人教版教學(xué)教案生物：專題五DNA蛋白質(zhì)技術(shù)(新課標(biāo)選修一)

專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)【課題目標(biāo)】本課題通過嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNADNA的物理化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取以及DNA鑒定的原理?！菊n題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。課題難點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法?！緦W(xué)問要點(diǎn)】DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是DNA的溶解性；2.二苯胺法鑒定DNA的方法和原理。[學(xué)習(xí)導(dǎo)航]DNADNA的提取、蛋白質(zhì)的提取、DNA片段的擴(kuò)增等，是開展分子生物學(xué)爭辯的根本技術(shù)。本專題將從根底入手，學(xué)習(xí)DNA的粗提取、PCR技術(shù)和血紅蛋白的提純。學(xué)習(xí)這些技術(shù)，不僅能夠幫助學(xué)生初步了解分子生物學(xué)的根本試驗(yàn)方法，而且能夠穩(wěn)固必修課中學(xué)習(xí)的有關(guān)DNA和蛋白質(zhì)的理論學(xué)問。3個(gè)課題相對(duì)獨(dú)立，沒有嚴(yán)格的先后挨次。課題1的操作難度不高，學(xué)生比較簡潔獲2的操作難度也不高，但PCR技術(shù)的原理是難點(diǎn)，學(xué)生要充分利用教材的圖文資料，并且在教師的引導(dǎo)下進(jìn)展試驗(yàn)操作。課題3的操作難度比較大，所以學(xué)生肯定要在教師的細(xì)心指導(dǎo)下完成操作。課題1 DNA的粗提取與鑒定[導(dǎo)學(xué)誘思]提取DNA的方法提取生物大分子的根本思路是 。對(duì)于DNA的粗提取而言，就是要利用 、 等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。DNA的溶解性DNA這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以到達(dá)分別目的。5—1是DNANaCl溶液中的溶解度曲線，請(qǐng)依據(jù)曲線圖，思考：①在什么濃度下，DNA的溶解度最??？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？②如何通過把握NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于 溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分別。DNA對(duì)酶、高溫存洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是對(duì) 沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60—80oC的高溫，而DNA在 以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解 ，但對(duì)DNA沒有影響。DNA的鑒定 在 條件下，DNA遇 會(huì)被染成 色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)材料的選取 但凡含有 的生物材料都可以考慮，但是使用 的生物組織，成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的試驗(yàn)材料：魚卵、豬肝、菜花〔花椰菜、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培育基的大腸桿菌思考：哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞的特點(diǎn)？裂開細(xì)胞，獵取含DNA的濾液動(dòng)物細(xì)胞的裂開比較簡潔，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中參加肯定量的 ，同時(shí)用 攪拌，過濾后收集濾液即可。假照試驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用 溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的 DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中參加肯定的和 ，進(jìn)展充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。思考：①為什么參加蒸餾水能使雞血細(xì)胞裂開？②參加洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？③假設(shè)研磨不充分，會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？去除濾液中的雜質(zhì) 閱讀課本的三個(gè)方案，思考：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？方案二與方案三的原理有什么不同？DNA的析出與鑒定將處理后的溶液過濾，參加與濾液體積、冷卻的，靜置，溶液中會(huì)消滅 ，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。20ml的試管，各參加物質(zhì)的量濃度為的NaCl5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各參加4ml的?；旌暇鶆蚝?，將試管置于中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變。操作提示以血液為試驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要參加3g ，防止 。參加洗滌劑后，動(dòng)作要、，否則簡潔產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。參加酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要，以免 ，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。二苯胺試劑要 ，否則會(huì)影響鑒定的效果。結(jié)果分析與評(píng)價(jià)[疑難點(diǎn)撥]DNANaCl溶液濃度的關(guān)系：NaCl0.14mol/L時(shí)，隨濃度的上升，DNANaCl溶液濃度高0.14mol/L時(shí)，隨濃度上升，DNA的溶解度上升。