蛋白質(zhì)的合成

第十四章蛋白質(zhì)的合成ProteinSynthesis一、蛋白質(zhì)合成體系二、蛋白質(zhì)的生物合成三、蛋白質(zhì)定位一、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)（一）mRNA（二）遺傳密碼（三）tRNA的結(jié)構(gòu)與功能（四）核糖體（一）mRNA

原核細(xì)胞每個mRNA分子常帶有多個功能相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼信息，以一種多順反子的形式排列，在翻譯過程中可同時合成幾種蛋白質(zhì)；真核細(xì)胞每個mRNA一般只帶一種蛋白質(zhì)編碼信息，是單順反子的形式。真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)

不同的蛋白質(zhì)有各自不同的mRNA，mRNA除含有編碼區(qū)外，兩端還有非編碼區(qū)。非編碼區(qū)對于mRNA的模板活性是必需的，特別是5'-端非編碼區(qū)在蛋白質(zhì)合成中可能是與核糖體結(jié)合的部位。（二）遺傳密碼

遺傳密碼（Geneticcode）：mRNA中蘊藏遺傳信息的堿基順序。

1954年物理學(xué)家Gamov首先對遺傳密碼進(jìn)行探討。提出不可能是一個堿基或兩個堿基決定一個氨基酸（41＝4，42＝16），如果用三個堿基決定一個氨基酸，43＝64，就足以編碼20種氨基酸。密碼子應(yīng)是三聯(lián)體（triplet）。1.遺傳密碼的概念1961年Crick證明三聯(lián)體密碼子學(xué)說是正確的；且非重疊的、連續(xù)編碼無標(biāo)點的。

mRNA分子上以5'→3'方向，從AUG開始每三個連續(xù)的核苷酸（三聯(lián)體）組成一個密碼子(codon)。

mRNA中的4種堿基可以組成64種密碼子。這些密碼代表了20種氨基酸，同時決定了翻譯過程的起始與終止位置。每種氨基酸至少有一種密碼子，最多的有6種密碼子。通過遺傳學(xué)和生物化學(xué)實驗，1966年編排出了遺傳密碼字典。

（1）均聚核苷酸指導(dǎo)均聚肽合成首先，polyU作為模板，加入體外無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中。將翻譯產(chǎn)物分析后，發(fā)現(xiàn)合成的肽鏈中的氨基酸殘基全部是Phe。確認(rèn)了第一個Phe的密碼子（UUU）。接著，polyA和polyC證明是polyLys和polyPro。確定了AAA是Lys的密碼子，CCC是pro的密碼子。2.遺傳密碼的破譯

以A和C原料合成polyAC。polyAC含有8種不同的密碼子：CCC、CCA、CAA、AAA、AAC、ACC、ACA和CAC。實驗中AC共聚物作模板翻譯出的肽鏈由6種氨基酸組成，即Asp、His、Thr、Pro和Lys。根據(jù)共聚物成份不同的比例和翻譯產(chǎn)物中氨基酸比例亦不同的關(guān)系，不能確定A和C的排列方式。

（2）特定共聚核苷酸

在缺乏蛋白質(zhì)合成所需的因子的條件下，特異aa-tRNA可與核糖體-mRNA復(fù)合物結(jié)合。它并不一定需要長的mRNA分子，三核苷酸就可以與核糖體結(jié)合。（3）核糖體結(jié)合技術(shù)遺傳密碼字典3.密碼的基本性質(zhì)

（1）每個密碼子三聯(lián)體(triplet)決定一種氨基酸性質(zhì)相近的氨基酸的密碼子排列較近，這有利于在基因突變時不會引起蛋白質(zhì)功能的變化。（2）兩個密碼子之間無任何核苷酸或其它成分加以分隔，即密碼子間無逗號因此從起始碼AUG開始，三個堿基代表一個氨基酸，從mRNA的5'→3'方向構(gòu)成一個連續(xù)的讀框，直至終止碼。如果在讀框中間插入或缺失一個堿基就會造成移碼突變，引起突變位點下游氨基排列的錯誤。AUG是起始密碼子，也是Met（或者fMet）的密碼子。原核和真核生物肽鏈合成的第一個氨基酸都是Met（或者fMet）；少數(shù)細(xì)菌中也用GUG做為起始碼（起始位點編碼fMet，密碼表中編碼Val）；真核生物偶爾也用CUG作起始蛋氨酸的密碼。密碼子UAA，UAG，UGA是肽鏈成的終止密碼，不代表任何氨基酸，也稱無意義密碼子。（3）起始密碼子和終止密碼子

