《進(jìn)出境食品添加劑甲殼素分析方法》編制說明

GB/Txxxx—xxxx《進(jìn)出境食品添加劑甲殼素分析方法》的編制說明一、制標(biāo)依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)2007年出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制（修）訂計劃項目，由中華人民共和國綏芬河出入境檢檢疫局承擔(dān)，中華人民共和國黑龍江出入境檢檢疫局,浙江金殼生物化學(xué)有限公司協(xié)助完成《進(jìn)出境食品添加劑甲殼素分析方法》的科研課題而研究制定的，其計劃編號為20071814-T-424二、 制標(biāo)原則本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1-2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》和GB/T20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：化學(xué)分析方法》的要求編寫的。三、 研究背景甲殼素（chitin,CT）的化學(xué)名稱為（l,4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-0-D-葡聚糖，分子式為（C18H13N05）n,相對分子質(zhì)量（Mr）為1X106?2X106,為白色或灰白色無定形半透明固體,無臭,無味，是一種天然生物高分子化合物，它廣泛存在于生物界，如海蟹、海貝、海龜以及蘑菇類等生物體中。是地球上貯存量第二大有機(jī)化合物，工業(yè)生產(chǎn)甲殼素主要以資源豐富的蝦蟹殼為原料，經(jīng)脫鈣、脫蛋白、脫色等工藝加工而成。甲殼素應(yīng)用廣泛，可作為食品添加劑，國內(nèi)甲殼素年生產(chǎn)量達(dá)1萬噸，80%出口國外，目前尚無甲殼素的國家標(biāo)準(zhǔn)和專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。為了完善國內(nèi)甲殼素（幾丁質(zhì)）衛(wèi)生安全與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，做好甲殼素進(jìn)出境衛(wèi)生安全工作，建立食品添加劑甲殼素分析方法。對于甲殼素中鉛、砷有害元素的測定，有電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（1）和原子吸收分光光度法（2），前者對于多種元素的測定，速度快，效率高，線性范圍寬，干擾?。缓笳邔τ诿糠N元素的測定需要重新選擇分析條件，但對于測定某些痕量元素，具有較低檢出限，設(shè)備簡單、易于普及。在鉛定中采用常用的灰化和微波消化法處理樣品，利用石墨爐原子吸收法測定。砷則采用微波消化法處理樣品，應(yīng)用原子熒光法測定，獲得了滿意的回收率、精密度和檢出限。對于甲殼素中水分、灰分、氮含量的測定，有GB方法參考，但還存在部分條件不適應(yīng)，通過對水分、灰分、氮含量樣品處理條件及測定條件的選擇與優(yōu)化，都能滿足食品添加劑甲殼素的檢測需要。在參考《SC/T3403—2004，甲殼素與殼聚糖》和相關(guān)文獻(xiàn)，引用了酸性可溶物和利用測定游離氨基區(qū)分甲殼素與脫乙酰甲殼素。四、食品添加劑甲殼素技術(shù)指標(biāo)食品添加劑甲殼素的技術(shù)指標(biāo)如表1：表1甲殼素的技術(shù)指標(biāo)指標(biāo)名稱指 標(biāo)性狀白色、灰白色或淡黃色片狀半透明物質(zhì)、或無定形粉末溶解度溶于濃鹽酸、硝酸、硫酸、冰醋酸，不溶于水、稀酸、堿、醇及其他有機(jī)溶劑甲殼素（%）70水分（%）10硫酸鹽灰分（mg/kg）W3.0酸性可溶物（干態(tài),%）20氮含量（干態(tài),%）=6.2?6.9鉛（mg/kg）10砷（mg/kg）2.0