制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在穎的雞血中參加檸檬酸鈉的緣由制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在穎的雞血中參加抗凝劑——檸檬酸鈉，防止血液凝固。其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發(fā)生反響，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大削減，血液便不DNA后，要棄出上層清液——血漿。提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是肯定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于試驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；其次步是DNA的釋放和溶解，這一步是試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即依據(jù)DNA的溶解DNADNA進(jìn)展鑒定，這是對(duì)整個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。在DNA的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時(shí)，留意動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。5．盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞裂開以后釋放出的DNA，簡潔被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNADNA就會(huì)更少。因此，試驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以削減提取過程的DNA的損失。[典例解析]本試驗(yàn)中有三次過濾：⑴過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液0.14mol/LNaCl溶液⑶過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次過濾分別為了獲得〔 〕A含核物質(zhì)的濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液B含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液C含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布上的DNAD含較純的DNA濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液答案：A解析:用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜裂開，釋放出核物質(zhì)，此時(shí)過濾只能得到含DNA和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必需經(jīng)過試驗(yàn)中其他步驟得相繼處理，方能得到較純的DNA。DNA0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經(jīng)過濾留在紗布上?！菊n本問題答案和提示】〔一〕旁欄思考題為什么參加蒸餾水能使雞血細(xì)胞裂開？答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的裂開(細(xì)胞膜和核膜的裂開)，從而釋放出DNA。參加洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。假設(shè)研磨不充分，會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響試驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。5．為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。6．方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分別?！捕尘毩?xí)答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是肯定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于試驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；其次步是DNA的釋放和溶解，這一步是試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即依據(jù)DNA的DNADNA進(jìn)展鑒定，這是對(duì)整個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是由于，與DNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很簡潔失活；并且蛋白質(zhì)的空間構(gòu)造多種多樣，理化性質(zhì)各不一樣，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能依據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。[課堂演練]一、選擇題〔10個(gè)〕在爭辯DNA的基因樣本前采集來的血樣需要蛋白水解酶處理然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)用蛋白水解酶處理血樣的目的是〔D 〕A.除去血漿中的蛋白質(zhì) B.除去染色體上的蛋白質(zhì) C.除去血細(xì)胞外表的蛋白質(zhì)D.除去血細(xì)胞中的全部的蛋白質(zhì)，使DNA釋放，便于進(jìn)一步提純與析出DNA粘稠物有關(guān)的表達(dá)，不正確的選項(xiàng)是〔C 〕操作時(shí)緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶解度在操作A時(shí)，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整加蒸餾水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度，兩者均可析出D.當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時(shí)，此時(shí)NaCl的濃度相當(dāng)于0.14mol/L3．洗滌劑能夠瓦解〔B ，但對(duì)DNA沒有影響。A.細(xì)胞壁 B.細(xì)胞膜 C.細(xì)胞核 D.細(xì)胞質(zhì)4．在沸水浴的條件下，DNA遇〔D 〕會(huì)被染成藍(lán)色。A.斐林試劑 B.蘇丹Ⅲ染液 C.雙縮脲試劑 D.二苯胺5．在DNA提取過程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是〔B 〕A.