實(shí)驗七酵母RNA的提取及鑒定

實(shí)驗七酵母RNA的提取及%定姓名：郭沈杰年級專業(yè)：2012級生物科學(xué)同組者：實(shí)驗七酵母RNA的提取及%定一、實(shí)驗?zāi)康恼莆障A法提取酵母RNA的原理和方法。二實(shí)驗原理酵母核酸中RNA含量較多，DNA含量則少于2%。RNA可溶于堿性溶液，當(dāng)堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。用堿液提取的RNA有不同程度的降解。三、實(shí)驗儀器1、 離心機(jī)2、 水浴鍋3、 電爐4、 燒杯5、 量筒6、 移液管7、 玻璃棒8、 濾紙9、 漏斗10、 試劑瓶11、 電子天平12、 pH試紙（pH1~14）實(shí)驗試劑1、 干酵母粉2、 0.2%氫氧化鈉溶液：2g氫氧化鈉溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。3、 乙酸（A.R.）4、 95%乙醇5、 無水乙醚（A.R.）6、 10%硫酸：濃硫酸（比重1.84）10ml，緩緩傾于水中，稀釋至100ml。7、 氨水（A.R.）8、 5%硝酸銀溶液：5g硝酸銀溶于蒸餾水并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中。五、實(shí)驗步驟（-）RNA的瞰:1、 稱取2g干酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%氫氧化鈉溶液10ml，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌（如沸水浴過程中溶液蒸干可再加5~8ml氫氧化鈉）。冷卻，然后加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（pH試紙檢驗，pH5~6），離心10-15分鐘（倒取上清液，加入2倍體積的95%乙醇，邊加邊攪，加畢，靜置，待完全沉淀，過濾。2、 濾渣先用95%乙醇洗2次，每次約5毫升，再用無水乙醚洗2次，每次也約5ml。3、 洗滌時可小心地用玻璃棒攪動沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可鑒定和測定含量用。（二）鑒定：1、 取上述RNA約0.5g，加10%硫酸5ml,加熱至沸1~2分鐘，將RNA水解。2、 水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸銀溶液1ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌吟銀化合物。注意事項：1、 離心管回收2、 離心的時候，要兩兩對稱放置，且離心管中溶液的量基本一樣。否則會遭成離心機(jī)轉(zhuǎn)子的損壞。六、實(shí)驗結(jié)果(-)RNA的提取：加入乙酸使溶液呈酸性，溶液呈土黃色。進(jìn)行離心后，沉淀沉于離心管的下部，上半部分上清液呈土黃色。取上清液，加入2倍體積的95%乙醇后，溶液呈現(xiàn)白色渾濁狀完全渾濁后，上清液呈白色，沉淀為白色。過濾洗滌后，得RNA粗品。（二）鑒定：（1）水解后，溶液呈無色透明狀。加入氨水后，溶液仍澄清，溶液中似有油狀物質(zhì)產(chǎn)生。加入硝酸銀后，仍似有油狀物質(zhì)產(chǎn)生。一段時間后，產(chǎn)生白色絮狀沉淀。（2）取水解液0.5ml，加苔黑酚一三氯化鐵試劑1ml，加熱至沸1min，觀察顏色變化七、 實(shí)驗分析稱取干酵母粉：2.0096g最后得到的RNA粗品：0.034gRNA提取率（%）=RNA質(zhì)量（g）/干酵母粉質(zhì)量（g）x100%本實(shí)驗中RNA提取率（%）=0.0346g/2.0096g=1.722%（稀堿法提取的RNA為變性RNA）本實(shí)驗為定性實(shí)驗，提取酵母中的RNA中，產(chǎn)生白色沉淀時可能因副反應(yīng)產(chǎn)生的其他沉淀，即最終的沉淀中可能混有其他雜質(zhì)，不適于進(jìn)行定量測定。依據(jù)：酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%~10.0%，而DNA含量較少，僅為0.03%~0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡單。八、 實(shí)驗注意事項過濾時，洗滌不能帶水，否則沉淀粘在濾紙上取不下來。有時絮狀沉淀出現(xiàn)較慢,可放十多分鐘。利用等電點(diǎn)控制RNA析出時，應(yīng)嚴(yán)格控pH。稀堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實(shí)驗材料。九、思考題-1、簡述核酸分離純化的一般原則保持核算一級結(jié)構(gòu)的完整性；盡量排除其他分子的污染，保持核酸純度。-2、RNA提取過程中的關(guān)鍵步驟及注意事項有哪些？過濾時，洗滌不能帶水，否則沉淀粘在濾紙