第12章 免疫組織化學(xué)技術(shù)

臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第十二章

免疫組織化學(xué)技術(shù)歐啟水目錄第一節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)第二節(jié)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)第三節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)第四節(jié)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)第五節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用第六節(jié)影響免疫組織化學(xué)技術(shù)的主要因素免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistrytechnique）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫組織化學(xué)技術(shù)可分為：酶免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫金（銀）組織化學(xué)技術(shù)親和組織化學(xué)技術(shù)免疫標(biāo)記電鏡組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)的基本過(guò)程包括：抗原的提取與純化免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化將標(biāo)記物與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體標(biāo)本的處理與制備抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)以及標(biāo)記物呈色反應(yīng)觀察結(jié)果第一節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)定義：在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過(guò)顯微鏡觀察標(biāo)本中抗原（抗體)的分布位置和性質(zhì)，也可通過(guò)圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。標(biāo)本類型：有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片等。酶免疫組化技術(shù)可分為酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)和非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)兩種類型。直接法：將酶直接標(biāo)記在特異性抗體上，與組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原進(jìn)行特異性反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后用酶底物顯色。間接法：將酶標(biāo)記在第二抗體上，先將第一抗體（特異性抗體）與相應(yīng)的組織抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用第二抗體（酶標(biāo)記的抗體）與復(fù)合物中的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色直接法間接法優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便特異性強(qiáng)檢測(cè)敏感性高制備一種酶標(biāo)二抗可用于檢測(cè)多種抗原或抗體缺點(diǎn)敏感性低制備的抗體種類有限特異性不如直接法操作較為繁瑣酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色比較酶橋法：抗酶抗體作為第三抗體，通過(guò)橋抗體（第二抗體），將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體與第三抗體連接起來(lái)，形成酶聯(lián)的抗原-抗體復(fù)合物，加底物顯色（圖12-1）。非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色酶橋法圖12-1酶免疫組織化學(xué)（酶橋法）原理示意圖過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶（PAP）法：是在酶橋法基礎(chǔ)上加以改良。PAP法首先將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶組成可溶性復(fù)合物（PAP復(fù)合物，圖12-2）。該復(fù)合物由2個(gè)抗酶抗體和3個(gè)過(guò)氧化物酶分子組成，呈五角形結(jié)構(gòu)，非常穩(wěn)定。通過(guò)橋抗體（第二抗體），將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來(lái)，此時(shí)要求特異性第一抗體與第三抗體的動(dòng)物種屬相同（圖12-3）。非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色PAP法圖12-2PAP復(fù)合物圖12-3酶免疫組織化學(xué)（PAP法）原理示意圖雙橋PAP法：該法建立在PAP法的基礎(chǔ)上。其基本原理是在PAP法中通過(guò)兩次連接橋抗體和PAP復(fù)合物而建立起來(lái)的，通過(guò)雙橋可結(jié)合更多的PAP復(fù)合物于抗原分子上，以增強(qiáng)敏感性。堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（APAAP）法：用堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)—抗堿性磷酸酶(AAP)法，即簡(jiǎn)稱APAAP。其技術(shù)要點(diǎn)與PAP法相似。非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色酶免疫組織化學(xué)染色中的常用酶及顯色底物：酶底物顏色辣根過(guò)氧化物酶（HRP）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘紅色4-氯-1-萘酚灰藍(lán)色堿性磷酸酶（AP）α-萘酚磷酸鹽+快藍(lán)深藍(lán)色α-萘酚磷酸鹽+快紅紅色溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP）+氮藍(lán)四唑（NBT）紫藍(lán)色第二節(jié)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復(fù)合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，可以分辨出抗原（或抗體）所在位置及性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算其含量，以實(shí)現(xiàn)抗原（或抗體）定位、定性和定量測(cè)定的目的。定義標(biāo)本類型：涂片和印片組織切片：冷凍切片；石蠟切片細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本活細(xì)胞染色標(biāo)本的保存：標(biāo)本在固定干燥后，最好立即進(jìn)行熒光抗體染色及鏡檢。如必須保存時(shí)，則應(yīng)保持干燥，置4℃以下保存。但病毒和某些組織抗原標(biāo)本抗原性喪失很快，數(shù)天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。組織處理常用于熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)的熒光素包括異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,

FITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）等。熒光抗體的標(biāo)記及純化詳見(jiàn)第四章。根據(jù)染色方法的不同，熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)可區(qū)分為直接法和間接法。熒光抗體染色的結(jié)果一般用“-”或“+”表示。染色及結(jié)果判讀詳見(jiàn)第八章。熒光抗體的標(biāo)記及染色第三節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如植物凝集素(lectin)、生物素（biotin）和葡萄球菌A蛋白（staphylococcalprotein，SPA）等，對(duì)某種組織成分具有高親和力的特點(diǎn)，可以與標(biāo)記物如熒光素、酶、同位素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)、放射自顯影或電子顯微鏡，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性或定量分析。定義生物素-親合素法葡萄球菌蛋白A法凝集素法鏈霉親合素-生物素法親和組織化學(xué)技術(shù)親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)(avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，ABC)

：按一定比例將親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合．形成可溶性親合素-生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）。當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法，圖12-4）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC中末飽和的親合素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原抗體反應(yīng)體系與ABC標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測(cè)。生物素-親合素法ABC直接法圖12-4親和組織化學(xué)（ABC直接法）原理示意圖橋聯(lián)親合素-生物素技術(shù)(bridgedavidin-biotintechnique，BRAB)：該技術(shù)不同于ABC法，是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價(jià)性，將檢測(cè)反應(yīng)體系中抗原、生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素（如酶標(biāo)生物素）聯(lián)結(jié)起來(lái)，達(dá)到檢測(cè)反應(yīng)分子的目的。生物素-親合素法標(biāo)記生物素-抗生物素技術(shù)(labelledavidin-biotintechnique，LAB)：以標(biāo)記親合素直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗體連接進(jìn)行檢測(cè)。該法具有相當(dāng)高的靈敏度，由于省略了加標(biāo)記生物素步驟，操作較BRAB法簡(jiǎn)便。間接LAB法采用的是生物素化的第二抗體，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。生物素-親合素法根據(jù)SPA能與多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合的原理，用SPA標(biāo)記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。SPA具有和人及多種動(dòng)物如豚鼠、兔、豬、犬、小鼠、猴等IgG結(jié)合的能力，可解決不同動(dòng)物樣本檢測(cè)時(shí)，需分別標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的二抗的問(wèn)題。SPA結(jié)合部位是Fc段，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。葡萄球菌蛋白A法

凝集素（lectin）可采用直接法和間接法進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色。直接法：將標(biāo)記物直接結(jié)合在凝集素上，使其與組織細(xì)胞相應(yīng)的糖蛋白或糖脂相結(jié)合。間接法：先將凝集素與組織細(xì)胞膜糖基結(jié)合，然后再用標(biāo)記的抗凝集素抗體（即用凝集素免疫動(dòng)物制備抗凝集素抗體）與結(jié)合在細(xì)胞上的凝集素反應(yīng)。凝集素法

鏈霉親合素(streptavidin，SA)是從鏈霉菌培養(yǎng)物提取的一種純蛋白，不含糖基，有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，并且具有高度的親和力，其功能類似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白就構(gòu)成了酶標(biāo)鏈霉親合素-生物素方法(labelledstreptavidinbiotintechnique，LSAB)。鏈霉親合素-生物素法

第四節(jié)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)

利用高電子密度的顆粒性標(biāo)記物（如膠體金、鐵蛋白等）標(biāo)記抗體，或用經(jīng)免疫組織/細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)能產(chǎn)生高電子密度產(chǎn)物者如HRP標(biāo)記抗體，在電子顯微鏡下對(duì)抗原抗體反應(yīng)中的高電子密度標(biāo)記的抗原（抗體）進(jìn)行亞細(xì)胞水平定位的技術(shù)。相較于其他免疫組織化學(xué)技術(shù)是在光鏡下進(jìn)行抗原定位，免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)在電子顯微鏡下的定位更為精確，可定位至細(xì)胞膜、細(xì)胞器，在探索病因、發(fā)病機(jī)制、組織發(fā)生等方面有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。原理

在組織固定與取材時(shí)選用固定劑不宜過(guò)強(qiáng)，在取材方面，免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學(xué)技術(shù)要求更迅速、更精細(xì)。在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片染色三種。免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)標(biāo)本制備要求

免疫膠體金染色法免疫膠體鐵細(xì)胞化學(xué)染色法酶免疫電鏡技術(shù)常用的免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)

第五節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用

熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用：1.在自身免疫性疾病中的應(yīng)用2.細(xì)菌和病毒的快速鑒定3.寄生蟲的檢測(cè)與研究酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用：1.提高病理診斷準(zhǔn)確性2.癌基因蛋白的臨床應(yīng)用3.對(duì)腫瘤細(xì)胞增生程度的評(píng)價(jià)4.發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶5.在腫瘤分期上的意義6.指導(dǎo)腫瘤的治療免疫組織化學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用

