分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作方法與技巧

分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

操作、設(shè)計(jì)與技能電泳技術(shù)李剛副教授contents影響遷移率的幾大因素2電泳的原理1低熔點(diǎn)瓊脂糖的優(yōu)點(diǎn)3不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍4電泳緩沖液5contents電泳步驟7凝膠載樣緩沖液6凝膠中DNA定量的方法8兩種核酸染色方法9電泳的主要用處10contents電泳切膠小竅門12

核酸回收的幾種經(jīng)典方法11電泳的原理帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。利用帶電樣品分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）在電泳裝置中的支持介質(zhì)上（瓊脂糖、聚丙酰酰胺等）遷移率（帶電荷顆粒在一定電場強(qiáng)度下，單位時間內(nèi)在介質(zhì)中的遷移距離）的不同而將樣品中不同大小的分子分離開。影響遷移率的幾大因素1、DNA分子的大小。分子越大，遷移得越慢。2、瓊脂糖濃度。給定大小的線性DNA片段在越低濃度瓊脂糖的凝膠中遷移率越快。3、DNA的構(gòu)象。一般超螺旋DNA（I型)>切口環(huán)狀DNA>線狀DNA，但在一些情況下，順序可能顛倒。所以確定DNA的大小，很多時候要依靠Marker（分子量標(biāo)記）。4、溴化乙錠（EB）。EB插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。因此線狀DNA－染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15％。影響遷移率的幾大因素5、所用的電壓。低電壓時，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強(qiáng)度升高時，高分子質(zhì)量片段的遷移率不成比例的增加。所以當(dāng)電壓增大瓊脂糖凝膠所分離的有效范圍反而減少。要獲得大于2KbDNA片段的良好分辨率，則所用電壓不得超過5－8V／cm。6、瓊脂糖種類。常見的瓊脂糖主要有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖(Agarose)和低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMPAgarose）。一般低熔點(diǎn)瓊脂糖比標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖具有更佳的分辨率。瓊脂糖品牌的推薦一般來說，瓊脂糖的品牌對電泳結(jié)果影響不大，但好的瓊脂糖做出來的膠韌性比較好，照出來的照片效果好，很清晰，背景很干凈。推薦：最好用的瓊脂糖品牌：Sigma，日本的一些牌子，強(qiáng)度也很高。性價比比較高的有BioWestAgarose（西班牙品牌），這幾乎是目前國內(nèi)使用最普遍的一種瓊脂糖。另外，Promega的Agarose不好用，強(qiáng)度較差。Agarose和Agar的區(qū)別注意：Agarose和Agar的區(qū)別：瓊脂糖（Agarose）是經(jīng)過挑選，以質(zhì)地較純的瓊脂（Agar）作為原料而制成的。瓊脂在化學(xué)上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復(fù)合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖，它具有離子交換性質(zhì)，這種性質(zhì)會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成。瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因?yàn)楣腆w支持物的影響少，故電泳速度快，區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團(tuán)，電滲影響很少，是一種較好的電泳材料，分離效果較好。Agarose一般僅用于電泳實(shí)驗(yàn)，當(dāng)然如果不怕浪費(fèi)的話，也可以用于配固體培養(yǎng)基。效果很好！Agar一般僅用于配固體培養(yǎng)基，絕對不能用于電泳！低熔點(diǎn)瓊脂糖的優(yōu)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖一般凝結(jié)溫度在40－42C，熔化溫度在85－90度。低熔點(diǎn)瓊脂糖一般凝結(jié)溫度在25－35C，熔化溫度在63－65C，甚至更低。一般在30－35C仍呈液態(tài)，所以在回收膠內(nèi)的DNA時，加熱溶解膠后不損傷DNA。另外它比標(biāo)準(zhǔn)（普通）瓊脂糖有更高的篩分能力。其分辨率接近聚丙烯酰胺凝膠，因此可用于PCR產(chǎn)物、小片段DNA和小RNA（<1kb）的分離。現(xiàn)在它能分辨少至4bp的DNA和分離200－800bp范圍內(nèi)相差2％的DNA片段。但低熔點(diǎn)瓊脂糖價格非常昂貴，遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖。不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍瓊脂糖／％

標(biāo)準(zhǔn)

高強(qiáng)度

低熔點(diǎn)

