實驗三藥物敏感試驗和消毒滅菌

實驗三藥物敏感試驗和消毒滅菌第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日實驗內(nèi)容和要求1.掌握藥敏試驗的原理、步驟、結(jié)果及意義2.掌握常用的消毒與滅菌技術(shù)3.熟悉紫外線殺菌試驗的原理4.了解細(xì)菌L型的誘導(dǎo)和菌落類型第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日一、藥敏試驗在感染性疾病防治中的意義

近年來，由于各種抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥菌株的迅速增多。尤其是廣譜及超廣譜抗生素的普遍使用，造成耐藥菌株大量出現(xiàn)，給臨床治療帶來極大的困難。同時，由于不合理的使用抗生素，治療的失敗率及不良反應(yīng)均有增加。因此，藥敏試驗在感染性疾病的防治方面具有日益重要的實際意義。3第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日二.培養(yǎng)+藥敏的目的

1、確定導(dǎo)致感染的病原菌的種類，對于不同的病原菌（G-桿菌或G+球菌，條件致病菌或急性傳染病病原菌）需要采取不同的治療措施。

2、確定病原菌對各種抗生素的敏感性，指導(dǎo)臨床根據(jù)病人情況合理用藥。由于細(xì)菌耐藥性的快速增長，單純依賴經(jīng)驗選用藥物經(jīng)常無效，在更多的時候需要參考藥敏實驗的結(jié)果。

3、用于流行病學(xué)調(diào)查及院內(nèi)感染的監(jiān)控，減少耐藥菌株的流行。4第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日三、什么情況下需要做培養(yǎng)+藥敏？感染原因無法確定。病原菌的耐藥性無法確定，經(jīng)驗用藥可能失敗（尤其是免疫力低下患者、長期使用抗生素者、ICU病房、院內(nèi)感染患者、接受導(dǎo)管插入或其他創(chuàng)傷性治療患者。）病人對可用藥物過敏，需要檢測其他藥物的耐藥性。病人個體情況要求對某些藥物精確用藥，需要測定其最低抑菌濃度（MIC）。 5第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日四、常用抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測方法介紹其原理：體外測定抗生素藥物抑菌或殺菌的能力?？蓭椭R床對感染性疾病選擇最佳用藥，還可進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，了解某些致病菌耐藥性變異情況。紙片擴散法（Kirby-Bauertest）稀釋法（dilutiontest）E試驗法（Etest）聯(lián)合藥物敏感試驗特殊耐藥菌及耐藥酶的表型檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的檢測β-內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測等第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日五、紙片擴散法（K-B法）原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日方法：菌液制備：挑取孵育16-24h的血平板上數(shù)個菌落置于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)；涂布接種：無菌棉拭蘸取菌液，在試管壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60o，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；貼含藥紙片：平板在室溫下干燥3-5min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm；孵育：35oC16-18h，量取抑菌圈直徑。第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日注意事項1紙片應(yīng)分布均勻，中心距離不小于24mm。2含菌平板必須避免過濃或過稀。3紙片貼完后應(yīng)在15min內(nèi)將平板反過來，置于37度溫箱中。4紙片一旦接觸培養(yǎng)基就不應(yīng)再挪動位置。5要注意無菌操作。第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日影響藥敏結(jié)果的因素培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)試驗菌的營養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。細(xì)菌接種量細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。藥物濃度藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。培養(yǎng)時間一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃，8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時，使抗菌藥預(yù)擴散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長，而得到較大的抑菌圈。第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日結(jié)果判讀：用刻度尺量取抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果；報告：細(xì)菌對該抗生素是敏感（susceptible，S）；耐藥（resistant，R）；還是中介（intermediate，I）。第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日六、如何理解MIC值及藥敏結(jié)果？

每種藥物均提供定性和定量兩種結(jié)果。定性：敏感（S）表示該藥物對該細(xì)菌有抑制或殺滅作用。使用常規(guī)劑量可以達(dá)到有效的治療效果。

中介（中度敏感，I）表示細(xì)菌對該藥物治療的敏感性低于敏感菌株，必須加大劑量以達(dá)到更高的血藥濃度才能在特定的生理部位獲得有效的臨床效力；對于使用劑量有嚴(yán)格限制的藥物則必須重復(fù)測試以確定敏感還是耐藥。

