資料研究說明，持續(xù)蛋白尿是影響IgA腎病預(yù)后獨立的重要因素。大量蛋白尿致腎小球處于高灌注、高濾過狀態(tài)，促使腎小球毛細(xì)血管發(fā)生功能障礙，過多的大分子物質(zhì)濾過，相繼造成系膜細(xì)胞損傷，系膜基質(zhì)增多，漸而導(dǎo)致腎小球硬化，最終使腎功能毀損。同時蛋白尿在腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、腎小管上皮細(xì)胞活化或損傷、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及腎小管間質(zhì)損傷等過程中也發(fā)揮重要的作用。而且腎小管間質(zhì)病變將通過腎小球缺血、管一球返饋調(diào)節(jié)等途徑進(jìn)一步加重腎小球的損害，導(dǎo)致腎功能的減退，最終形成惡性循環(huán)，進(jìn)入腎功能衰竭。因此通過減少蛋白尿，可抑制系膜細(xì)胞〔MC〕增殖，減輕細(xì)胞外基質(zhì)〔ECM〕積聚，避免腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，從而延緩腎臟病變的進(jìn)程。

中醫(yī)認(rèn)為蛋白尿形成的根底是脾腎兩虛。脾氣虛弱那么運化無力，脾陽虛衰那么不能升清，精氣下注，從溲而泄那么出現(xiàn)蛋白尿。腎氣虛那么精關(guān)不固，封藏失職，攝納無權(quán)，精微下注也會導(dǎo)致蛋白尿。再者，臟腑功能失調(diào)所致的病理產(chǎn)物與外感六淫之邪可相互為患，迫精外泄而形成蛋白。常見的外邪有風(fēng)邪、濕邪，病理產(chǎn)物多以濕熱、瘀血為患。腎炎2號根本組成為黃芪、制大黃、雷公藤、銀花、紅花。黃芪具有補(bǔ)氣、益衛(wèi)固表、利水消腫成效。本病主要病機(jī)為脾腎氣虛，故以黃芪為君藥，大補(bǔ)元氣治本虛。雷公藤性苦，具有祛風(fēng)除濕、活血、消炎、解毒之功，以消本病之風(fēng)、濕外邪，且風(fēng)又能滲濕，故為臣藥。黃芪合雷公藤，增加脾氣健運之力，那么濕邪不易內(nèi)困，故能固表而不斂邪，同時祛風(fēng)滲濕而又不傷正。制大黃、銀花、紅花為佐藥，除本病之標(biāo)〔濕熱、瘀血〕。制大黃攻下導(dǎo)滯、瀉火解毒、祛瘀止血、通淋降濁，銀花清熱解毒透邪，且黃芪伍銀花，亦可鼓舞衛(wèi)氣驅(qū)邪；紅花通瘀活血為血中氣藥，制大黃合紅花，通久病之絡(luò)，化久病之瘀。又氣能行血，合黃芪更能增加活血化瘀之功。全方益氣化瘀、清熱滲濕，諸藥配伍補(bǔ)而不滯邪，清而不傷正。

本實驗結(jié)果說明腎炎2號對IgA腎病大鼠模型有下列幾個作用。第一：減少蛋白尿?？赡芡ㄟ^改善腎小球濾過膜的選擇性，恢復(fù)腎小球基底膜的電荷屏障作用，減少系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)的合成等途徑發(fā)揮作用，延緩病情進(jìn)展。第二：抑制系膜區(qū)IgA沉積。沉積在腎小球系膜區(qū)的IgA或以IgA為主的免疫球蛋白，可通過活化MC及部分補(bǔ)體系統(tǒng),啟動腎小球炎癥過程，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增多、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和GBM結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等。腎炎2號可能通過抑制系膜區(qū)IgA沉積使免疫復(fù)合物的形成減少，從而減少了腎小球的進(jìn)一步損傷。第三：改善IgA腎病病理損傷。中藥治療組與模型組相比系膜基質(zhì)、系膜細(xì)胞的增生明顯減少，毛細(xì)血管襻開放良好，從病理上提示腎炎2號通過抑制系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)增多，減