低黏性低熔點(diǎn)0.30.5700bp-25kb0.8500bp-15kb800bp-10kb800bp-10kb1.0250bp-12kb400bp-8kb400bp-8kb1.2150bp-6kb300bp-7kb300bp-7kb1.580bp-4kb200bp-4kb200bp-4kb2.0100bp-3kb100bp-3KB3.0500bp-1kb500bp-1kb4.0100bp–500bp6.010bp-100bp電泳緩沖液DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。缺乏離子（如用水代替電泳槽及凝膠中的緩沖液）則電導(dǎo)率降至很低，DNA不是不動就是遷移極慢。高離子強(qiáng)度時（如錯用了10電泳緩沖液），電導(dǎo)率升高，即使應(yīng)用適中的電壓也會產(chǎn)生大量的熱能。最嚴(yán)重時，凝膠會熔化，DNA會變性。常用的兩種電泳緩沖液緩沖液

工作液

貯存液／LTAE140mMTris-乙酸鹽

501mMEDTA242gTris57.1mL冰乙酸

100mL0.5MEDTA(pH8.0)TBE0.545mMTris-硼酸鹽

51mMEDTA54gTris27.5g硼酸

20mL0.5MEDTA(pH8.0)

選擇TAE還是TBE？TAE的緩沖容量最低，長時間電泳會被消耗完，應(yīng)短期更換。TBE成本比TAE稍貴些，但緩沖容量比TAE大得多，可以很長時間不用更換。對于低分子量DNA電泳，TAE分辨率稍低于TBE，而高分子量DNA電泳，TAE的分辨率略高于TBE。因此Southernblot操作中均用TAE作為電泳緩沖液制備凝膠和電泳。超螺旋DNA在TAE中的分辨率要好于TBE。

凝膠載樣緩沖液電泳樣品上樣前需要和載樣緩沖液混合。載樣緩沖液有三個作用：它增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；使樣品帶有顏色便于檢查上樣過程；其中的染料在電場中可以以預(yù)測的速率向陽極遷移。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖濃度無關(guān)。在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)遷移速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長4000bp的DNA相同。上述關(guān)系在濃度范圍0.5%-1.4%的瓊脂糖凝膠中基本不受濃度變化的影響。用哪種載樣緩沖液是個人的習(xí)慣。6載樣緩沖液緩沖液類型