五、食品添加劑甲殼素實驗驗證甲殼素性狀及溶解性對10份甲殼素(食品級)進(jìn)行外觀和溶解性實驗，甲殼素粉末為白色、灰白色或弱帶淡黃色無定形，片狀為半透明物質(zhì)。在濃鹽酸、硝酸、硫酸、冰醋酸可中溶解，但不溶于水、稀酸、堿乙醇與文獻(xiàn)記述相同。甲殼素紅外光譜圖。溴化鉀壓片，甲殼素紅外光譜圖，如圖14000 30W 2000 1500 1OOT SOT.OB05_0波數(shù)/ch圖1甲殼素紅外譜圖在3450cm-1處有強(qiáng)而寬帶吸收峰，表示有締合一OH伸縮振動，在3200cm-1附近處有弱的N—H伸縮振動，在1660cm-i有較強(qiáng)的吸收峰，為C—O的伸縮振動，在1315cm-i和1379cm-1處的吸收峰分別為CH3和CH2的彎曲振動，在950?1100cm-1處有一系列較強(qiáng)吸收峰，為C—O—C的伸縮振動。從譜圖分析中得知：甲殼素與纖維素的不同之處在于甲殼素具有N—H、C=O的伸縮振動和CH的彎曲振動，而C=O的伸縮較普通C=O的伸縮低，因此甲殼素含有酰胺基(-NHCOCH3)的結(jié)構(gòu)。3.水分的測定等同采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.4-2003。直接干燥法測定試樣中的水分是簡便的、經(jīng)典的方法，由于甲殼素粉末比重小，且?guī)в徐o電，在樣品鋁盒上反扣一個直徑稍大的漏斗，可防止空氣流動引起試樣的散失，利用高精度可控恒溫和通風(fēng)裝置的烘箱，烘箱內(nèi)溫度均勻，溫度平衡快，烘至恒重時間短，并能減小水分檢測誤差，稱取2g試樣測定水分如表2.表2?甲殼素水分測定結(jié)果1號2號12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)3.35，3.42，3.38，3.37，3.41，3.37，3.38，3.35，3.40，3.32，3.36，3.353.370.8472.977.52,7.65,7.70，7.67,7.70，7.80，7.71，7.79,7.73，7.78，7.80，7.807.721.083.63續(xù)表2?甲殼素水分測定結(jié)果3號4號12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)3.55，3.54，3.60，3.61，3.55，3.51，3.52，3.55，3.62，3.57，3.56，3.573.560.9513.093.43,3.38，3.41，3.43,3.44,3.40,3.40,3.41,3.38,3.393.400.6732.058

4.灰分的測定等同采用JECFA及FCC方法。甲殼素性質(zhì)穩(wěn)定，應(yīng)用GB/T5009.4難以灰化完全，800°C時測定硫酸鹽灰分，試樣灰化完全，稱取1.5g測定灰分如表3表3?甲殼素硫酸鹽灰分測定結(jié)果1號2號12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)1.99，1.96,2.02，2.03，1.99,2.03，1.96,2.00，1.95，2.00，1.98,1.991.991.334.012.66,2.72,2.71,2.70,2.68,2.65,2.70,2.77,2.66,2.712.701.324.44續(xù)表3?甲殼素硫酸鹽灰分測定結(jié)果3號4號12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(％)12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)0.220,0.221,0.221,0.216,0.215,0.221,0.219,0.224,0.218,0.220,0.214,0.2180.2191.314.570.285,0.280,0.283,0.279,0.274,0.278,0.278,0.279,0.275,0.283,0.278,0.2810.2791.163.945.酸性可溶物的測定等同采用中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SC/T3403-2004。甲殼素不溶于水和稀酸，稱取1.5g樣品測定1%乙酸酸性可溶物如表4表4?甲殼素酸性可溶物測定結(jié)果1號2號12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)2.67,2.76,2.81,2.73,2.77,2.75,2.69,2.69,2.71,2.65,2.79,2.752.731.815.862.76,2.68,2.78,2.59,2.65,2.74,2.75,2.70,2.77,2.75,2.68,2.732.722.087.00續(xù)表4.甲殼素酸性可溶物測定結(jié)果3號4號12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(％)12次結(jié)果(％)均值(%)RSD(%)相對極差(%)3.66,3.46,3.57,3.60,3.53,3.48,3.54,3.62,3.58,3.65,3.62,3.653.581.855.594.12,4.09,4.23,4.11,4.07,4.26,4.20,4.19,4.07,4.10,4.15,4.164.151.524.586.