第12章 免疫組織化學技術

臨床免疫學檢驗技術第十二章

免疫組織化學技術歐啟水目錄第一節(jié)酶免疫組織化學技術第二節(jié)熒光免疫組織化學技術第三節(jié)親和組織化學技術第四節(jié)免疫標記電鏡技術第五節(jié)免疫組織化學技術的臨床應用第六節(jié)影響免疫組織化學技術的主要因素免疫組織化學技術（immunohistochemistrytechnique）又稱免疫細胞化學技術，是指用標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項免疫檢測方法。根據標記物的不同，免疫組織化學技術可分為：酶免疫組織化學技術熒光免疫組織化學技術免疫金（銀）組織化學技術親和組織化學技術免疫標記電鏡組織化學技術免疫組織化學的基本過程包括：抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化將標記物與抗體結合形成標記抗體標本的處理與制備抗原抗體免疫學反應以及標記物呈色反應觀察結果第一節(jié)酶免疫組織化學技術定義：在一定條件下，應用酶標抗體（抗原）與組織或細胞標本中的抗原（抗體）發(fā)生反應，催化底物產生顯色反應，通過顯微鏡觀察標本中抗原（抗體)的分布位置和性質，也可通過圖像分析技術達到定量的目的。標本類型：有組織切片、組織印片和細胞涂片等。酶免疫組化技術可分為酶標記抗體免疫組化技術和非標記抗體酶免疫組化技術兩種類型。直接法：將酶直接標記在特異性抗體上，與組織細胞內相應的抗原進行特異性反應，形成抗原-抗體-酶復合物，最后用酶底物顯色。間接法：將酶標記在第二抗體上，先將第一抗體（特異性抗體）與相應的組織抗原結合，形成抗原抗體復合物，再用第二抗體（酶標記的抗體）與復合物中的特異性抗體結合，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，最后用底物顯色劑顯色。酶標記抗體免疫組織化學染色直接法間接法優(yōu)點操作簡便特異性強檢測敏感性高制備一種酶標二抗可用于檢測多種抗原或抗體缺點敏感性低制備的抗體種類有限特異性不如直接法操作較為繁瑣酶標記抗體免疫組織化學染色比較酶橋法：抗酶抗體作為第三抗體，通過橋抗體（第二抗體），將特異性識別組織抗原的第一抗體與第三抗體連接起來，形成酶聯(lián)的抗原-抗體復合物，加底物顯色（圖12-1）。非標記抗體酶免疫組織化學染色酶橋法圖12-1酶免疫組織化學（酶橋法）原理示意圖過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）法：是在酶橋法基礎上加以改良。PAP法首先將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶組成可溶性復合物（PAP復合物，圖12-2）。該復合物由2個抗酶抗體和3個過氧化物酶分子組成，呈五角形結構，非常穩(wěn)定。通過橋抗體（第二抗體），將特異性識別組織抗原的第一抗體與PAP復合物的抗酶抗體連接起來，此時要求特異性第一抗體與第三抗體的動物種屬相同（圖12-3）。非標記抗體酶免疫組織化學染色PAP法圖12-2PAP復合物圖12-3酶免疫組織化學（PAP法）原理示意圖雙橋PAP法：該法建立在PAP法的基礎上。其基本原理是在PAP法中通過兩次連接橋抗體和PAP復合物而建立起來的，通過雙橋可結合更多的PAP復合物于抗原分子上，以增強敏感性。堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（APAAP）法：用堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)—抗堿性磷酸酶(AAP)法，即簡稱APAAP。其技術要點與PAP法相似。非標記抗體酶免疫組織化學染色酶免疫組織化學染色中的常用酶及顯色底物：酶底物顏色辣根過氧化物酶（HRP）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘紅色4-氯-1-萘酚灰藍色堿性磷酸酶（AP）α-萘酚磷酸鹽+快藍深藍色α-萘酚磷酸鹽+快紅紅色溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP）+氮藍四唑（NBT）紫藍色第二節(jié)熒光免疫組織化學技術采用熒光素標記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，可以分辨出抗原（或抗體）所在位置及性質，并可利用熒光定量技術計算其含量，以實現(xiàn)抗原（或抗體）定位、定性和定量測定的目的。定義標本類型：涂片和印片組織切片：冷凍切片；石蠟切片細胞培養(yǎng)標本活細胞染色標本的保存：標本在固定干燥后，最好立即進行熒光抗體染色及鏡檢。如必須保存時，則應保持干燥，置4℃以下保存。但病毒和某些組織抗原標本抗原性喪失很快，數天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。組織處理常用于熒光免疫組織化學技術的熒光素包括異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,

FITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）等。熒光抗體的標記及純化詳見第四章。根據染色方法的不同，熒光免疫組織化學技術可區(qū)分為直接法和間接法。熒光抗體染色的結果一般用“-”或“+”表示。染色及結果判讀詳見第八章。熒光抗體的標記及染色第三節(jié)親和組織化學技術一些具有雙價或多價結合力的物質如植物凝集素(lectin)、生物素（biotin）和葡萄球菌A蛋白（staphylococcalprotein，SPA）等，對某種組織成分具有高親和力的特點，可以與標記物如熒光素、酶、同位素、鐵蛋白及膠體金等結合，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應、放射自顯影或電子顯微鏡，在細胞或亞細胞水平進行對應親和物質的定位、定性或定量分析。定義生物素-親合素法葡萄球菌蛋白A法凝集素法鏈霉親合素-生物素法親和組織化學技術親合素-生物素-過氧化酶復合物技術(avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，ABC)

：按一定比例將親合素與酶標生物素結合．形成可溶性親合素-生物素－過氧化物酶復合物（ABC）。當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法，圖12-4）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時，ABC中末飽和的親合素結合部位即可與抗體上的生物素結合，使抗原抗體反應體系與ABC標記體系連成一體進行檢測。生物素-親合素法ABC直接法圖12-4親和組織化學（ABC直接法）原理示意圖橋聯(lián)親合素-生物素技術(bridgedavidin-biotintechnique，BRAB)：該技術不同于ABC法，是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價性，將檢測反應體系中抗原、生物素化抗體復合物與標記生物素（如酶標生物素）聯(lián)結起來，達到檢測反應分子的目的。生物素-親合素法標記生物素-抗生物素技術(labelledavidin-biotintechnique，LAB)：以標記親合素直接與免疫復合物中的生物素化抗體連接進行檢測。該法具有相當高的靈敏度，由于省略了加標記生物素步驟，操作較BRAB法簡便。間接LAB法采用的是生物素化的第二抗體，可以進一步提高檢測靈敏度。生物素-親合素法根據SPA能與多種動物IgG的Fc段結合的原理，用SPA標記物（酶、熒光素、放射性物質等）顯示抗原與抗體結合反應的免疫檢測實驗。SPA具有和人及多種動物如豚鼠、兔、豬、犬、小鼠、猴等IgG結合的能力，可解決不同動物樣本檢測時，需分別標記相對應的二抗的問題。SPA結合部位是Fc段，這種結合不會影響抗體的活性。葡萄球菌蛋白A法

凝集素（lectin）可采用直接法和間接法進行細胞化學染色。直接法：將標記物直接結合在凝集素上，使其與組織細胞相應的糖蛋白或糖脂相結合。間接法：先將凝集素與組織細胞膜糖基結合，然后再用標記的抗凝集素抗體（即用凝集素免疫動物制備抗凝集素抗體）與結合在細胞上的凝集素反應。凝集素法

鏈霉親合素(streptavidin，SA)是從鏈霉菌培養(yǎng)物提取的一種純蛋白，不含糖基，有4個生物素結合位點，并且具有高度的親和力，其功能類似親和素。利用生物素結合的二抗與酶標記的鏈霉親和素蛋白就構成了酶標鏈霉親合素-生物素方法(labelledstreptavidinbiotintechnique，LSAB)。鏈霉親合素-生物素法

第四節(jié)免疫標記電鏡技術

利用高電子密度的顆粒性標記物（如膠體金、鐵蛋白等）標記抗體，或用經免疫組織/細胞化學反應能產生高電子密度產物者如HRP標記抗體，在電子顯微鏡下對抗原抗體反應中的高電子密度標記的抗原（抗體）進行亞細胞水平定位的技術。相較于其他免疫組織化學技術是在光鏡下進行抗原定位，免疫標記電鏡技術在電子顯微鏡下的定位更為精確，可定位至細胞膜、細胞器，在探索病因、發(fā)病機制、組織發(fā)生等方面有其獨特的優(yōu)點。原理

在組織固定與取材時選用固定劑不宜過強，在取材方面，免疫電鏡技術較光鏡免疫化學技術要求更迅速、更精細。在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片染色三種。免疫標記電鏡技術標本制備要求