6緩沖液

貯存溫度I

0.25%溴酚藍(lán)4C

0.25％二甲苯氰FF40％（m/V）蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫

0.25％二甲苯氰FF15％Ficoll（Type400，Pharmacia）水溶液III

0.25%溴酚藍(lán)4C0.25％二甲苯氰FF30％（V/V）甘油水溶液IV

0.25%溴酚藍(lán)4C40％（m/V）蔗糖水溶液電泳步驟1、用相應(yīng)的電泳緩沖液加入適量瓊脂糖熔化（水浴或微波）配膠，待膠熔化后取一定量（通常20－30mL）加入一個專用的三角瓶中，加入EB使其終濃度為0.5g/ml，混勻后加入一個預(yù)先密封好、放好合適的梳子（以形成加樣孔）的膠板中灌膠（防止漏膠是要點(diǎn)：用雙層膠帶紙封膠板或使用現(xiàn)在的防漏膠膠板）。2、讓凝膠溶液完全凝膠，一般室溫下需要30－45分鐘。3、小心拔掉梳子（要點(diǎn)：雙手拔），撕去封邊膠帶，將凝膠安放到電泳槽內(nèi)。4、向電泳槽內(nèi)加入電泳液，剛好沒過凝膠約1mm。5、混合DNA樣品和0.2倍體積6載樣緩沖液。（一般在eppendorf管中混勻,要點(diǎn):快速加樣用封口膜加緩沖液）電泳步驟6、用微量移液器及一次性吸頭將混合液加入凝膠中的加樣孔中，分子量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)加入加樣孔左右兩側(cè)的兩個孔內(nèi)。（初學(xué)者常常在點(diǎn)樣的時候看不清膠上透明的加樣孔，一個有效的解決辦法是在電泳槽下面墊一張黑色的紙版或塑料膜，這樣由于背景是黑色的，很容易發(fā)現(xiàn)加樣孔。）7、調(diào)到合適電壓（通常1－5V/cm，實(shí)際上有時為了省時間可適當(dāng)增加電壓）電泳?？措姌O插頭有沒有插反？陽極和陰極有沒有氣泡冒出？待溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF遷移到適當(dāng)距離后再停止電泳。（一般等溴酚藍(lán)遷移到膠板的三分之二位置以上即可停止電泳）8、在紫外透射儀下觀察凝膠，并用凝膠成像系統(tǒng)照相。電泳過程的動畫播放gelelectrophoresis.exe凝膠中DNA定量的方法1、紫外分光光度計(jì)法，根據(jù)OD260值換算。（定量測定DNA或RNA時需要讀取260nm和280nm兩個波長下的讀數(shù)。根據(jù)在260nm處的讀數(shù)可計(jì)算出樣品中的核酸濃度，1個OD值相當(dāng)于50μg／mL雙鏈DNA、40μg／mL單鏈DNA和RNA及33μg／mL單鏈寡核苷酸。利用260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值可估計(jì)核酸的純度。DNA和RNA純制品的OD260：OD280值分別為1.8和2.0。）必須指出：盡管上述方法測得的DNA濃度一般是很精準(zhǔn)的，但有些時候由于儀器或操作的原因，其誤差往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過根據(jù)肉眼判斷的DNA濃度。凝膠中DNA定量的方法2、根據(jù)DNAmarker估算。（以DL2000為例）。DL2000由100bp、250bp、500bp，750bp、1000bp、2000bp六條帶組成。一般每次取5μl電泳，每條帶的DNA量都是相同的，約為50ng，所以5μlDL2000的DNA片段總量約為300ng。如果目標(biāo)DNA的帶與DL2000的某條帶差不多大，且亮度相似，則可認(rèn)為目標(biāo)DNA的量也為50ng，再除以目標(biāo)DNA的體積，即為目標(biāo)DNA的濃度。如果目標(biāo)DNA的帶比markerDNA某條帶的亮度高很多倍，可通過系列稀釋，使之亮度相似。再考慮稀釋倍數(shù)計(jì)算其濃度；如果目標(biāo)DNA的帶比markerDNA某條帶的亮度低很多倍，可通過減少或稀釋markerDNA，使之亮度相似。再根據(jù)markerDNA的量計(jì)算其濃度。3、有些計(jì)算機(jī)軟件可根據(jù)上述原理，直接根據(jù)所拍凝膠電泳圖中marker條帶與目標(biāo)DNA條帶大小和亮度的差異，直接計(jì)算出目標(biāo)DNA的濃度。兩種核酸染色方法溴化乙錠（EB）染色法：靈敏度：10ngDNA條帶。配制：通常用水將溴化乙錠配制成10mg/mL的貯存液，于室溫（或4C）保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中。電泳時的工作濃度是0.5g/ml，大多數(shù)情況下可以預(yù)先加入膠中。但當(dāng)需要知道DNA片段的準(zhǔn)確大?。ㄈ鏒NA限制酶切圖譜的鑒定時片段大小很接近）時，凝膠應(yīng)該在無EB條件下電泳。電泳結(jié)束后用EB染色。染色時，將凝膠浸入含有EB0.5g/ml）的電泳緩沖液中，室溫下染色30－45min。染色完畢后，通常不需要脫色。但在檢測小量DNA（<10ng）片段時，通常要將染色后的凝膠浸入水中或1mMMgSO4中,室溫脫色20分鐘更容易觀察到。廢棄溴化乙錠EB凈化和處理方法1、嚴(yán)禁隨便丟棄。因?yàn)镋B是強(qiáng)致癌性，而且易揮發(fā)，揮發(fā)至空氣中，危害很大。2、

廢EB溶液的處理方法：

(1)

對于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下處理：

a.

將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml；

b.

加入一倍體積的0.5mol/L

KMnO4

，混勻，再加入等量的2.5mol/L

HCl，混勻，置室溫?cái)?shù)小時；

c.

加入一倍體積的2.5mol/L

NaOH，混勻并廢棄。

(2)

EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理：

a.

按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時；

b.

用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。3廢EB接觸物，如抹布，槍頭。一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期進(jìn)行焚燒處理。凝膠SYBRGold染色法SYBRGold是一種新型的極敏感的染料的商品名稱。它激發(fā)的熒光信號（300nm透射光下激發(fā)出亮黃色熒光）的強(qiáng)度是EB－DNA復(fù)合物的1000多倍，因此用SYBR－Gold可檢測出瓊脂糖凝膠中小于20pg的雙鏈DNA，少至100pg的單鏈DNA或300pg的RNA。SYBRGold以10000x的濃度貯存在無水的DMSO（二甲基亞砜）中，其昂貴的價格使其不適合用于常規(guī)凝膠染色。但是將該染料在某些實(shí)驗(yàn)中（單鏈構(gòu)象的多態(tài)性和變性梯度凝膠電泳）替代放射標(biāo)記DNA是物有所值的。使用時，DNA片段經(jīng)過凝膠電泳分離后，用SYBRGold貯存液的稀釋液（1：10000）浸染凝膠。不能將SYBRGod加入熔化的凝膠中或電泳前加入凝膠，這是由于在SYBRGold存在的情況下，凝膠中核酸的電泳條帶會發(fā)生嚴(yán)重變形。另外由于SYBRGold對熒光敏感，所以其工作液應(yīng)該當(dāng)天用電泳緩沖液新鮮配制，室溫存放。