氮含量的測定等同采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T5009.5-2003和中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T0803.9-1999甲殼氮含量測定綜合SN/T0803.9和GB/T5009.5方法的優(yōu)點(diǎn),設(shè)計新型氮含量蒸餾裝置。取0.5g試樣，加入0.2g硫酸銅(CuSO4?5H2O)、5g硫酸鉀、20ml硫酸，稍搖勻，在瓶口放一短頸漏斗，調(diào)節(jié)電爐500W加熱1h,待炭化完全，調(diào)節(jié)電爐700?800W繼續(xù)加熱0.5?1h,取下放冷，加約20ml水，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗燒瓶，洗液并入容量瓶中，加水定容至刻度，連接好蒸餾裝置，移取消化液25ml，加入250ml蒸餾瓶中，取250ml

錐形瓶加入25ml硼酸溶液接入冷凝收集端，并使末端插入硼酸溶液中，從蒸餾器上端加入20ml氫氧化鈉溶液，蓋好蓋子，蒸餾，收集溶液，當(dāng)錐形瓶溶液體積超過100ml,停止蒸餾，以鹽酸溶液滴定至終點(diǎn)，計算氮含量如表5表5?甲殼素氮測定結(jié)果1號2號12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（%）12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（%）6.51，6.60,6.63,6.65，6.60,6.70,6.66,6.68,6.60,6.64,6.65,6.786.640.9864.076.77,6.81,6.81,6.72,6.83,6.79,6.76,6.55,6.53,6.47,6.61,6.576.691.945.39續(xù)表5.甲殼素氮含量測定結(jié)果3號4號12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（％）12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（%）6.54,6.49,6.67,6.76,6.56,6.68,6.72,6.61,6.48,6.53,6.73,6.506.611.544.247.61,7.71,7.79,7.82,7.71,7.43,7.75,7.50,7.77,7.72,7.50,7.527.651.755.10甲殼素含量的測定（游離氨基測定法）等同采用中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SC/T3403-2004。天然甲殼素和甲殼素生產(chǎn)過程中會部分甲殼素未乙酰化，裸露氨基吸咐H+,溶于稀鹽酸,用氫氧化鈉滴定溶液中游離H+和氨基吸咐H+，溶液的電導(dǎo)率經(jīng)過降低、保持不變、升高的過程，出現(xiàn)兩個轉(zhuǎn)折點(diǎn)，兩個轉(zhuǎn)折點(diǎn)之間即為氨基吸咐H+發(fā)生中和反應(yīng)，據(jù)氨基吸咐H+發(fā)生中和反應(yīng)時消耗氫氧化鈉溶液量，計算未乙?；讱に氐暮?，總量中減去未乙?；讱に氐暮繛榧讱に氐暮?。如表6表6.甲殼素含量的測定（游離氨基測定法）結(jié)果1號2號12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（%）12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（%）95.3,94.7,95.1,96.0,97.5,93.4,95.2,95.0,95.2,95.0,94.6,95.895.21.014.3093.6,95.7,94.0,96.7,95.4,95.2,95.1,93.2,94.5,96.1,95.01.163.68鉛的測定（1） 樣品處理方法的選擇甲殼素是0氨基葡萄鏈聚合物，性質(zhì)穩(wěn)定，通常方法難消化完全，經(jīng)研究，選擇了干灰化法和微波高壓消解法，兩者方法比較，結(jié)果列于表7，表7.