分子生物學專題

1IsolatingLABfromdifferentniches3

FoodgradevectorConstruction2SecondMetabolite4StressresponsemechanismofLAB1.1LABandBifidobacteriawereisolatedfromthedifferentniches(1)Atraditionallyfermenteddairyproductkoumiss

Unpasteurizedfreshhorse’sMilkfermentedwithLABandYeastEnhancingimmunity,treatingtuberculosisandsoon酸馬奶是以鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母等微生物共同發(fā)酵而成酸性乳飲料。酸馬奶具有降血壓、降血脂和調(diào)節(jié)胃腸道疾病等醫(yī)療保健功能，研究表明乳酸菌發(fā)揮著非常重要的作用。(Montanaretal.1996;Wangetal.2008；Wu

etal.2009)存在問題：由于缺乏對傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中乳酸菌種類和組成的系統(tǒng)了解，目前尚無法開發(fā)出適宜工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵劑，阻礙了酸馬奶工業(yè)化生產(chǎn)的進程。阻礙目標菌種鑒定方法參考文獻L.plantarum

生化鑒定/16SrDNAAnY等；孫天松等L.pentosus

生化鑒定AnY等；熊素云等L.helveticus生化鑒定/16SrDNA孫天松等；Uchidak

等L.acidophilus生化鑒定/16SrDNA孫天松等；畢玉海等L.casei生化鑒定/16SrDNA孫天松等；畢玉海等L.paracasei生化鑒定/16SrDNA劉芳等；烏日娜等L.rhamnosus16SrDNA烏日娜等L.delbrueckii

生化鑒定/16SrDNA孫天松等；吳敬等L.fermentum生化鑒定/16SrDNA孫天松等；烏日娜等L.curvatus生化鑒定/16SrDNA孫天松等；烏日娜等L.kefiranofaciens16SrDNA烏日娜等L.kefiri16SrDNAUchidak

等Ln.Mensenteroides生化鑒定/16SrDNA劉芳等；賀銀鳳等E.facealis生化鑒定/16SrDNA烏日娜等；賀銀鳳等

酸馬奶乳酸菌多樣性研究進展

依賴于培養(yǎng)的方法及其局限性分離純化得到純菌形態(tài)學鑒定生理生化鑒定分子生物學鑒定局限性：標準培養(yǎng)基難以完全模擬環(huán)境條件，僅可對可培養(yǎng)的細菌進行研究，因此不能客觀全面的反應樣品中微生物的組成。不依賴于培養(yǎng)方法的優(yōu)點不依賴于培養(yǎng)方法：

從樣品中直接提取微生物總DNA

,利用分子生物學方法對微生物的種類和組成進行檢測。變性梯度凝膠電泳時間溫度梯度凝膠電泳末端限制性長度多態(tài)性優(yōu)點檢測速度快，可同時檢測多個樣品檢測極限低，結(jié)果客觀可靠可與培養(yǎng)方法結(jié)合非培養(yǎng)方法在發(fā)酵乳制品中的應用所用技術目標菌應用領域參考文獻DGGE乳酸菌Sicilian干酪Randazzo,2002DGGE細菌Mozzarella干酪Ercolini,2004TTGE細菌人工制備干酪Ogier,2002DGGE/TTGE細菌商業(yè)干酪Ogier,2004DGGE細菌Lighvan干酪Kaflli,2009DGGE細菌Carbrales干酪Florez,2006TTGE細菌人工制備發(fā)酵奶Ogier,2002DGGE/TTGE細菌Zabady發(fā)酵奶El-Baradei,2008DGGE/TTGE細菌原料奶Lafarge,2004DGGE的原理及步驟原理：片段大小相同、堿基組成不同的雙鏈DNA分子，在變性劑梯度凝膠電泳時因具有不同的解鏈溫度而滯留于凝膠的不同位置，最終形成相互分開的譜帶。酸馬奶樣品基因組提取靶基因序列PCR擴增混合DNA擴增產(chǎn)物（相同大小，不同序列）DGGE分析共遷移的原因及解決方法共遷移原因：但由于某些菌株的靶基因序列高度相似，DGGE時會發(fā)生共遷移現(xiàn)象，導致無法根據(jù)Marker比對和測序的方法進行鑒定。BegleyM,etal.ApplEnvironMicrobiol.2006,72(3):1729-1738解決方法：種特異性PCR可以根據(jù)編碼基因的種特異性序列設計引物，通過對PCR產(chǎn)物的分析，精確鑒定存在共遷移的菌種。OgierM,etal.ApplEnvironMicrobiol.2002,72(3):1028-1032實驗方案酸馬奶樣品的采集細菌總DNA的提取DGGE圖譜的建立種特異性PCR鑒定共遷移條帶無法比對條帶進行測序鑒定利用比對Marker鑒定條帶培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)基活菌計數(shù)，確定乳酸菌主要菌屬分離純化分子方法鑒定為酸馬奶中乳酸菌的開發(fā)奠定基礎系統(tǒng)了解酸馬奶中乳酸菌多樣性，為商業(yè)發(fā)酵劑的開發(fā)提供參考實驗結(jié)果與分析（一）種特異性PCR方法的建立酸馬奶中可能存在共遷移菌種的確定優(yōu)勢菌種所屬類群參考文獻L.plantarumL.pentosus植物乳桿菌類群AnY等；孫天松等；畢玉海等；吳敬等；劉芳等；烏日娜等；Uchidak