免疫膠體金染色法免疫膠體鐵細胞化學染色法酶免疫電鏡技術常用的免疫標記電鏡技術

第五節(jié)免疫組織化學技術的臨床應用

熒光免疫組織化學技術的應用：1.在自身免疫性疾病中的應用2.細菌和病毒的快速鑒定3.寄生蟲的檢測與研究酶免疫組織化學技術的應用：1.提高病理診斷準確性2.癌基因蛋白的臨床應用3.對腫瘤細胞增生程度的評價4.發(fā)現(xiàn)微小轉移灶5.在腫瘤分期上的意義6.指導腫瘤的治療免疫組織化學技術的臨床應用

（一）熒光激活細胞分類儀（FACS）（二）共聚焦顯微鏡技術（三）免疫組織化學—顯微切割技術免疫組織化學技術的拓展

第六節(jié)影響免疫組織化學技術的主要因素

標本的處理

標本的主要來源各種體液及穿刺液活體組織培養(yǎng)細胞標本固定的目的：使細胞內蛋白質凝固，細胞內分解酶反應終止，以防止細胞自溶，保持細胞形態(tài)和結構。保存組織細胞抗原性。防止標本脫落。除去妨礙抗體結合的類脂，便于保存。抑制組織中細菌的繁殖，防止組織腐敗和在后續(xù)組織制備中的細胞結構和成分的改變。標本的固定與保存

固定劑的選擇:蛋白質類抗原，可用乙醇或甲醇固定。微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定。如需除去病毒的蛋白質外殼，可使用胰蛋白酶。多糖類抗原用10%福爾馬林固定或以微火加熱固定。如有粘液物質存在，應用透明質酸酶等處理除去。類脂質豐富的組織進行蛋白、多糖抗原檢測時，需用有機溶劑（乙醚、丙酮等）處理除去類脂。標本的固定與保存

制片方法的評價：冰凍和石蠟切片是免疫組化最常用的制片方法。為了使抗原達到最大限度的保存，首選的制片方法是冰凍切片。其操作簡便，可避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等對抗原所造成的損失，適用于不穩(wěn)定的抗原。石蠟切片是研究形態(tài)學的主要制片方法，它不但是觀察組織細胞結構的理想方法，而且可用在陳舊石蠟包埋材料免疫組化的回顧性研究。切片薄而有連續(xù)性，可長期保存，但對抗原的保存不如冰凍切片。標本的固定與保存

抗原的保存與修復

酶消化法

常用的抗原暴露、修復方法

鹽酸水解法

微波法

高壓鍋法煮沸法抗體的選擇：應注意選擇具有高度特異和穩(wěn)定的抗體，根據需要決定采用單克隆或多克隆抗體?？贵w的稀釋：抗原抗體反應要求有合適的比例，過量或不足均不能達到預期結果。抗體的保存：在保存抗體時，要特別注意保持抗體的生物活性，防止抗體蛋白質變性?？贵w的處理與保存

對照的設立：陽性對照。陰性對照。其他：空白、替代、吸收或阻斷試驗均為確證試驗。陽性結果：陽性細胞的顯色可位于細胞質、細胞核和細胞膜表面。免疫組織化學的呈色深淺可反映抗原存在的數量，可作為定性、定位和定量的依據。陽性細胞可呈散在、灶性和彌漫性分布。免疫組化的結果判斷陰性結果及抗原不表達：陰性結果不能簡單地認為具有否定意義，因為陽性表達有強弱、多少之分，哪怕只有少數細胞陽性（只要是在抗原所在部位）也應視為陽性表達。特異性和非特異性顯色的鑒別：根據分布位置和顯色強度等進行鑒別。免疫組化結果與HE切片結果：當免疫組化檢查結果與HE切片診斷不一致時，應綜合分析，不能簡單地用免疫組化結果推翻HE切片診斷。免疫組化的結果判斷試劑質量控制：抗體的質量；合適的稀釋度、稀釋劑、孵育溫度和孵育時間等。操作過程質量控制：包括實驗操作和標本的質量控制。技術設備、儀器和器具的質量控制：需定期對相關設備、儀器（含基本實驗液體）和器具進行校準。操作相關工具如吸管、試管、加樣槍等需進行消毒。質量控制重點提示免疫組織化學技術的定義、種類及