耐藥（R）表示藥物常規(guī)劑量所達(dá)到的藥物濃度不能抑制或殺死細(xì)菌，即使加大劑量也不能達(dá)到治療效果或者超過了人體的正常耐受水平。定量：MIC（最低抑菌濃度）表示在體外達(dá)到抑制細(xì)菌生長所需要的最低的藥物濃度。臨床治療要求的血藥濃度一般為MIC值（μg/ml）的4-8倍。對于不同部位的不同藥物，其濃度可能更高或更低。應(yīng)具體情況具體分析，不可一概而論。

12第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日長期使用抗生素的病人應(yīng)該怎樣做藥敏試驗？

長期使用抗生素的病人尤其是住院病人應(yīng)該經(jīng)常做藥敏試驗。所謂的長期，并不是一個很長的時間概念，住院病人每隔3-4天就需要做一次細(xì)菌學(xué)檢查。對于ICU病房的病人，可能每天都要做細(xì)菌學(xué)檢查。因為這些病人多數(shù)免疫力較差，容易受條件致病菌的侵犯，而且反復(fù)發(fā)作。此外病原菌常呈多重耐藥性，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌（ESBL）以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA和MRSCN）、產(chǎn)AmpC酶的陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌在ICU病房最為常見。對于長期使用抗生素的病人，其感染有以下幾個特點；

1.長期使用抗生素的病人，不同時期（即使在很短的時間內(nèi)）感染的病原菌種類可能不同，耐藥性因此也不相同。

2、同一株細(xì)菌，在長時間用藥時，僅需要3-4天就可以從對某種藥物敏感發(fā)展為耐藥。

3.長期使用抗生素容易誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生L型變異。常規(guī)培養(yǎng)陰性時，進(jìn)行L型細(xì)菌培養(yǎng)能夠提高檢出率。13第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日形成條件：生物學(xué)特性：與醫(yī)學(xué)關(guān)系：細(xì)胞壁中肽聚糖結(jié)構(gòu)受理化或生物因素的直接破壞或合成抑制而形成。形態(tài)多形性；染色革蘭陰性；培養(yǎng)高滲培養(yǎng)基；菌落油煎蛋樣

仍有一定致病性細(xì)菌L型－細(xì)胞壁缺陷細(xì)菌臨床分離葡萄球菌L型葡萄球菌L型回復(fù)后第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日滅菌－殺滅或除去所有微生物的繁殖體和芽胞。消毒－殺滅或除去病原微生物。防腐－抑制微生物的生長與繁殖。抑菌劑或防腐劑。除菌:用沖洗、過濾等機械手段除去微生物的方法化療：用對病原菌有毒力但對機體無害的化學(xué)物質(zhì)殺滅或抑制機體內(nèi)病原微生物的方法消毒與滅菌技術(shù)

基本概念15第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日擦拭法高壓蒸汽滅菌法常用消毒滅菌的方法物理法

化學(xué)法浸泡法熏蒸法噴霧法熱力消毒法生物凈化法輻射消毒法燃燒法烤箱法煮沸法干熱法濕熱法日光曝曬法紫外線燈照射法電子滅菌燈法電離輻射法第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日煮沸消毒法操作規(guī)程將物品刷洗干凈，全部浸沒在水中，或在水中加入碳酸氫鈉配成1％一2％的濃度，可將沸點提高到105℃．還可去污防銹。加熱煮沸。水沸后開始計時5—10min，如中途加入物品，則在第二次水沸后重新計時。關(guān)閉熱源，用無菌持物鉗取出消毒物品。第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日