等AnY等；熊素云等L.helveticusL.acidophilus

嗜酸乳桿菌類群孫天松等；Uchidak

等；烏日娜等孫天松等；畢玉海等；劉芳等；烏日娜等L.caseiL.paracasei干酪乳桿菌類群孫天松等；畢玉海等；吳敬等；劉芳等；烏日娜等；熊素云等；賀銀鳳等劉芳等；烏日娜等；Uchidak

等三大類群乳酸菌種特異性PCR引物的確定目標菌種引物

序列（5’-3’）

產(chǎn)

物大小(bp)

退火

溫度（℃）參考文獻L.PentosuspentFCAGTGGCGCGGTTGATATC21862Torriani,

2001PrevTCGGGATTACCAAACATCACL.plantarumplanFCCGTTTATGCGGAACACCTA31858pREVTCGGGATTACCAAACATCACL.helveticusPeCfCTGTTTTCAATGTTGCAAGTC52464Fortina,

2001PeCrTTTGCCAGCATTAACAAGTCTL.acidophilusAci16SIAGCTGAACCAACAGATTCAC74062Walter,200016SIIACTACCAGGGTATCTAATCCL.caseiCaseiTGCACTGAGATTCGACTTAA29055Ward,1999Y2CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTL.paracaseiParaCACCGAGATTCAACATGG29055Y2CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT酸馬奶乳酸菌專用鑒定Marker的建立目標菌株的確定：參照傳統(tǒng)方法的分離結(jié)果，選擇出現(xiàn)2次以上的乳酸菌，作為鑒定Marker的參考菌株。編號1234567菌種植物乳桿菌戊糖乳桿菌發(fā)酵乳桿菌腸膜明串珠菌嗜酸乳桿菌瑞士乳桿菌彎曲乳桿菌編號8910111213菌種糞腸球菌乳酸乳球菌嗜熱鏈球菌干酪乳桿菌副干酪乳桿菌鼠李糖乳桿菌鑒定Marker選用的參考菌株利用DGGE檢測酸馬奶乳酸菌的多樣性

參考菌株基因組的檢測結(jié)果16SrDNAV3區(qū)外側(cè)700bp片段擴增結(jié)果16SrDNAV3區(qū)序列擴增結(jié)果參考菌株的基因組提取及靶序列擴增6株菌無共遷移，可以直接通過Marker進行鑒定。7株菌存在共遷移現(xiàn)象，分屬于乳酸菌中的三大類群。鑒定Marker的DGGE圖譜酸馬奶乳酸菌DGGE圖譜的建立

