實(shí)驗(yàn)一特殊顯微鏡的使用

實(shí)驗(yàn)一特殊顯微鏡的使用第一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日第二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡第四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1暗視野顯微鏡根據(jù)丁達(dá)爾效應(yīng)原理設(shè)計(jì)的一種在黑色背景條件下觀察被檢物體的顯微鏡觀察到明場(chǎng)看不到的極其微小的物體最高分辨率可達(dá)0.004微米第五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1.1原理丁達(dá)爾現(xiàn)象：在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微?；覊m是不易被看見(jiàn)的，但在暗的房間中若有一束光線從門(mén)縫斜射進(jìn)來(lái)，灰塵便粒?？梢?jiàn)了，這就是微粒發(fā)光。暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設(shè)計(jì)的。1.2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個(gè)視野是黑暗的。第六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日暗場(chǎng)顯微鏡原理第七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日第八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1.3成像特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時(shí)，并大于1／2波長(zhǎng)，則各級(jí)衍射光線同時(shí)進(jìn)入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運(yùn)動(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等。第九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1.4應(yīng)用：微小粒子、細(xì)菌形態(tài)、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本觀察等。1.5暗場(chǎng)顯微鏡的要求要求載玻片和蓋玻片必須無(wú)疵痕和灰塵物鏡前透鏡必須清潔無(wú)塵載玻片和蓋玻片厚度必須絕對(duì)符合要求第十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日1.6暗場(chǎng)觀察方式調(diào)節(jié)(1)換上暗場(chǎng)聚光鏡（干燥系或油浸系）并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭油。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場(chǎng)光闌適當(dāng)縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時(shí)在視場(chǎng)中看到視場(chǎng)光圈的輪廓象。上下緩慢調(diào)整聚光鏡，使視場(chǎng)光圈像清晰可見(jiàn)。(3)視場(chǎng)光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側(cè)兩個(gè)調(diào)節(jié)螺絲進(jìn)行調(diào)整，再將其開(kāi)大到相應(yīng)位置。第十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日二、熒光顯微鏡一、原理熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。第十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日

什么是熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光第十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日熒光的種類(lèi)：自發(fā)熒光（固有熒光）二次熒光第十四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日熒光的性質(zhì)：吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)（損失熱能）熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率第十五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日二、熒光顯微鏡的種類(lèi)：透射式落射式第十六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日第十七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日第十八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日三、熒光顯微鏡主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場(chǎng)聚光鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡第十九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)造第二十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日落射熒光顯微鏡光路圖第二十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日透射熒光顯微鏡光路圖第二十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日

WU

WIBDUALBANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察第二十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長(zhǎng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過(guò)照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)熒光。熒光具有專(zhuān)一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專(zhuān)一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專(zhuān)一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。第二十四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日四、使用方法．1．打開(kāi)燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。3．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；第二十五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日4．高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi)，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。第二十六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日五、用途1觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)2標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類(lèi)物質(zhì)（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。第二十七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA含量測(cè)定。4熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗），用該標(biāo)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測(cè)該抗原的存在與分布。第二十八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日三、試劑與器材魚(yú)、草履蟲(chóng)、甲醇、5‰丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡第二十九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟魚(yú)血細(xì)胞染色觀察：取少許魚(yú)血→常規(guī)血涂片→涼干→甲醇固定10min→5‰

丫啶橙染色5min→水洗→室溫干燥（濾紙擦干玻片底面）→熒光顯微鏡觀察（先低倍后高倍觀察）（可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細(xì)胞）取洋蔥→撕取一小片內(nèi)表皮→平面單層鋪展于玻片上→室溫涼干→1‰丫啶橙染色5min→水洗（用吸管，小心掉片）→室溫干燥（或用濾紙擦干）→熒光顯微鏡觀察第三十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3相差顯微鏡3.1原理光波有振幅（亮度）、波長(zhǎng)（顏色）及相位(指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置)的不同。當(dāng)光通過(guò)物體時(shí)，如波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標(biāo)本的道理。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無(wú)法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。第三十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。3.2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相位板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸調(diào)節(jié)用的望遠(yuǎn)鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。第三十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡是用來(lái)進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時(shí)，聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合（共軛重合），才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。第三十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日3.3使用方法（1）相差裝置的調(diào)換安裝卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍(lán)色光，使波長(zhǎng)范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再?gòu)霓D(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。

（2）調(diào)焦打開(kāi)光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤(pán)，將“0”對(duì)準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進(jìn)入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進(jìn)行對(duì)光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡為40X時(shí)應(yīng)用40X標(biāo)示孔的光闌。第三十四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日（3）合鈾調(diào)整拔出目鏡，插入合軸望遠(yuǎn)鏡，一邊從望遠(yuǎn)鏡向內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其上升，當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時(shí)可將望遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。（4）觀察換回目鏡，按