不易裂開 B.削減提取過程中DNA的損失C.增加DNA的含量 6．以下操作中，對(duì)DNA的提取量影響最小的是〔B 〕A.使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分裂開，放出DNA等核物質(zhì)B.攪拌時(shí)，要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌C.在“析出DNA粘稠物”時(shí)，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻E在DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢鐳NA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的〔D ，靜置—3mi，溶液中會(huì)消滅白絲狀物。A.0．9%的NaCl B.0.14mol/L的NaCl溶液C.質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的HCl D.體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液以血液為試驗(yàn)材料時(shí)，需要向血液中參加〔C ，防止血液凝固。醋酸鈉 B.龍膽紫 C.檸檬酸鈉 D.醋酸洋紅在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷參加蒸餾水的目的是〔C 〕加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質(zhì)的速度 C.削減DNA的溶解度加快DNA析出 D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出去除濾液中的雜質(zhì)時(shí)，直接在濾液中參加嫩肉粉，利用嫩肉粉中的〔C 〕分解蛋白質(zhì)。A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 二、非選擇題〔3個(gè)〕提取雞血中DNA時(shí)，要除去血液中的上清液，這是由于什么？NA提取雞血中的DNA時(shí)，要除去血液中的上清液。填寫本試驗(yàn)完成以下試驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。⑴提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì)⑵溶解核內(nèi)DNA：2mol/LNaCl溶液中的DNA⑷DNA粘稠物的再溶解⑸提取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物⑹DNA的鑒定2mol/LNaCl2mol/LNaCl95的酒精⑹二苯胺關(guān)于DNA緣由是什么？請(qǐng)答復(fù)以下問題：⑴雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞 ，家雞屬于鳥類，陳代謝旺盛，因而血液中 細(xì)胞樹木較多，可以供給豐富的 。⑵試驗(yàn)前由教師制備血細(xì)胞液供同學(xué)們做試驗(yàn)材料，而不用雞全血，主要緣由是。⑶生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較便利，假設(shè)他們按試驗(yàn)要求完成試驗(yàn)步驟后，結(jié)果是 ，這是由于這些動(dòng)物和人一樣，成熟的紅細(xì)胞中 ，但假設(shè)改用動(dòng)物肝臟做試驗(yàn)材料，試驗(yàn)?zāi)茼槷?dāng)進(jìn)展。這是由于 。⑷假設(shè)選用動(dòng)物肝臟做試驗(yàn)材料，在提取之前，最好增加 程序，使組織細(xì)胞更易分別。答案：⑴含細(xì)胞核；紅DNA ⑵雞血細(xì)胞液DNA相對(duì)含量⑶很難提取DN；無細(xì)胞核；肝細(xì)胞有細(xì)胞核⑷研磨【學(xué)問拓展】二苯胺鑒定DNA的化學(xué)原理DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ(溶液呈淺藍(lán)色)。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。研磨液中幾種藥品的作用Tris/HCl:供給緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)〔Tris為三羥甲基氨基甲烷。EDT〔乙二胺四乙酸二鈉：是DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞裂開后DNA酶降解DNSD〔十二烷基磺酸鈉：可以使蛋白質(zhì)變性，與DNA分別?！窘虒W(xué)反思】課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U(kuò)增DNA片段【課題目標(biāo)】本課題通過嘗試PCR〔DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒错憽臣夹g(shù)的根本操作，使學(xué)生體驗(yàn)PCR這一常規(guī)的分子生物學(xué)試驗(yàn)方法，理解PCRPCR【課題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：PCR的原理和PCR課題難點(diǎn)：PCR參與的組分解旋酶DNA母鏈DNA復(fù)制中的作用合成子鏈的原料參與的組分解旋酶DNA母鏈DNA復(fù)制中的作用合成子鏈的原料DNA聚合酶引物DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為，而磷酸基團(tuán)的末端稱為。DNA聚合酶不能開頭合成DNA，而只能 ，因此，DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是 。在DNA的復(fù)制過程中，復(fù)制的前提是 。在體外可通過把握來實(shí)現(xiàn)。在 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋構(gòu)造將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為 。PCR利用了DNA的 原理，通過把握溫度來把握雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來 的DNA聚合酶的覺察和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。PCR反響需要在肯定的緩沖溶液中供給： ， ，， ，同時(shí)通過把握溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)展。PCR的反響過程PCR一般要經(jīng)受循環(huán)，每次循環(huán)可以分為、和三步。從其次輪循環(huán)開頭，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反響，并且由 延長而成的DNA單鏈會(huì)與結(jié)合，進(jìn)展DNA的延長，這樣，DNA聚合酶只能，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。