酸馬奶樣品的采集采樣區(qū)縣尼勒克縣新源縣采樣地點狗熊溝那拉提種蜂場卡普河則可臺采樣份數(shù)1181198酸馬奶中乳酸菌總DNA的提取提取方法的確定：采用溶菌酶-酚仿抽提的方法，并根據(jù)酸馬奶的性質(zhì)，在前處理上略加改進。酸馬奶樣品總DNA的檢測結(jié)果Ogier,etal.ApplEnvironMicrobiol.2002,72(3):1729-1738酸馬奶樣品DGGE圖譜的建立9個條帶通過鑒定Marker直接鑒定。11個條帶無法通過Marker直接比對，通過測序鑒定。通過種特異性PCR鑒定共遷移條帶。DGGE圖譜條帶測序鑒定結(jié)果

條帶編號

親緣關系最近種屬相似度(%)

序列號cUnculturedbacteriumclonenbw741c09c116SribosomalRNAgene100GQ011256.1d′Unculturedbacteriumpartial16SrRNAgene,cloneFC04D11100FM873249.1eLactobacillusjensenii95DQ317562.1hLactobacilluskefiranofaciens100AB372208.1iLactobacilluskitasatonis

99NR_024813.1jLactobacillussp.GTP516SribosomalRNAgene98AF157035.1lUnculturedbacteriumclonesic_616SribosomalRNAgene94GQ175531.1nLactobacilluskefiri92AB42937.1pUnculturedbacteriumclone14LED0416SribosomalRNAgene98FJ163966.1qLactobacillusbuchneri92FJ867641.1q′Unculturedbacteriumclone14LEJ0516SribosomalRNAgene94FJ163981.1DGGE結(jié)果小結(jié)

新疆地區(qū)酸馬奶中含有植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等18種乳酸菌。酸馬奶中的主要乳酸菌是嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和馬奶酒樣乳桿菌。本研究首次在酸馬奶中發(fā)現(xiàn)了布氏乳桿菌、詹氏乳桿菌和卡氏乳桿菌，前人使用培養(yǎng)方法對酸馬奶的研究中均未見報道。(2)FecesofHealthyChineseCentenarian

7personswereolderthan100yearsoldin555persons

Thisratioisasmuch200timesastheinternationalstandardoflongevitycountryside1.2.1細菌素簡介片球菌素

細菌素：由某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌生物活性的肽或前體。抗菌的對象主要是與產(chǎn)生菌分類上相近的細菌。（1）I類為羊毛硫細菌素：分子內(nèi)硫醚環(huán)中含有稀有氨基酸

修飾后的小肽（小于5kDa），例如Nisin。（2）II類細菌素是不含羊毛硫氨酸、非修飾、分子量小于10kDa、熱穩(wěn)定的、富含小氨基酸，通常為陽離子親

水親脂的兩性物質(zhì)，例如：片球菌素pediocinPA-1.

Secondmetabolite-IIabacteriocinCommonmechanismsoftargetcellrecognitionandimmunityforclassIIbacteriocins,2007,PNASPedBImmunityproteinPedBtopediocinPA-1ModeloftargetcellkillingandimmunityforClassIIaBcteriocin碩士課題利用定點突變技術將免疫蛋白PedB的46位點的賴氨酸進行突變成帶正電、帶負電和不帶電荷的氨基酸，檢測各突變體對細菌素的敏感性，以闡明46位點的賴氨酸對其免疫活性的影響。二、立題依據(jù)與意義3.2.4定點突變技術路線不帶電荷精氨酸-Arg帶正電荷天冬氨酸-Asp谷氨酸-Glu帶負電荷

谷氨酰胺-Gln

Textinhere賴氨酸+++++亮氨酸-LeuFig.5.Detectionofthewild-typeandmutatedfPedBproteinsbyimmunoblottinganalysis3.3攜帶野生型免疫蛋白基因或突變基因的植物乳桿菌對細菌素的敏感性分析菌株敏感性抑菌圈對照質(zhì)粒pNZ81481pNZfPedB128pNZfK46Q1pNZfK46T1pNZfK46D1pNZfK46E1pNZfK46R1免疫蛋白的表達在一定程度上對宿主細胞起到了保護作用。免疫蛋白各突變體的活性均喪失，而且保守突變（K-R）的活性亦喪失。原核基因的結(jié)構(gòu)－35區(qū)－10區(qū)5非翻譯區(qū)3非翻譯區(qū)原核生物基因：多順反子，多基因產(chǎn)物啟動子含有SD序列，與核糖體結(jié)合啟動翻譯。與RNA聚合酶結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄ATGTAA轉(zhuǎn)錄單位終止子編碼區(qū)真核生物基因的結(jié)構(gòu)增強子CCAAT盒TATA盒5非翻譯區(qū)3非翻譯區(qū)內(nèi)含子終止子啟動子轉(zhuǎn)錄后具有帽子結(jié)構(gòu)，與核糖體結(jié)合啟動翻譯。與RNA聚合酶結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄5’上游區(qū)3’下游區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)

