課題分解纖維素的細(xì)菌的分離

專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題3分解纖維素的微生物的分離生物選修1㈠纖維素與纖維素酶1.纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。此外，木材、作物秸稈等也富含纖維素。思考：纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸，但卻不會在地球上大量的積累，為什么？

纖維素能被土壤中某些微生物分解利用，這是因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生纖維素酶。2.纖維素酶

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素①取二支20mL的試管實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失

討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？剛果紅染色法

剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。

（二）纖維素分解菌的篩選

當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案：土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上篩選產(chǎn)生透明圈的菌落①分布環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境中操作步驟

由于生物適應(yīng)一定的環(huán)境，環(huán)境對生物有選擇作用，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。②原因③實(shí)例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。

①目的：說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機(jī)鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無機(jī)鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖維素改為葡萄糖。2、選擇培養(yǎng)②制備選擇培養(yǎng)基：A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C、你能否設(shè)計(jì)一個對照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？P29旁欄思考按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上⑴制備鑒別培養(yǎng)基:配方見書本29頁。操作過程見課題1（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。5.剛果紅染色法方法一：先

，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。方法二：在

時就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物倒平板這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？染色法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法一方法二顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。P29旁欄思考題方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。6、純化培養(yǎng)四、結(jié)果分析與評價

1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2.分離的結(jié)果是否一致

由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法后置染色法富含纖維素土壤增大分解菌含量染色鑒別分離出分解菌課堂總結(jié)1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是（）A.纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B.纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁D.葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖D課堂練習(xí)2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是（）A.剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物B.剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物C.剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D.若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩

選出了纖維素分解菌BD3.纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基有選擇作用，原因在于其含有()A．NaNO3B．KCl

C．酵母膏D．纖維素粉C4.剛果紅染色時，加入剛果紅可在()①制備培養(yǎng)基時②梯度稀釋時③倒平板時④涂布時⑤培養(yǎng)基上長出菌落時

A．①③B．②⑤

C．③⑤D．④⑤5．分離纖維素分解菌的實(shí)驗(yàn)過程中操作有誤的是(

)A．經(jīng)選擇培養(yǎng)后將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上B．富集培養(yǎng)這一步可省略，但培養(yǎng)纖維素分解菌少C．經(jīng)稀釋培養(yǎng)后，用剛果紅染色D．對照組可用同樣量的培養(yǎng)液涂布到不含纖維素的培養(yǎng)基上解析：經(jīng)選擇培養(yǎng)后，再經(jīng)稀釋，才能將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上；富集培養(yǎng)可省略；經(jīng)稀釋培養(yǎng)后，用剛果紅染色；設(shè)置對照能證明經(jīng)富集培養(yǎng)的確得到了欲分離的微生物.A6．下圖為分離并統(tǒng)計(jì)分解纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)流程，據(jù)此回答有關(guān)問題：(1)要從富含纖維素的環(huán)境中分離纖維素分解菌，從高溫?zé)崛袑ふ夷蜔峋?，這說明___________________。根據(jù)目的菌株對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。(2)某同學(xué)根據(jù)需要，配制了纖維素分解菌的培養(yǎng)基如下，整個實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。如果將其中的纖維素粉換成________，菌落數(shù)____________________________，即可說明選擇培養(yǎng)基的作用。纖維素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO45g1g1.2g0.9gMgSO4·7H2OKCl酵母膏、水解酪素0.5g0.5g適量葡萄糖明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)(3)接種微生物最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法，本實(shí)驗(yàn)宜采用________法，原因是________________________________________________________________________。稀釋涂布平板平板劃線法難以根據(jù)稀釋體積計(jì)算每克樣品中的細(xì)菌數(shù)7.有些微生物能合成纖維素酶，通過對這些微生物的研究和應(yīng)用，使人們能夠利用秸稈等廢棄物生產(chǎn)酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。研究人員用化合物A、硝酸鹽、磷酸鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能產(chǎn)生纖維素酶的微生物。分析回答問題：(1)培養(yǎng)基中加入的化合物A是________，為微生物的生長提供________，這種培養(yǎng)基從用途上進(jìn)行分類，應(yīng)屬于________培養(yǎng)基。(2)為了篩選出能產(chǎn)生纖維素酶的微生物，還應(yīng)向培養(yǎng)基中加入________。(3)若用平板劃線法獲得純凈的菌株，請回答：①在接種時，為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都