核磁共振氫譜測定羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度

核磁共振氫譜測定羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度摘要】目的建立測定無對照品或者指示劑的羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度的快速、專屬、簡單的核磁共振氫譜方法。方法BrukerAVANCEIII600MHz核磁共振譜儀，在25°C、以重水為溶劑、觀測頻率600.137MHz、譜寬：4200Hz、90度脈沖寬度10.06“、脈沖延遲時間1s、采樣時間3s、高斯增寬因子0、線增寬因子0.2和采樣次數(shù)64次的條件下采集試樣的氫譜。結(jié)果分別對5.3-4.85ppm（葡萄糖環(huán)上的氫）和1.2-1.0ppm（羥丙基上的甲基氫）的積分面積比，測定的重復(fù)性實驗的RSD為0.08%（n=6）。結(jié)論分析結(jié)果表明，在沒有對照品或者指示劑的情況下，核磁共振氫譜法，可以用于羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度的測定和質(zhì)量控制?！娟P(guān)鍵詞】核磁共振羥丙基-倍他-環(huán)糊精取代度【中圖分類號】R965【文獻標識碼】A【文章編號】1672-5085（2013）31-0087-021引言環(huán)糊精（cyclodextrin,CD）是由數(shù)個D-吡喃葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖，環(huán)糊精的最顯著的特征是具有一個腔外親水、腔內(nèi)疏水并且具有一定尺寸的立體手性空腔。B-環(huán)糊精（B-CD）是由七個D-吡喃葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖。目前，B-環(huán)糊精在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如：提高藥物分子的水溶性、穩(wěn)定性等［1,2］。通過安全性試驗證明環(huán)糊精毒性低，口服環(huán)糊精是安全有效的。但B-環(huán)糊精胃腸外給藥有一定毒性，經(jīng)肌肉給藥后能形成潰瘍，靜脈給藥可導(dǎo)致腎臟毒性和溶血作用［3］。為了解決靜脈給藥安全性、提高溶解性，需要對B-環(huán)糊精進行修飾，羥丙基-倍他-環(huán)糊精是B-環(huán)糊精的醚化衍生物［4,5］。HP-B-CD的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，因為，每個B-CD分子中有七個D-吡喃葡萄糖殘基，每個葡萄糖殘基上有三個可被取代的羥基，所以，這樣計算HP-B-CD的平均取代度為0-21。HP-B-CD平均取代度的不同，其各種性能參數(shù)也稍有不同。目前國際上使用HP-B-CD的平均取代度一般為4.0-6.0。目前中國藥典和歐洲藥典中，用于測定HP-B-CD平均取代度的方法有氣相色譜法、容量法及核磁法［6,7］。目前國內(nèi)采用核磁共振方法測定HP-B-CD平均取代度還沒有文獻報道，本研究采用核磁共振氫譜（1H-NMR）方法，建立了一種快速、專屬、簡單，用于無對照品或者指示劑的HP-B-CD平均取代度測定的分析方法。2實驗部分儀器與試劑AVANCEIII600MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）。D2O（（D，99.9%），美國CIL）；三批羥丙基-B-環(huán)糊精（批號：130101、130102、130103；由石藥集團中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司提供）。實驗方法測定溫度：25C；環(huán)境濕度：15RH%；觀測頻率：600.137MHz；譜寬：4200Hz；90度脈沖寬度：10.06“；脈沖延遲時間：1s；采樣時間：3s；采樣次數(shù):64次；高斯增寬因子：0；線增寬因子：0.2。分別準確稱量不同批次羥丙基-倍他-環(huán)糊精10mg置于5mm的核磁共振樣品管中，加入0.6毫升D2O振蕩溶解，制成待測試樣溶液。在上述的實驗條件下，調(diào)整儀器參數(shù)，調(diào)諧、控溫、勻場、采樣，得到1H-NMR譜。在進行相位和基線調(diào)整，以水峰為內(nèi)標，標記為4.75ppm分別對5.3-4.85ppm（葡萄糖環(huán)上氫的化學(xué)位移）和1.2-1.0ppm（羥丙基上甲基的化學(xué)位移）分別進行積分，將得到積分值進行平均取代度的計算[7]。