轉(zhuǎn)錄起始位點（＋1）外顯子復制子：是一段包含復制起始位點（ori）和有關序列在內(nèi)的DNA片段，常見的pMB1、ColEI和pSC101等。選擇標記：抗生素抗性基因嚴緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒

1.DNA的復制復制子和選擇標記原核表達載體的構(gòu)成（1）啟動子（Promoter）定義：是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。

2.轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)啟動子和終止子在一個基因的3’末端或1個操縱子的3’末端往往還有一特定的核苷酸序列，具有終止轉(zhuǎn)錄的功能。（2）轉(zhuǎn)錄終止子（3）翻譯系統(tǒng)（1）核糖體結(jié)合位點：指原核基因轉(zhuǎn)錄起始位點下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（簡稱SD序列）（2）翻譯起始密碼子：位于SD序列下游，通常為AUG（ATG），編碼甲硫氨酸。（3）翻譯終止密碼子

與核糖體相遇時，能使核糖體從mRNA模板上脫落，終止蛋白質(zhì)的翻譯過程。

食品級表達載體

(Food-GradeExpressionVector)篩選標記：采用無毒無害食品級的篩選標記定義：表達載體不得含非食品級的功能性DNA片段

（3）食品級篩選標記基因國內(nèi)外研究的情況篩選標記編碼基因參考文獻蜜二糖發(fā)酵agaLabrieetal.,2005,J.DairySci.蔗糖發(fā)酵scrA/scrBLeenhouts,1998,AEM木糖發(fā)酵xylA,xylB,xylRPosnoetal.,1991,AEMNisin抗性nisI,nsrHughesetal.,1992,J.DairySci.;Takalaetal.,2002,AEM乳桿菌素F免疫lafIAllisonetal.,1996,AEM熱激抗性shspElDemerdashetal.,2003,AEM噬菌體抗性Ads,R/M,AbiO’Sullivanetal.,2001,AEM

本課題選用膽鹽水解酶作為篩選標記的原因？大多數(shù)乳酸菌對膽鹽脅迫敏感，因此膽鹽水解酶可以作為乳酸菌表達載體的篩選標記膽鹽水解酶能夠提高宿主菌株對膽鹽的耐受性，從而提高其在腸道中的存活率膽鹽水解酶可以降低血清中的膽固醇，攜帶膽鹽水解酶活性的菌株具有潛在的益生功效1.3FoodgradevectorconstructionFig.2.BSHactivityanalysis

Transformationefficiencywas4×104CFU/μgCatalaseactivityanalysis1.4Acidstressresponse（1）酸奶對人體具有重要的益生保健功能

更易于人體的消化吸收，且不會導致乳糖不耐癥（2）后酸化問題：酸奶在正常發(fā)酵結(jié)束后的貯存、運輸和

銷售過程中，發(fā)酵微生物的繼續(xù)生長會導致產(chǎn)品pH值

持續(xù)降低，進而發(fā)生后酸化現(xiàn)象。立題依據(jù)1.1酸奶的營養(yǎng)價值及生產(chǎn)中存在的問題（3）保加利亞乳桿菌是導致后酸化的主要原因