（一）熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）（二）共聚焦顯微鏡技術(shù)（三）免疫組織化學(xué)—顯微切割技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)的拓展

第六節(jié)影響免疫組織化學(xué)技術(shù)的主要因素

標(biāo)本的處理

標(biāo)本的主要來(lái)源各種體液及穿刺液活體組織培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本固定的目的：使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，細(xì)胞內(nèi)分解酶反應(yīng)終止，以防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。保存組織細(xì)胞抗原性。防止標(biāo)本脫落。除去妨礙抗體結(jié)合的類脂，便于保存。抑制組織中細(xì)菌的繁殖，防止組織腐敗和在后續(xù)組織制備中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分的改變。標(biāo)本的固定與保存

固定劑的選擇:蛋白質(zhì)類抗原，可用乙醇或甲醇固定。微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定。如需除去病毒的蛋白質(zhì)外殼，可使用胰蛋白酶。多糖類抗原用10%福爾馬林固定或以微火加熱固定。如有粘液物質(zhì)存在，應(yīng)用透明質(zhì)酸酶等處理除去。類脂質(zhì)豐富的組織進(jìn)行蛋白、多糖抗原檢測(cè)時(shí)，需用有機(jī)溶劑（乙醚、丙酮等）處理除去類脂。標(biāo)本的固定與保存

制片方法的評(píng)價(jià)：冰凍和石蠟切片是免疫組化最常用的制片方法。為了使抗原達(dá)到最大限度的保存，首選的制片方法是冰凍切片。其操作簡(jiǎn)便，可避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等對(duì)抗原所造成的損失，適用于不穩(wěn)定的抗原。石蠟切片是研究形態(tài)學(xué)的主要制片方法，它不但是觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法，而且可用在陳舊石蠟包埋材料免疫組化的回顧性研究。切片薄而有連續(xù)性，可長(zhǎng)期保存，但對(duì)抗原的保存不如冰凍切片。標(biāo)本的固定與保存

抗原的保存與修復(fù)

酶消化法

常用的抗原暴露、修復(fù)方法

鹽酸水解法

微波法

高壓鍋法煮沸法抗體的選擇：應(yīng)注意選擇具有高度特異和穩(wěn)定的抗體，根據(jù)需要決定采用單克隆或多克隆抗體?？贵w的稀釋：抗原抗體反應(yīng)要求有合適的比例，過(guò)量或不足均不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果。抗體的保存：在保存抗體時(shí)，要特別注意保持抗體的生物活性，防止抗體蛋白質(zhì)變性。抗體的處理與保存

對(duì)照的設(shè)立：陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照。其他：空白、替代、吸收或阻斷試驗(yàn)均為確證試驗(yàn)。陽(yáng)性結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞的顯色可位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜表面。免疫組織化學(xué)的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。陽(yáng)性細(xì)胞可呈散在、灶性和彌漫性分布。免疫組化的結(jié)果判斷陰性結(jié)果及抗原不表達(dá)：陰性結(jié)果不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為具有否定意義，因?yàn)殛?yáng)性表達(dá)有強(qiáng)弱、多少之分，哪怕只有少數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性（只要是在抗原所在部位）也應(yīng)視為陽(yáng)性表達(dá)。特異性和非特異性顯色的鑒別：根據(jù)分布位置和顯色強(qiáng)度等進(jìn)行鑒別。免疫組化結(jié)果與HE切片結(jié)果：當(dāng)免疫組化檢查結(jié)果與HE切片診斷不一致時(shí)，應(yīng)綜合分析，不能簡(jiǎn)單地用免疫組化結(jié)果推翻HE切片診斷。免疫組化的結(jié)果判斷試劑質(zhì)量控制：抗體的質(zhì)量；合適的稀釋度、稀釋劑、孵育溫度和孵育時(shí)間等。操作過(guò)程質(zhì)量控制：包括實(shí)驗(yàn)操作和標(biāo)本的質(zhì)量控制。技術(shù)設(shè)備、儀器和器具的質(zhì)量控制：需定期對(duì)相關(guān)設(shè)備、儀器（含基本實(shí)驗(yàn)液體）和器具進(jìn)行校準(zhǔn)。操作相關(guān)工具如吸管、試管、加樣槍等需進(jìn)行消毒。質(zhì)量控制重點(diǎn)提示免疫組織化學(xué)技術(shù)的定義、種類及