實驗改良法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素

實驗改良法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日一.

目的要求掌握本法測定血清膽紅素的基本原理。熟悉本法測定血清膽紅素的基本操作步驟及參考值。了解臨床測定血清膽紅素的主要方法及意義。第二頁，共二十九頁，2022年，8月28日二．實驗原理血清中結(jié)合膽紅素可直接與重氮試劑反應(yīng)，生成紫色的偶氮膽紅素；在同樣條件下，未結(jié)合膽紅素須有加速劑破壞膽紅素氫鍵后才能與重氮試劑反應(yīng)?？Х纫颉⒈郊姿徕c作為加速劑，醋酸鈉緩沖液可維持反應(yīng)的pH值同時兼有加速作用。(疊氮鈉破壞剩余重氮試劑，終止結(jié)合膽紅素測定管的偶氮反應(yīng)。)最后加入堿性酒石酸鈉，在堿性條件下，紫色偶氮膽紅素轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色偶氮膽紅素，使最大吸光度由530nm轉(zhuǎn)移到598nm，此時，非膽紅素的黃色色素及其他紅色與棕色色素產(chǎn)生的吸光度可忽略不計，使測定的靈敏度和特異性增加。最后形成的綠色是由藍(lán)色的堿性偶氮膽紅素和咖啡因?qū)Π被交撬嶂g形成的黃色色素混合而成。第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日三．器材及試劑1．器材：（1）試管（2）刻度吸管（3）紫外-可見分光光度計（4）恒溫水浴箱第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日三．器材及試劑2．試劑：咖啡因-苯甲酸鈉試劑

稱取無水醋酸鈉14.0g，苯甲酸鈉37.5g，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）0.5g，溶于500ml蒸餾水中，再加咖啡因25.0g，攪拌至完全溶解（不可加熱），用蒸餾水稀釋至1000ml。混勻，過濾，置棕色瓶中，室溫保存。堿性酒石酸鈉溶液

稱取氫氧化鈉75.0g，酒石酸鈉（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用蒸餾水溶解并稀釋至1000ml?；靹?，置塑料瓶中，室溫保存(每排配150mL,計算后給老師確認(rèn)后方可配制)。5.0g/L亞硝酸鈉溶液

稱取亞硝酸鈉（NaNO2）0.5g，用蒸餾水溶解并稀釋至100ml，混勻，置棕色瓶中，4℃保存。若溶液呈淡黃色時，應(yīng)丟棄重配。5.0g/L對氨基苯磺酸溶液

稱取對氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，加蒸餾水800ml及濃鹽酸15ml，待完全溶解后加蒸餾水稀釋至1000ml，混勻(每排配100mL，計算后給老師確認(rèn)后方可配制)。重氮試劑

臨用前取5.0g/L亞硝酸鈉0.5ml和5.0g/L對氨基苯磺酸溶液20ml，混勻。第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日三．器材及試劑2．試劑：膽紅素標(biāo)準(zhǔn)

稀釋血清：收集無溶血、無黃疸、無脂濁之新鮮血清，過濾。取過濾血清0.2mL，加入4.8mL新鮮生理鹽水，混勻。以生理鹽水調(diào)零，比色杯光徑10mm，稀釋血清在414nm吸光度應(yīng)小于0.100，460nm吸光度應(yīng)小于0.040。

膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液（171μmol/L或10mg/dL）:稱取符合標(biāo)準(zhǔn)的膽紅素（MW：584.68）10mg，加入二甲亞砜1mL，玻棒攪勻，加入0.05mol/LNa2CO3溶液2mL，使膽紅素完全溶解。移入100ml容量瓶，用稀釋血清洗滌數(shù)次并移入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/LHCl溶液2mL（邊加邊緩慢搖動，切勿產(chǎn)生氣泡），最后用稀釋血清稀釋至100mL。避光，4℃保存，3天內(nèi)有效，最好當(dāng)天繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日四．操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按下表配制5種不同濃度的膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液

將以上各管充分混勻（不產(chǎn)生氣泡）。試劑(ml)/管別012345膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液(171μmol/L)0.00.20.40.60.81.0稀釋血清1.00.80.60.40.20.0相當(dāng)于膽紅素濃度