保加利亞乳桿菌可以繼續(xù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使酸奶的pH

值下降到3.5左右，從而導致酸奶制品發(fā)生后酸化。國內(nèi)外

酸奶后酸化控制措施的研究進展（1）提高發(fā)酵劑中嗜熱鏈球菌對保加利亞乳桿菌的比例

（Torrianietal.,1996；徐成勇等，2007）（2）添加外源抑菌物質(zhì)控制發(fā)酵后期菌體的生長和產(chǎn)酸

（Bayoumi,1991；曹維強等，2005；鮑盈盈等，2009）（3）選育在低溫條件下產(chǎn)酸微弱的保加利亞乳桿菌

（Ongoletal.,2007）丹麥漢森(Chr.Hansen)公司研發(fā)了弱后酸化保加利亞菌的制備技術，申請了低后酸化乳酸菌專利（CN101472481），弱后酸化發(fā)酵劑（YF-L812、ST-BODY-3、LA-5和BB-46）（1）質(zhì)子泵F0F1-ATPase

（Arikadoetal.,1999）（2）谷氨酸脫羧酶途徑GAD

（Sandersetal.,1998）（3）精氨酸脫氨酶途徑ADI

（Curranetal.,1995;DeAngelisetal.,2002）（4）應激蛋白和分子伴侶蛋白

（Hartkeetal.,1996；Coxetal.,2000）（4）改變細胞膜的脂肪酸構(gòu)成

（CotterandHill,2003）（fromCotterandHill,2003）乳酸菌酸耐受機制的研究進展保加利亞乳桿菌的酸耐受機制的特殊性對保加利亞乳桿菌全基因組序列的分析表明,僅具有F0F1-ATPase基因簇缺失一些存在于其他乳酸菌中的pH調(diào)節(jié)相關的基因，如ADI途徑中的arcA,B,C,T,D,R基因和GAD途徑中的gadC,B基因（vandeGuchteetal.,2006）立題意義進一步揭示保加利亞乳桿菌酸耐受機制；為制備弱后酸化的保加利亞乳桿菌奠定基礎；為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的酸奶發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。細菌單雜交（BacterialOne-Hybrid,B1H）概念：將酵母單雜交系統(tǒng)的篩選標記HIS3和URA3轉(zhuǎn)移到大腸桿菌宿主內(nèi)，通過標記基因的表型檢測，研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(transcriptionfactor,TF)與DNA的相互作用。參考文獻Meng,X.andWolfe,S.A.(2006)IdentifyingDNAsequencesrecognizedbyatranscriptionfactorusingabacterialone-hybridsystem.Nat.Protocol,1,30-45.細菌單雜交原理宿主：E.coliUS0ΔhisB

ΔpyrFbindingsequenceorrandomizedcassettes5-FOAnegativeselection當不含TF時，某些隨機DNA片段可能有啟動子活性，激活HIS3和URA3表達，URA3表達產(chǎn)物能降解5-FOA，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，菌體死亡，因此可去除假陽性干擾。3-ATpositiveselection當TF與bindingsequence正常結(jié)合時，激活HIS3表達，參與合成組氨酸，能夠在組氨酸缺陷培養(yǎng)基中生長，3-AT作為HIS3的競爭性抑制物，提高篩選的準確性。細菌單雜交的應用——預測未知TF的DNA識別位點L.bulgaricusCAUH1中轉(zhuǎn)錄因子Ldb0677的識別位點構(gòu)建隨機DNA片段文庫構(gòu)建攜帶TF-Ldb0677的誘餌載體ldb0677US0SequencingWesternboltDH5a18bprandomizedcassettes18bp5-FOAselection18bpPurifiedPreylibraryn’US03-AT篩選——5-30mM3-AT預測Ldb0677的bindingsite18bpPurifiedPreylibraryUS0+Ldb06773-ATplate3-ATselection3-ATplate隨機挑選單菌落測序MEME分析Putativebindingsequence細菌單雜交的應用——鑒定調(diào)控已知基因轉(zhuǎn)錄的TF鑒定L.bulgaricusCAUH1中調(diào)控pyk基因轉(zhuǎn)錄的TF構(gòu)建L.bulgaricusCAUH1的TF文庫CAUH1TFsUS0“Prey”SequencingWesternblotCAUH1TFlibrary3-AT篩選US0+pH3U3-pyk3-ATplate3-ATselectionCAUH1TFlibrarySequencingpB1H2-TFUS0+pH3U3-pyk3-ATplate3-ATselectionpB1H2CK2.