A1：羥丙基上甲基氫的積分面積；A2:葡萄糖環(huán)上氫的積分面積；3結(jié)果與討論3.11H-NMR測定羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）平均取代度方法的建立溶劑及內(nèi)標峰選定固體樣品須配成溶液測試，合適的溶劑粘度小，對樣品溶解性能好，不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或者締合，其譜峰不與樣品峰發(fā)生重疊。因為羥丙基-倍他-環(huán)糊精的水溶解性好，所以采用水作為溶劑，羥丙基-倍他-環(huán)糊精的1H-NMR譜見圖2。內(nèi)標物質(zhì)應(yīng)該具有較高的純度和準確的含量，不與樣品和溶劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或締合，能溶于NMR溶劑，含有多個質(zhì)子，具有易于識別的譜峰，最好有尖銳單峰[8]；本實驗選取水峰作為內(nèi)標峰，其化學(xué)位移定為4.75ppm，避免外加入的內(nèi)標物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響。采集時間的選擇足夠的采樣時間可以保證只有感應(yīng)衰減信號能衰減完全，得到基底沒有振蕩的相應(yīng)譜峰，從而提高分辨率[9]。以不同的采集時間采集圖譜，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)采樣時間大于2.4秒自由感應(yīng)衰減完全。因此，實驗可選取采樣時間等于3秒。脈沖延遲時間的選擇弛豫過程是核磁共振現(xiàn)象發(fā)生后得以保持的必要條件。因此，實驗中應(yīng)選取合適的脈沖延遲時間，保證譜峰強度不會被飽和，這樣有利于對譜峰進行正確的積分，得到準確的結(jié)果，在實驗中，按照脈沖從短（0.03秒）到長（3秒）分別采樣，然后對定量峰進行積分，其峰面積比A1/A2隨脈沖延遲時間的變化如表2所示：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.5秒之前，隨著脈沖延遲時間的增大，A1/A2增大；在脈沖延遲時間大于0.5秒后，A1/A2沒有明顯的變化，因此實驗選取脈沖延遲時間是1秒。3.1.4重復(fù)性實驗按2.2節(jié)的實驗方法，以20130101批次羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）樣品，在同一實驗條件下，連續(xù)做6個1H-NMR，并以A1/A2峰面積比計算考察實驗的重復(fù)性，結(jié)果見表2。計算得到其相對標準偏差RSD=0.08%（n=6），表明實驗的重復(fù)性較好。3.2羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）平均取代度結(jié)果取羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）（批號：20130101,、20130102、20130103），按照2.2節(jié)的實驗方法，在同一條件下做1H-NMR圖譜，通過公式計算得到20130101、2013010220130103批次的平均取代度分別為：4.84,4.81,4.87。實驗結(jié)果表明，利用核磁共振方法測定羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度專屬性較好，重復(fù)性較好，能夠快速測定，對操作人員無人身危害等優(yōu)點。參考文獻:DucheneD[M].Newtrendsincyclodextrinsandderivatives,EditionsdeSante,1991:11?18.UekamaK.PharmaceuticalapplicationsofmethylatedcyclodextrinsJ.Pharm.Int.,1985,6:61?65.高申[M]?現(xiàn)代藥物-新劑型新技術(shù)?北京：人民軍醫(yī)出版社,2002:35?40.BrewsterME,HoraMS,SimpkinsJW,etal.Useof2-hydroxypropyW-cyclodextrinasasolubilizingandstabilizingexcipientforproteindrugsJ.Pharm.Res,1991,8:792?795.袁超,金征宇.羥丙基環(huán)糊精性質(zhì).應(yīng)用及前景展望[J].糧食與油脂,2009,1:4?6.ChinesePharmacopoeia,2005,VII-F-48.EP7.301/2009:1804.胡敏,胡昌勤，劉文英.核磁共振氫譜內(nèi)標法測定茚地普隆的含量[J].分析化學(xué),2004,32（4）:451?455.KeelerJ[M].UnderstandingNMRspectros