試驗(yàn)操作在試驗(yàn)室中，做PCR通常使用 ，它是一種薄壁塑料管。具體操作時(shí)，用微量移液器按PCR反響體系的配方在中依次參加各組分再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序即可。操作提示為避開外源DNA等因素的污染，PCR試驗(yàn)中使用的 、 、 以及蒸餾水等在使用前必需進(jìn)展 。PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢溶化。在微量離心管中添加反響成分時(shí)，移液管上的槍頭要 。[疑難點(diǎn)撥]PCR技術(shù)簡介PCR是一種體外快速擴(kuò)增DNADNA上百萬份的DNADNA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)展分析爭辯的問題，被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等各方面。細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用①解旋酶：翻開DNA雙鏈②DNA母鏈：供給DNA復(fù)制的模板③4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈⑤引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3端開頭連接脫氧核苷酸〔引物是一小段DNA或RNADNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。用于PCR20—30個(gè)核苷酸〕DNA的合成方向DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA3，端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5，DNA聚合酶不能從頭開頭合成DNA3，端延長DNADNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA3，端開頭延長DNA鏈，DNA5，3，端延長。PCR的反響過程PCR〔90oCDNA解聚為單鏈、復(fù)性〔溫度下降到50oC左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合〕和延長〔溫度上升到72oC左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成的DNA鏈〕三步。從其次輪循環(huán)開頭，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反響，并且由引物Ⅰ延長而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)展DNA的延長，這樣，DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制PCRDNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)展。PCRDNA復(fù)制，所以有關(guān)PCR反響的題目與DNA復(fù)制的原理一樣，計(jì)算方法也大體一樣。例如：PCR反響中的目的2nnDNA30次循環(huán)后反響物中大約有10〔230〕[典例解析]]一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培育，利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子總數(shù)的〔 〕A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25答案：CDNA分子利用PCR5次后產(chǎn)生的DNA2nDNA的復(fù)制是半保存復(fù)制，其特點(diǎn)是：形成的DNA雙鏈，一條是來自親代DNA分子的母鏈，另一條是形成的子15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后，其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代DNA分子中，這樣兩個(gè)子代DNA分子被標(biāo)記了。以后均是在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培育，不管經(jīng)過多少次復(fù)制，最DNAnDNA2/2n,即1/2n-1?！菊n本問題答案和提示】練習(xí)提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR2nnDNA3010〔2n=230=1073741824)。提示：PCR引物是依據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來設(shè)計(jì)的。引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生物學(xué)試驗(yàn)閱歷，感興趣的學(xué)生可以參考《分子克隆試驗(yàn)指南》〔見本專題參考書目〕，書中有詳盡的論述?！菊n堂演練】一．選擇題〔10個(gè)〕DNA分子復(fù)制時(shí)，解旋的兩條鏈中〔C 〕A僅一條作為復(fù)制模板B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)一樣的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條鏈結(jié)合成一個(gè)全的DNA分子以下關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確挨次是〔D〕①互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂②互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進(jìn)展堿基互補(bǔ)配對(duì)⑤子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀構(gòu)造A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤3.以下各項(xiàng)過程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”的有〔A 〕①DNA復(fù)制②RNA復(fù)制③轉(zhuǎn)錄④翻譯⑤逆轉(zhuǎn)錄A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤4.試驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是〔D 〕①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧利用PCR技術(shù)，把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代經(jīng)過3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？