電泳的主要用處1、質(zhì)?；蚧蛎盖袌D譜的鑒定。2、核酸或蛋白質(zhì)大小的檢測。3、DNA酶切片段或蛋白質(zhì)的純化和回收。核酸回收的幾種經(jīng)典方法1、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中有機(jī)試劑抽提。2、用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA。3、瓊脂糖酶消化法。4、凝膠切槽法。5、凍融法。6、Kit法。1、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中有機(jī)試劑抽提由于低熔點(diǎn)瓊脂糖在37C仍保持液態(tài)，一些酶學(xué)反應(yīng)操作如連接、合成放射性探針以及限制性酶切等反應(yīng)，均可通過將含有目的DNA片段的凝膠直接加入到反應(yīng)體系中來完成。然而總體上講，DNA聚合酶、連接酶以及限制酶在液膠狀態(tài)下比在常規(guī)的緩沖液中工作效率要低，一般不建議這么做，所以很多實(shí)驗(yàn)要從凝膠中回收DNA片段后再進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。步驟：1、利用低熔點(diǎn)瓊脂糖制備膠塊，電泳，使目的片段與其它條帶完全分開。在紫外燈下，用一鋒利的刀片切下含有目的條帶的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠切片，轉(zhuǎn)移到一個干凈的一次性使用的塑料管中（盡量將多余的凝膠切掉，以減少抑制劑對DNA的污染量）。（要點(diǎn)：節(jié)省低熔點(diǎn)凝膠的方法）2、加5倍體積的LMT洗脫緩沖液[20mMTris.Cl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)]至瓊脂糖切片中。蓋好管蓋，于65C溫育5分鐘熔化凝膠。3、待凝膠冷卻至室溫后，加等體積的Tris平衡酚，將混合液混旋20S。在20C以4000g離心10分鐘，回收水相（界面的白色物質(zhì)是瓊脂糖）。4、再用等體積的酚：氯仿、氯仿各抽提一次。5、水相轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中。加0.2倍體積的10M乙酸銨和2倍體積4C的無水乙醇?；旌弦涸谑覝叵路胖?0分鐘。然后4C，5000g(SorvallSS-34轉(zhuǎn)子相當(dāng)于6500r/min)離心20min，沉淀回收DNA。6、用70％的乙醇洗滌沉淀，并溶于適當(dāng)體積的TE（pH8.0）中。低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收純化的DNA適于分子克隆中的大多數(shù)酶學(xué)操作，但對于一些要求更嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，如轉(zhuǎn)染、顯微注射等需要高純度的DNA，此時需要用商品化的各種樹脂進(jìn)行純化。節(jié)省低熔點(diǎn)凝膠的方法用普通Agarose配制膠塊進(jìn)行電泳，待各DNA條帶在膠上完全分開后，關(guān)掉電泳儀，取出膠板，在緊靠目的條帶正前方的泳道上用刀片挖一個長方形的小槽，注意要將膠塊的底物挖通，然后用低熔點(diǎn)瓊脂糖和電泳緩沖液配制少量膠塊，融化后，趁熱倒入所挖的長方形小槽內(nèi)，室溫放置數(shù)分鐘，使其完全凝固。然后將補(bǔ)好的膠塊重新放入電泳槽中進(jìn)入電泳。同時用手提式紫外燈實(shí)時監(jiān)控目的條帶，直至目的條帶完全進(jìn)入挖好的槽中。停止電泳，將低熔點(diǎn)瓊脂糖膠塊中含有目的DNA的條帶切下，即可進(jìn)行后續(xù)操作。2、用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA原理：在高鹽狀態(tài)下，可使呈液態(tài)的低熔點(diǎn)瓊脂糖切片中的DNA結(jié)合到玻璃珠（粉）上。洗滌液清洗后，利用低鹽緩沖液洗脫結(jié)合到玻璃珠上的DNA，從而可以有效回收DNA。優(yōu)點(diǎn)：比有機(jī)試劑抽提法更快速，純度更高；缺點(diǎn)：回收產(chǎn)量往往較低。步驟：1、將切好的凝膠切片轉(zhuǎn)移到一聚丙烯管中。2、加3－5倍體積的碘酸鈉溶液，55C溫育5分鐘熔化凝膠。當(dāng)凝膠完全熔化后，不宜再進(jìn)行加熱。3、對于5g的DNA樣品，加入5l玻璃珠。對于>5g的DNA樣品，每增加1g的DNA需額外增加2l玻璃珠。室溫溫育5min,并不時搖動。4、微量離心機(jī)以最大轉(zhuǎn)速離心5s,棄上清。5、用500l洗滌液[20mMTris.Cl(pH7.4),1mMEDTA,100mMNaCl,加等體積的乙醇，0C可保存3－4個月。]連洗沉淀3次，以0.5gDNA/l重懸于TE（pH8.0）。6、45C溫育DNA／玻璃珠混合物3ml,使DNA從玻璃珠上洗脫。7、微量離心機(jī)以最大轉(zhuǎn)速離心1min,將含DNA的上清移至另一新的離心管中，4C（或－20C）保存。3、瓊脂糖酶消化法