μmol/Lmg/dl——34.268.4103137171246810第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日四．操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：不同濃度的膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液按下表操作試劑(mL)

不同濃度的膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液0.2咖啡因-苯甲酸鈉試劑1.6重氮試劑0.4

混勻，總膽紅素管置室溫15分鐘，按下表繼續(xù)操作：

堿性酒石酸鈉溶液1.2每一濃度平行做二管，取平均值。用空白管調(diào)零，于波長600nm，讀取各管吸光度，然后與相應(yīng)的膽紅素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日四．操作步驟2．總膽紅素的測定：取3支試管（總膽紅素2組平行，空白管1管），標(biāo)明總膽紅素管和空白管，然后按下表操作試劑(ml)/管別總膽紅素管空白管血清0.20.2咖啡因-苯甲酸鈉試劑1.61.6氨基苯磺酸溶液—0.4重氮試劑0.4

—

混勻，總膽紅素管置室溫15分鐘，按下表繼續(xù)操作：

堿性酒石酸鈉溶液1.21.2

充分混勻后，用空白管調(diào)零，于波長600nm，讀取總膽紅素管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的膽紅素濃度。第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日五．實驗結(jié)果A總膽紅素=？

血清總膽紅素=？第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日六．注意事項參考值

血清總膽紅素5.1—19μmol/L(0.3—1.1mg/dl)

血清結(jié)合膽紅素1.7—6.8μmol/L(0.1—0.4mg/dl)在10—37℃范圍內(nèi)，本測定方法不受環(huán)境溫度影響，呈色在2小時內(nèi)穩(wěn)定。嚴(yán)重溶血時，可導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。血脂可影響測定結(jié)果，故應(yīng)盡量取空腹血。膽紅素對光敏感，膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液及血清樣本均應(yīng)避光。第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義膽色素代謝

膽色素(bilepigment)是體內(nèi)鐵卟啉類化合物的主要分解代謝產(chǎn)物，包括膽綠素(biliverdin)、膽紅素(bilirubin)、膽素原(bilinogen)和膽素(bilin)等。膽紅素處于膽色素代謝的中心，是人體膽汁中的主要色素。第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義膽紅素空間結(jié)構(gòu)示意圖膽紅素的特有結(jié)構(gòu)賦予其親脂疏水的性質(zhì),易自由透過細(xì)胞膜進(jìn)入血液。第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義1.膽紅素主要源于血紅素的降解（1）膽紅素主要源于衰老紅細(xì)胞的破壞體內(nèi)的鐵卟啉化合物包括——血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素、過氧化氫酶及過氧化物酶。正常人每天可生成250～350mg膽紅素，其中約80%以上來自衰老紅細(xì)胞破壞所釋放的血紅蛋白的分解。第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義1.膽紅素主要源于血紅素的降解（2）血紅素加氧酶和膽綠素還原酶催化膽紅素的生成部位：