〔A 〕A 2 B 4 C 8 D 16，關(guān)于DNA分子的表達(dá)中，正確的選項(xiàng)是〔C〕A.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性一樣，同向平行 B.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性一樣，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性不同，同向平行假設(shè)PCR反響中，只有一個(gè)DNA的片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在30次循環(huán)后，反響物中大約有多少這樣的DNA片段〔B 〕A 215 B 230 C 260 D 231DNA的合成方向總是〔C 〕延長。A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端要使PCR反響在體外的條件下順當(dāng)?shù)剡M(jìn)展，需要嚴(yán)格的把握〔C 〕A氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D大氣的濕度DNA分子經(jīng)PCR反響循環(huán)一次后，合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與〔 〕A模板母鏈一樣 B非模板母鏈一樣 C兩條模板母鏈一樣D兩條模板母鏈都不一樣二．非選擇題〔2個(gè)〕PCR技術(shù)是把某一DNA片段在試驗(yàn)條件下，合成許很多多一樣片段的一種方法，利用這種技能快速而特異的擴(kuò)增任何要求的目的基因或者DNA分子片段到這種技術(shù)。請(qǐng)結(jié)合有關(guān)學(xué)問，答復(fù)有關(guān)此技術(shù)的一些問題：⑴PCR技術(shù)能把某一DNA片段進(jìn)展擴(kuò)增，依據(jù)的原理是：⑵在試驗(yàn)條件下，DNA分子進(jìn)展擴(kuò)增，除了所要擴(kuò)增的DNA片段處，還需要 和 、 等條件。DNA16035個(gè)，假設(shè)讓該DNA分子擴(kuò)增三次〔即復(fù)制三次〕至少需要腺嘌呤脫氧核苷酸和鳥嘌呤脫氧核苷酸的數(shù)目分別是 和 個(gè)。答案：⑴DNADNA分子中堿基的互補(bǔ)配對(duì)⑵四種脫氧核苷酸、能量、酶⑶245、31515NDNA15N標(biāo)記。然后將被15N標(biāo)記的大腸桿菌作為親代轉(zhuǎn)到一般培育基中，生殖兩代。親代、第一代、其次代大腸桿菌DNA的狀況如下圖。⑴第一代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息與親代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息完全一樣的緣由是 。⑵假設(shè)將其次代大腸桿菌的DNA分子總量作為整體1，其中，帶有15N的其次代大腸桿菌DNA分子約占總量的 %。⑶假設(shè)將其次代大腸桿菌的DNA115N標(biāo)記的其次代大腸桿菌的DNA含量〔脫氧核苷酸單鏈〕約占總量的 %1N標(biāo)記的DNA雙鏈的每條鏈為模板50⑶25【參考資料】瓊脂糖凝膠濃度與DNA分別范圍的關(guān)系凝膠濃度要依據(jù)DNA16srRNADNA15004-11％〔1g/100mL，下同〕的凝膠濃度。4-1DNA0.30.60.70.91.21.512.0

kb)5～601～200.8～100.5～70.9～60.2～30.1～2核酸電泳緩沖液核酸電泳緩沖液有三種，分別是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三種緩沖液中：TBETPE緩沖液容量高，對(duì)DNA的分別效果好，但TPEDNA沉淀。TAE液的緩沖容量低，價(jià)格較廉價(jià)。本試驗(yàn)選用的是TBE緩沖液。緩沖液EDTADNAPCR10倍濃縮的TBETris 108g EDTA9.3g硼酸 55g1000mLpH8.0～8.210倍。核酸電泳的指示劑與染色劑核酸電泳常用的指示劑是溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)在堿性條件下呈藍(lán)紫色。指示劑一般與蔗糖、甘油或400DNA內(nèi)；能夠在電泳中形成肉眼可見的藍(lán)紫色指示帶，從而幫助推測(cè)核酸電泳的速度和位置；能夠使樣品呈現(xiàn)藍(lán)紫色，使加樣操作更便利。核酸電泳后，需要染色才能在紫外線下觀看到帶型。最常用的染色方法是溴化乙錠染色法。溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，有劇毒，因此操作時(shí)要格外留神。EB可嵌入DNA在紫外線激發(fā)下，能發(fā)出紅色熒光。染色的方法有兩種。一種是在凝膠電泳液中參加EB，使其終濃0.5μg/mL0.5μg/mLEB10～15min。當(dāng)凝膠染色過深時(shí)，可以將凝膠放入蒸餾水中浸泡30minPCRPCRTaqDNA活力不夠或其活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)的建立欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠；等等。當(dāng)試驗(yàn)中消滅假陰性的狀況時(shí)，應(yīng)首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再參加TaqDNA5～10TaqDNA用活力高、質(zhì)量好的酶。同時(shí)，在提取DNA模板時(shí)，應(yīng)特別留意避開提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。盡管TaqDNAPCRDNA3′端與靶基因互補(bǔ)。PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成非目標(biāo)DNA片段的大量擴(kuò)增，因此模板DNA的污染是PCR假陽性結(jié)果的主要緣由。此外，樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽性結(jié)果。為了避開因污染而造成的假陽性結(jié)果，PCR操作時(shí)要留意做到：隔離操作區(qū)，分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性吸頭等【教學(xué)反思】課題3 血紅蛋白的提取和分別【課題目標(biāo)】子的根本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分別生物大分子的根本原理，為今后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下根底。【課題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法。