原理：瓊脂糖酶使瓊脂糖多聚體水解成雙糖。這樣獲得的DNA再經(jīng)酚抽提、乙醇沉淀進(jìn)行純化。由于該法較為溫和，因此特別適用于從脈沖場瓊脂糖凝膠中回收高分子量的DNA，從恒強(qiáng)電場瓊脂糖凝膠中回收小分子DNA也同樣有效。1、將切好的凝膠切片轉(zhuǎn)移至微量離心管中，加入20倍體積（1微克加入20微升）的凝膠平衡緩沖液［10mMBisTris-Cl(pH6.5)］,5mMEDTA(pH8.0),0.1MNaCl],室溫靜置30min。2、將凝膠切片轉(zhuǎn)移至另一加有等體積凝膠平衡緩沖液的新微量離心管中。3、65C溫育10min，使凝膠切片熔化。冷卻至40C，加入無DNA酶的瓊脂糖酶，每200l凝膠加入1－2單位。40C溫育1h。4、此時的DNA溶液可直接用于連接、酶切及轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。此外，如果需要，DNA溶液還可作進(jìn)一步的純化和濃縮。純化小片段DNA（<20kb）A.用平衡酚抽取DNA溶液兩次。B.將水相轉(zhuǎn)移至一新管中，加入兩倍體積的TE（pH8.0），這一步操作有助于防止寡糖沉淀。C.加入0.05倍體積的5MNaCl，隨后加入2倍體積的乙醇（指上步中的DNA終體積）l。置0C預(yù)冷15分鐘，微量離心機(jī)4C以最大轉(zhuǎn)速離心15分鐘收集沉淀。D.小心地吸出乙醇，加入0.5ml處于室溫的70％乙醇?；旌暇鶆?，按步驟C所述離心。E.吸去上清，打開離心管。置于操作臺上數(shù)分鐘，揮發(fā)去除殘留乙醇，將DNA溶于適當(dāng)體積的TE（pH8.0）中。純化大片段（>20kb）A.將瓊脂糖酶消化過的樣品移至一透析袋中，扎好或封好后將透析袋放在含100mlTE(pH8.0)的燒杯或三角瓶中。B.4C透析樣品數(shù)小時。為防止大片段DNA的斷裂損傷，應(yīng)盡可能避免酚抽提、渦旋以及乙醇沉淀。在透析緩沖液中加入30M的精胺和70M的亞精胺可提高大分子DNA的回收效率。4、凝膠切槽法1、待各DNA條帶在膠上完全分開后，關(guān)掉電泳儀，取出膠板，在緊靠目的條帶正前方的泳道上用刀片挖一個長方形的小槽，注意切勿將槽的底部挖開，底部應(yīng)保留一薄層膠。2、將電泳槽中的緩沖液倒掉（吸?。┮恍沟镁彌_液不要沒過膠表面。將膠板重新放入電泳，在挖好的槽中加滿15％PEG4000溶液（以電泳緩沖液配制），用手提式紫外燈實(shí)時監(jiān)控目的條帶，直至目的條帶完全進(jìn)入挖好的槽中。3、關(guān)閉電泳儀，用移液器小心將膠槽里的含目的DNA片段的PEG溶液吸出，加入一個新的離心管中。4、酚：氯仿抽提1－2次。5、無水乙醇沉淀和70％乙醇洗滌步驟同方法1（有機(jī)試劑抽提）中的步驟。優(yōu)點(diǎn)：不需LMTAgarose，步驟少，