實(shí)驗(yàn)層析技術(shù)血清球蛋白的分離純化與鑒定

實(shí)驗(yàn)層析技術(shù)血清球蛋白的分離純化與鑒定第一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日層析技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)思路實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng)第二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日層析技術(shù)1.定義：層析法，又稱色譜法，是一種廣泛運(yùn)用的物質(zhì)分離純化、分析鑒定技術(shù).第三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日2.分離依據(jù)：混合物中各組分的理化性質(zhì)差異—吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。第四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日固定相—固定不動(dòng)

流動(dòng)相—對(duì)固定相作單向相對(duì)運(yùn)動(dòng)，推動(dòng)樣品中各組分通過(guò)固定相向前移動(dòng)。各組分理化性質(zhì)不同，對(duì)流動(dòng)相和固定相具有不同的作用力，因此在流動(dòng)相推動(dòng)樣品通過(guò)固定相的過(guò)程中，通過(guò)不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分在固定相中的遷移距離不等，達(dá)到分離。3．基本原理：固定相和流動(dòng)相第五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日4．分類：

①流動(dòng)相的物理狀態(tài)：氣相和液相

→

氣液/固，液固/液

②方式：紙、薄層、柱

③原理：吸附、分配、凝膠、離子交換、親和、金屬螯合、疏水、反相第六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日5．凝膠層析

(凝膠過(guò)濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析)

①定義：指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。第七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日②基本原理：

固定相：凝膠，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖-葡聚糖復(fù)合凝膠。

流動(dòng)相：洗脫液pH7.4磷酸鹽緩沖液第八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日交聯(lián)葡聚糖凝膠多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)珠狀顆粒，商品名為SephadexG系列G—交聯(lián)度：G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的規(guī)格型號(hào)，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八種，具體含義為凝膠得水值的10倍或吸水量（g）/10g干膠交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大，孔徑越小，吸水性??；交聯(lián)度越小，孔徑越大，吸水性大。因此，“G”反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。第九頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日長(zhǎng)鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接第十頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日凝膠層析的基本原理樣品加于柱上，樣品隨洗脫液的流動(dòng)而向下移動(dòng)，同時(shí)作垂直向下運(yùn)動(dòng)和不定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)→小分子可進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，流程長(zhǎng)，速度慢，后流出；大分子不能進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，顆粒間移動(dòng)，流程短，先流出→大小分子彼此分開(kāi)第十一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第十二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第十三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日③影響因素*層析柱的選擇及裝填：柱大小—分離樣品量凝膠型號(hào)—分辨率：各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分子/完全滲透分子。*洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性*加樣量：1%～5%*凝膠的再生第十四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日離子交換層析定義:離子交換層析是利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團(tuán)和流動(dòng)相解離的離子化合物之間發(fā)生可逆的離子交換反應(yīng)而進(jìn)行的分離方法.第十五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日原理:離子交換交換層析是利用離子交換劑對(duì)各種離子的親和力不同，借以分離混和物中各種離子的一種技術(shù)。其主要特點(diǎn)是依靠帶有相反電荷的顆粒之間的吸引力的作用。第十六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日分類:陰離子交換劑帶正電荷，與混合物中帶負(fù)電的組分結(jié)合陰離子交換層析陽(yáng)離子交換劑帶負(fù)電荷，與混合物中帶正電的組分結(jié)合陽(yáng)離子交換層析第十七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第十八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)凝膠型號(hào)顆粒大?。é蘭)溶脹體積(ml/g)分離范圍（Mr）G-1040～1202～3＜7×102G-1550～1502.5～3.5＜1.5×103G-2550～1504～61×103～5×103G-5040～1209～111.5×103～3×104G-7540～12012～153×103～8×104G-10040～12015～204×103～1×105第十九頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日分離依據(jù)：蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的和個(gè)性實(shí)驗(yàn)原理共性：

*生命高分子：透析、超濾、超離心、凝膠層析

*蛋白質(zhì)溶液是親水膠體：穩(wěn)定因素為水化膜和電荷→鹽析/有機(jī)溶劑沉淀

*兩性電解質(zhì)和等電點(diǎn)：pH>pI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；反之帶正電→電泳、離子交換層析

*有一定的功能：抗原性→免疫沉淀

個(gè)性：蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、親水程度、形狀不同第二十頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定上午完成先粗后細(xì)下午完成第二十一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日①分段鹽析：常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，分段鹽析效果好，不易引起變性。溶液pH約4.5～5.5，可用硫酸/氨水按需要調(diào)節(jié)pH值。分段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、pI不同，所需的鹽濃度、pH也不一樣。如清蛋白分子小，親水性強(qiáng)，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調(diào)節(jié)鹽濃度及pH可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng)第二十二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日影響因素：

①溫度：溫度與溶解度成正比。一般室溫即可,少數(shù)溫度敏感型蛋白質(zhì)需4度操作，而血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25度比0度時(shí)溶解度低，更易鹽析。

②pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在pI時(shí)溶解度最低。pH=pI效果更好。

③蛋白質(zhì)濃度：濃度高時(shí)產(chǎn)生共沉。鹽析前血清加等量生理鹽水稀釋，控制蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。第二十三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日②凝膠層析脫鹽：常用透析，需時(shí)較長(zhǎng)，最好低溫。也可用葡萄糖凝膠G-25/50過(guò)柱，用時(shí)較短。

固定相：sephadexG-25

流動(dòng)相：pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液（0.9%NaCl）

原理同前，蛋白質(zhì)大分子，硫酸銨小分子。第二十四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日③濃縮：sephadexG-25吸水，利用高分子性質(zhì)。第二十五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)：

1．硫酸銨的滴加，邊搖邊逐滴加入

2．流洗柱子：3～4個(gè)柱長(zhǎng)

3．上樣：轉(zhuǎn)圈滴加，起跑線一致

4．防止柱上液層干涸

5．洗脫液收集無(wú)需分部，用載玻片檢測(cè)蛋白，無(wú)納氏試劑

6．G-25干膠用紙條少量多次加入，液層高<0.5ml

7.用過(guò)的G-25干膠倒入收集缸，回收利用。第二十六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。電泳系統(tǒng)：電泳支持介質(zhì)、電泳緩沖液、電場(chǎng)④鑒定：醋酸纖維素薄膜電泳第二十七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日電泳用于分離物質(zhì)的原理COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，有一定的等電點(diǎn)，在大于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)，由于各種蛋白質(zhì)的分子大小與結(jié)構(gòu)不同，所帶表面電荷的多少不同，因而在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)的速度不同。經(jīng)過(guò)一定的電泳時(shí)間后可形成許多蛋白質(zhì)區(qū)帶，每一個(gè)區(qū)帶代表一組遷移率相近似的蛋白質(zhì)。第二十八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日醋酸纖維素薄膜電泳

介質(zhì)：醋酸纖維素薄膜，纖維素的羥基經(jīng)乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。溶于有機(jī)溶劑后涂成薄膜，具均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性。

電泳緩沖液：pH8.6的巴比妥緩沖液第二十九頁(yè)，共三十頁(yè)，