課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填?！緦?dǎo)學(xué)誘思】凝膠色譜法路程，移動(dòng)速度；而相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在移動(dòng)，路程，移動(dòng)速度。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因凝膠色譜法也稱做 ，是依據(jù) 分別蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有很多貫穿的通道，相對(duì)分子質(zhì)量路程，移動(dòng)速度；而相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在移動(dòng)，路程，移動(dòng)速度。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分別。緩沖溶液緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進(jìn)展的各種生物化學(xué)反響都是在一定的pH下進(jìn)展的，例如：血漿的pH是 ，要在試驗(yàn)條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，必需保持體外的pH與體內(nèi)的根本全都。電泳電泳是指 很多重要的生物大分子如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在肯定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子以及分子本身的、的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分別。兩種常用的電泳方法是 和 ，在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于以及 等因素。蛋白質(zhì)的提取和分別蛋白質(zhì)的提取和分別一般分為四步： 、 、 和 。樣品處理血液由 和 組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種格外重要的蛋白質(zhì) ，其作用是，血紅蛋白有個(gè)肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈圍繞一個(gè)，磁基團(tuán)可攜帶 。血紅蛋白因含有呈現(xiàn)紅色。紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是 ，采集的血樣要準(zhǔn)時(shí)承受 分別紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透亮的，將下層暗紅色的倒入燒杯，再參加 ，緩慢攪拌，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至 ，說明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放在和作用下，紅細(xì)胞裂開釋放出血紅蛋白。分別血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透亮的 ，第2層為白色薄層固體，是 ，第3層是紅色透亮液體，這是 ，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透亮液體。透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入中將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的中，透析12h。透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的。凝膠色譜操作第一步要制作 ，其次步要 ，由于 ，所以裝柱前需要依據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有存在。由于氣泡會(huì) ，降低分別效果。第三步是。【疑難點(diǎn)撥】1．凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法也稱為安排色譜法，它是依據(jù)分子量的大小分別蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有很多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)展兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無規(guī)章的集中運(yùn)動(dòng)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較簡潔進(jìn)入相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最終流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀構(gòu)造，相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀構(gòu)造上的空襲時(shí)阻力大，而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分別。2．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)展蛋白質(zhì)的分別的意義哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分別時(shí)可以通過觀看顏色來推斷什么時(shí)候應(yīng)當(dāng)收集脫液。這使血紅蛋白的分別過程格外直觀，大大簡化了試驗(yàn)操作。電泳的作用及其原理蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的用待分別樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、外形等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而到達(dá)對(duì)樣品進(jìn)展分別、鑒定或提純的目的。【典例解析】用凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)〔D 〕A路程較長，移動(dòng)速度較慢B路程較長，移動(dòng)速度較快C路程較短，移動(dòng)速度較慢D路程較短，移動(dòng)速度較快解析：在小球體內(nèi)部有很多貫穿的通道，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快?！菊n本問題答案和提示】〔一〕旁欄思考題你能從凝膠色譜的分別原理分析為什么凝膠的裝填要嚴(yán)密、均勻嗎？