肝、脾、骨髓等單核吞噬細(xì)胞微粒體與胞液中。過程：血紅蛋白血紅素＋珠蛋白氨基酸膽紅素第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義1.膽紅素主要源于血紅素的降解（2）血紅素加氧酶和膽綠素還原酶催化膽紅素的生成膽紅素的生成過程：第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義2.血液中的膽紅素主要與白蛋白結(jié)合而運(yùn)輸運(yùn)輸形式：膽紅素-白蛋白復(fù)合體意義：一方面增加了膽紅素的水溶性，提高了血漿對膽紅素的運(yùn)輸能力；另一方面限制了它自由通透各種細(xì)胞膜，避免了它對組織細(xì)胞造成的毒性，起到暫時性的解毒作用。競爭結(jié)合劑：如磺胺藥、水楊酸、膽汁酸等。第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義3.膽紅素在肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合膽紅素并泌入膽小管（1）游離膽紅素可滲透肝細(xì)胞膜而被攝取膽紅素可以自由雙向通透肝血竇肝細(xì)胞膜表面進(jìn)入肝細(xì)胞；膽紅素在胞漿與配體蛋白(Ｙ蛋白或Ｚ蛋白)結(jié)合，膽紅素-Y蛋白或膽紅素-Z蛋白形式將膽紅素攜帶至肝細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義3.膽紅素在肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合膽紅素并泌入膽小管（2）膽紅素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合葡糖醛酸生成水溶性結(jié)合膽紅素部位：滑面內(nèi)網(wǎng)質(zhì)反應(yīng)：結(jié)合反應(yīng)(主要結(jié)合物為UDP葡糖醛酸,UDPGA)催化酶：葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物：主要為雙葡糖醛酸膽紅素，另有少量單葡萄糖醛酸膽紅素、硫酸膽紅素，統(tǒng)稱為結(jié)合膽紅素。意義：膽紅素與葡糖醛酸的結(jié)合是肝對有毒性膽紅素一種根本性的生物轉(zhuǎn)化解毒方式。第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義3.膽紅素在肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合膽紅素并泌入膽小管（2）膽紅素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合葡糖醛酸生成水溶性結(jié)合膽紅素葡糖醛酸膽紅素的生成:膽紅素+UDP-葡糖醛酸膽紅素葡糖醛酸一酯+UDPUDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶膽紅素葡糖醛酸一酯+UDP-葡糖醛酸UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶膽紅素葡糖醛酸二酯

+UDP第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義3.膽紅素在肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合膽紅素并泌入膽小管（2）膽紅素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合葡糖醛酸生成水溶性結(jié)合膽紅素兩種膽紅素理化性質(zhì)的比較理化性質(zhì)未結(jié)合膽紅素結(jié)合膽紅素同義名稱間接膽紅素、游離膽紅素直接膽紅素、肝膽紅素與葡糖醛酸結(jié)合未結(jié)合結(jié)合水溶性小大脂溶性大小透過細(xì)胞膜的能力及毒性大小能否透過腎小球隨尿排出不能能與重氮試劑反應(yīng)間接陽性直接陽性第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義4.膽紅素在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽素原和膽素膽素原生成過程：結(jié)合膽紅素膽素原腸菌葡糖醛酸還原膽素氧化游離膽紅素第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義4.膽紅素在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽素原和膽素第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義5.高膽紅素血癥及黃疸（1）正常人膽紅素的生成與排泄維持動態(tài)平衡正常血清膽紅素濃度：3.4～17.1μmol/L（0.2～1mg/dl)。4/5為游離膽紅素，其余為結(jié)合膽紅素。高膽紅素血癥（hyperbilirubinemia)：體內(nèi)膽紅素生成過多，或肝細(xì)胞對膽紅素的攝取、轉(zhuǎn)化及排泄能力下降等因素引起血漿膽紅素含量的增多。第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義5.高膽紅素血癥及黃疸（2）黃疸依據(jù)病因有溶血性、肝細(xì)胞性和阻塞性之分體內(nèi)膽紅素生成過多，或肝細(xì)胞對膽紅素的攝取、轉(zhuǎn)化及排泄能力下降等因素均可引起血漿膽紅素含量增多，稱為高膽紅素血癥(hyperbilirubinemia)。膽紅素為橙黃色物質(zhì)，過量的膽紅素可擴(kuò)散進(jìn)入組織造成組織黃染，這一體征稱為黃疸(jaundice)。第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日七．相關(guān)知識與臨床意義5.高膽紅素血癥及黃疸（2）黃疸依據(jù)病因有溶血性、肝細(xì)胞性和阻塞性之分當(dāng)血漿膽紅素濃度超過34.2μmol/L(2mg/dl)時，肉眼可見皮膚、粘膜及鞏膜等組織黃染，臨床上稱為顯性黃疸。若血漿膽紅素升高不明顯，在1～2mg/dl之間時，肉眼觀察不到皮膚與鞏膜等黃染現(xiàn)象，稱為隱性黃疸(jaundiceoccult)。臨床上常根據(jù)黃疸發(fā)病的原因不同，簡單的將黃疸分為三類：（1）溶血性黃疸(hemolyticjaundice)；（2）肝細(xì)胞性黃疸(hepatocellularjaundic