焚燒----最徹底的滅菌方法燒灼----直接用火焰滅菌方法如接種環(huán)、試管口、三角瓶口干烤----加熱160-170℃2h

玻璃器皿、陶瓷1、干熱滅菌法紅外線----熱效應(yīng)，與干烤類似滅菌效果：可殺死營養(yǎng)體和芽胞第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日2.濕熱滅菌法高壓蒸汽滅菌法（熱壓滅菌法）最有效的濕熱滅菌法121℃15-20mim（殺芽胞)煮沸消毒法水煮100℃5mim(殺繁殖體)-2h(殺芽胞)流通蒸汽消毒法巴氏消毒法間歇蒸汽滅菌法水蒸汽100℃15-30mim(殺繁殖體)反復(fù)多次流動蒸汽間歇加熱滅菌(殺芽胞）較低的溫度61℃30mim/71℃30s（殺致病菌）效果比干熱好第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日壓力蒸汽滅菌的效果監(jiān)測

物理監(jiān)測法用150℃或200℃的留點溫度計。使用前將溫度計汞柱甩至50℃以下，放入包裹內(nèi)，滅菌后檢查其讀數(shù)是否達(dá)到滅菌溫度化學(xué)監(jiān)測法主要是通過化學(xué)指示劑的化學(xué)反應(yīng)，滅菌后呈現(xiàn)的顏色變化來辨別是否達(dá)到滅菌的要求。臨床常用的化學(xué)指示卡與化學(xué)指示膠帶，化學(xué)指示卡放在包的中央，化學(xué)指示膠帶粘貼在包的外面。生物監(jiān)測法是最可靠的監(jiān)測法，利用對熱耐受力較強的非致病性嗜熱脂肪桿菌芽孢作為指示劑，制成每片含106個嗜熱脂肪桿菌芽孢的菌紙片,使用時將10片菌紙片分別放于滅菌器四角及中央，待滅菌完畢，用無菌鑷取出后．再放人培養(yǎng)基內(nèi)，在56℃溫箱中培養(yǎng)48h至1周，若全部菌紙片無細(xì)菌生長則表示滅菌合格。第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日消毒與滅菌技術(shù)

輻射滅菌法?非電離輻射：紫外線最佳殺菌波長為250～270nm殺菌機理：干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄

特點：紫外線穿透力較弱適應(yīng)范圍：紫外線消毒適用于空氣消毒與物品表面的消毒。第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日消毒與滅菌技術(shù)

濾過除菌法殺菌機理：含有微細(xì)小孔<0.22μm,只允許液體或氣體及孔徑<0.22μm的顆粒通過，細(xì)菌不能濾過。不能除病毒、支原體適用范圍：血清、毒素、輸液、生物制品、抗生素以及空氣等的除菌。第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)變性凝固（酚、醇、醛、酸堿類等）干擾細(xì)菌酶系統(tǒng)和代謝（氧化劑、重金屬鹽類等）損傷細(xì)菌細(xì)胞膜，增加其通透性（表面活性劑、脂溶劑等）菌體成分氧化、水解或結(jié)構(gòu)改變（氧化劑、鹵素、醛、酚等）消毒與滅菌技術(shù)

化學(xué)消毒劑作用機制第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日消毒劑類別名稱濃度(%)用途重金屬鹽紅汞2皮膚、粘膜、小創(chuàng)面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化劑高錳酸鉀0.1皮膚、尿道、水果、蔬菜消毒過氧化氫3皮膚、粘膜、創(chuàng)傷消毒過氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纖維消毒鹵素類碘液2.5皮膚消毒醇類乙醇70～75皮膚、體溫計消毒酚類石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒來蘇3～5同上、也常用于手及皮膚消毒表面活性劑新潔爾滅0.1手術(shù)器械消毒酸堿類生石灰1:4～1:8排泄物、地面消毒染料龍膽紫2～4表淺創(chuàng)傷消毒第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日化學(xué)消毒劑的使用方法浸泡法侵泡法是將物品洗凈、擦干后，浸沒在消毒液中進(jìn)行消毒滅菌的方法。擦拭法擦拭法是用消毒劑直接擦拭人體或物品表面，如皮膚、桌椅等，達(dá)到消毒滅菌的方法。噴霧法噴霧法是利用噴霧器將消毒劑變成微粒氣霧彌散在空氣中．對空氣和物品表面進(jìn)行消毒滅菌的方法。熏蒸法熏蒸法是將消毒劑加熱或加人氧化劑，使其產(chǎn)生氣體來進(jìn)行消毒滅