答：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有很多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最終流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分別。假設(shè)凝膠裝填得不夠嚴(yán)密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流淌次序，影響分別的效果。〔二〕練習(xí)答：凝膠色譜法也稱為安排色譜法，它是依據(jù)分子量的大小分別蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有很多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)展兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無規(guī)章的集中運(yùn)動(dòng)。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最終流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀構(gòu)造，相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀構(gòu)造上的空隙時(shí)阻力大，而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分別。pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物〔緩沖劑〕溶解于水中制得，調(diào)整緩沖劑的配比就可制得不同pH緩沖溶液的作用是維持反響體系的pH不變。在生物體內(nèi)進(jìn)展的各種生物化學(xué)過程都是在準(zhǔn)確的pH下進(jìn)展的，受到氫離子濃度的嚴(yán)風(fēng)格控。為了在試驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的自然環(huán)境，就必需保持體外生物化學(xué)反響過程有與體內(nèi)過程完全一樣的pH。答：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。很多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分別樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、外形等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而到達(dá)對(duì)樣品進(jìn)展分別、鑒定或提純的目的。答：血紅蛋白提取和分別的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分別、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分別；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最終經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)展純度鑒定。答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分別時(shí)可以通過觀看顏色來推斷什么時(shí)候應(yīng)當(dāng)收集洗脫液。這使血紅蛋白的分別過程格外直觀，大大簡化了試驗(yàn)操作。[課堂演練]一．選擇題1．凝膠色譜法是依據(jù)〔B 〕分別蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小 B相對(duì)分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度2．緩沖液的作用是：在肯定范圍內(nèi)，抵抗外界的影響來維持〔B 〕根本不變。A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷〔B〕的電極移動(dòng)。A一樣 B相反 C相對(duì) D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的〔A 〕與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中〔C 〕的含量最多。A白細(xì)胞 B血小板 C紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先參加抗凝血?jiǎng)睤 。A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是〔C 〕A無色透亮的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物二．非選擇題電泳利用了待分別樣品中各種分子 以及 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分別。答案：帶電性質(zhì)的差異；分子本身的大小；外形的不同你能描述血紅蛋白分別的完整過程嗎？答案：血紅蛋白提取和分別的程序可分為四大步。包括：樣品處理、粗分別、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；在經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分別；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最終經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)展純度鑒定。參考資料聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度試劑的配制N,N29%〔29g/100mL，下同〕的丙烯1N,N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。由于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中會(huì)分別緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一反響是由光或堿催化的。因此在每次使用前，應(yīng)核實(shí)溶液的pH不7.0；并且應(yīng)將配制好的溶液置于棕色瓶中，室溫貯存，每隔幾個(gè)月須重配制。十二烷基硫酸鈉〔SDS〕用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。用于制備分別膠和濃縮膠的Tris緩沖液1.5mol/L、pH8.8Tris〔分別膠緩沖液〕；1mol/L、pH6.8Tris〔濃縮膠緩沖液〕。TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)TEMED胺與雙丙烯酰胺的聚合。過硫酸銨用去離子水配制10%的過硫酸銨溶液。過硫酸銨供給驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制穎液。