兩種樣品處理方法的回收率（％）干灰法微波高壓消解法12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（%）12次結(jié)果（％）均值（%）RSD（%）相對極差（%）92,92.1,90.8,101.9,91.8,89.4,88.7,93.7,97.094.04.1814.0102.9,97.9,91.4,104.4,95.2,99.3,95.6,89.8,93.9,91.2,101.3,94.2,96.44.9415.1添加400^g/kg對于干灰化法，稱取1g樣品，于白金坩堝中，加lml水潤濕，攪勻，加蓋稍留縫隙，放入馬弗爐中進(jìn)行程序升溫，加熱消解，完成后，取出，放冷，加lml氫氟酸和lml硝酸，于電熱板上150°C蒸干。殘渣加2ml硝酸溶液（1：1）溶解，靜置lOmin，然后轉(zhuǎn)移到10ml容量瓶中，用水定容至刻度，然后測定。對于微波高壓消解，稱取0.5g，加4ml硝酸、1ml氫氟酸和2ml過氧化氫，放入微波爐中加熱消解，完成后，將消解罐放入趕酸電熱板150C，烘干，加入10ml硝酸溶液（1：9）,超聲溶解2?3min，然后測定。馬弗爐升溫程序：室溫?120C，10min，保持10min，120?320C,10min，保持15min，320?550C，10min，保持3h。溫度控制微波消解程序：600W,（100%）,室溫?100C,10min，保持10min；600W,（100%）,100?150C,10min，保持10min；600W,（100%）,150?180C,10min，保持60min。（2）石墨爐測定條件經(jīng)消化后，應(yīng)用原子吸收光譜儀石墨爐測定鉛的默認(rèn)條件，測試鉛都有較好回收率，而且空白值較低，背景吸收小，干擾因素少，不需要加基體改進(jìn)劑，只是鈣含量較高的樣品影響石墨管的使用壽命，多次使用后靈敏度和重現(xiàn)性降低。（3） 線性范圍和檢出限配制鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液，在儀器最佳工作狀態(tài)下進(jìn)行測定，獲得鉛的線性范圍為0.5卩g/mL，利用空白溶液連續(xù)測定10次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，對鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，計算直線回歸方程，求出曲線的斜率，根據(jù)最低檢出限計算方法，求得各元素最低檢測濃度?；貧w方程：Abs=0.011Conc+0.026相關(guān)系數(shù)：0.999最低檢測濃度：5^g/kg（4） 方法的回收率和室內(nèi)精密度稱取甲殼素樣品0.5g采用微波高壓消解法，定容10mL。測定鉛三個添加水平，每個水平重復(fù)12次實驗，其回收率及精密度見表8。表8。鉛測定室內(nèi)精密度實驗結(jié)果第一添加水平實驗（200^g/kg）第二添加水平實驗（400^g/kg）第三添加水平實驗（800^g/kg）回收率（%）平均回收率（％）RSD(%)回收率（%）平均回收率（％）RSD(%)回收率（%）平均回收率（％）RSD(%)89.9,84.7,102.9,97.9,102.2,96.6,91.3,93.9,91.4,104.4,103.4,99.3,88.6,89.1,90.43.5695.2,99.3,96.44.9494.4,98.1,97.23.7894.2,87.7,95.6,89.8,96.2,95.2,90.4,95.0,93.9,91.2,101.0,92.4,93.3,87.0,101.3,94.2,91.9,96.0,砷的測定（1） 樣品處理方法的選擇對于甲殼素中砷測定，稱取0.5g試樣，加4ml硝酸、1ml氫氟酸和2ml過氧化氫，進(jìn)行微波爐中加熱消解，完成后，將消解罐放入可調(diào)恒溫趕酸電熱板中150C烘干，加入5ml硝酸溶液（1：1）,超聲溶解2?3min,然后轉(zhuǎn)移到25ml容量瓶中，加入2ml硫脲溶液（50g/L）,用硝酸溶液（10%）定容至刻度，超聲混溶5min測定。溫度控制微波消解程序：600W,（100%）,室溫?100C,10min,保持10min；600W,（100%）,100?150C,10min,保持10min；600W,（100%）,150?180C,10min,保持60min。（2） 原子熒光測定條件經(jīng)消化后，應(yīng)用原子熒光測定砷的默認(rèn)條件測試都有較好回收率，干擾因素少，靈敏度高，重現(xiàn)性好。（3） 線性范圍和檢出限配制砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在儀器最佳工作狀態(tài)下進(jìn)行測定，獲得砷的線性范圍為200ng/ml，利用空白溶液連續(xù)測定10