Tris—甘氨酸電泳緩沖液25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1SDS。樣品處理液50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2SDS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油。染色液0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脫色液1010%的冰醋酸。必需在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)展。TEMED和過硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進(jìn)展電泳操作時(shí)肯定依據(jù)試驗(yàn)要求和步驟，在教師的指導(dǎo)下完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。電泳依據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板。SDS4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris2.5mL，10SDS0.1mL，10%的過硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，0.5cm)，再在膠液面上留神注入一層水〔約高2～3mm〕，以阻擋氧氣進(jìn)入凝膠溶液。分別膠聚合完全后〔30min〕，傾出掩蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。SDS2.7mL，300.67mL，1.0mol、pH6.8Tris0.5mL，10SDS0.041mL，100.04mL，TEMED0.004mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分別膠上，并馬上在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過程應(yīng)留意避開氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其布滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。1∶1體積比參加樣品處理液，1003min，以使蛋白質(zhì)變性。濃縮膠聚合完全后〔30min〕，留神移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各參加Tris—甘氨酸電泳緩沖液。必需設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。按挨次加樣，加樣量通常為10～25μL。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞裂開后(即進(jìn)展凝膠色譜分別之前)的樣品和凝膠色譜分別之后的樣品。將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分別膠后，把電壓15V/cm，連續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分別膠底部上方約1cm從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔〔第一槽〕凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1～2h3～10h，其間需屢次更換脫色液至背景清楚。脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料袋內(nèi)使其不會(huì)降低染色強(qiáng)度。為保存永久性記錄，可對(duì)凝膠進(jìn)展拍照，或?qū)⒛z枯燥成膠片。通過本試驗(yàn)的電泳圖譜，可以觀察提取的血紅蛋白的純度并不是很高?！窘虒W(xué)反思】專題學(xué)問歸納根底學(xué)問：提取DNA的方法試驗(yàn)材料的選取試驗(yàn)設(shè)計(jì)裂開細(xì)胞，獵取含DNA的濾液去除濾液中的雜質(zhì)DNA的粗提取與鑒定DNA的析出與鑒定以血液為材料要防止血液凝固DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)操作提示棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用結(jié)果分析與評(píng)價(jià)課題延長PCR原理根底學(xué)問 PCR的反響過程多聚酶鏈?zhǔn)椒? 試驗(yàn)操作應(yīng)擴(kuò)增DNA 操作提示片段 結(jié)果分析與評(píng)價(jià)課題延長凝膠色譜法血紅蛋白的提根底學(xué)問緩沖溶液取和分別電泳樣品處理試驗(yàn)操作凝膠色譜操作SDS—聚丙烯酰凝膠電泳紅細(xì)胞的洗滌試驗(yàn)操作色譜主填料的處理凝膠色譜柱的裝填蛋白質(zhì)的分別結(jié)果分析與評(píng)價(jià)課題延長專題學(xué)問檢測(cè)一、選擇題DNA的溶解度最低時(shí)，NaCl的物質(zhì)的量濃度為〔C〕A.2mol/L B.0.1mol/L C.0.14mol/L D.0.015mol/L2．DNA不溶解于〔C 〕A.NaCl溶液 B.KCl溶液 C.酒精溶液 D.MgCl2溶液3．鑒定DNA的試劑是〔D 〕A.斐林試劑 B蘇丹Ⅲ染液 C.雙縮脲試劑 D.二苯胺試劑4．在向溶解DNA得NaCl溶液中，不斷參加蒸餾水的目的是〔C 〕A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質(zhì)的速度C.減小DNA的溶解度加快DNA析出 D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出在DNA的粗提取過程中，初步析出DNA和提取較純潔的DNA所用的藥品的濃度及其名稱分別是〔B 〕①0.1g/ml檸檬酸鈉溶液②2mol/LNaCl溶液③0.14mol/LNaCl溶液④體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液⑤0.015mol/LNaCl溶液⑥0.04mol/LNaCl溶液A.①③⑤ B.③④ C.②④ D.②③④關(guān)于DNA的粗提取與鑒定試驗(yàn)的表達(dá)哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的〔C 〕離心沉淀的血細(xì)胞中加水是為了提取DNANaCl2mol/L時(shí)，DNA溶解向溶解的DNA燒杯中加蒸餾水是漂洗DNAD.離心后除去血液中的上清液是為了除去雜質(zhì)以下關(guān)于試驗(yàn)現(xiàn)象的正確描述是〔C 〕向盛有果糖溶液的試管中參加斐林試劑，產(chǎn)生轉(zhuǎn)紅色沉淀紙層析法分別葉綠體中的色素時(shí)，濾紙條上最寬的色素帶呈黃綠色C.DNA的粗提取中，其次次參加蒸餾水并攪拌，能析出含DNA的黏稠物D.同一葉片受SO2危害的挨次是先葉柄后葉片關(guān)于