簡并性：一種氨基酸有幾個密碼子的現(xiàn)象。在64組密碼子中，除UAA、UAG和UGA三組為終止密碼子外，有61組密碼子分別代表20種氨基酸，出Met和Trp只有1個密碼子外，其它氨基酸都有好幾組密碼子。編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。這種現(xiàn)象稱為密碼子的簡并性。同義密碼子的存在減少了由于堿基取代造成的有害突變。此外，不同生物對同義密碼子的使用頻率可能有不同的選擇，在進(jìn)行基因工程操作時應(yīng)考慮選擇最有效的密碼子（也稱偏愛密碼子）。（4）密碼子有簡并性(degeneracy)

通用性：即不論是病毒、原核生物還是真核生物密碼子的含義都是相同的。但真核線粒體的密碼子有例外：線粒體中UGA不是終止密碼子，而編碼Trp。肽鏈內(nèi)的Met由AUG和AUA二個密碼子編碼，起始部位的Met由AUG、AUA、AUU和AGG均可編碼；AGA和AGG不是Arg的密碼子，而是終止密碼子，即UAA、UAG、AGA和AGG均為終止密碼子。

（5）密碼子的通用性（6）密碼與反密碼子的相互

識別——變偶性tRNA上的反密碼子（anticodon）與mRNA密碼子配對時，密碼子的第一位、第二位堿基配對是嚴(yán)格的，第三位可以有一定的變動。即：一般是反密碼子的5'-端堿基與密碼子的3'-端堿基非正規(guī)配對，但能使正確的氨基酸進(jìn)入非正確的密碼子的現(xiàn)象稱為變偶性?！皵[動假說”認(rèn)為：堿基間除標(biāo)準(zhǔn)配對外，還可以有非標(biāo)準(zhǔn)的配對。（三）tRNA的結(jié)構(gòu)與功能

在蛋白質(zhì)生物合成過程中，tRNA主要起轉(zhuǎn)運氨基酸的作用。蛋白質(zhì)生物合成需要一整套tRNA將各種氨基酸按照mRNA上密碼子所決定的順序轉(zhuǎn)運到核糖體上。在蛋白質(zhì)生物合成過程中，特異識別mRNA上起始密碼子的tRNA被稱為起始tRNA，它們參加多肽鏈合成的起始；在多肽鏈延伸中運載氨基酸的tRNA，稱為延伸tRNA。

通常將tRNA所轉(zhuǎn)運的氨基酸標(biāo)在右上角，如tRNACys表示轉(zhuǎn)運Cys的tRNA。原核細(xì)胞內(nèi)約有60種不同的tRNA，真原核細(xì)胞內(nèi)則多達(dá)100-120種。運輸同一種氨基酸的不同tRNA稱為同工受體tRNA。蛋氨酸雖只有一組密碼子（AUG）卻至少有兩種tRNA，一種負(fù)責(zé)將運到肽鏈中間，用tRNAmMet表示；另一種攜帶甲酰蛋氨酰參與蛋白質(zhì)合成的起始，用tRNAfMet表示；真核細(xì)胞的起始tRNA表示為tRNAiMet，攜帶甲酰蛋氨酰參與起始作用，用于肽鏈延伸的則表示為tRNAMet。1.tRNA的二級結(jié)構(gòu)的特點（1）3'端含CCA-OH序列

氨基酸接在腺苷酸殘基(A)上，CCA-OH序列稱為氨基酸接受臂(aminoacidacceptorarm)。

3'-端第5~11位核苷酸與5'-端第1~7位核苷酸形成螺旋區(qū)，稱為氨基酸接受莖(aminoacidacceptorstem)。

（2）TψC環(huán)；TψC環(huán)由7個堿基組成，參與tRNA與核糖體表面的結(jié)合。（3）額外環(huán)或可變環(huán)(extrovariableloop)。堿基種類和數(shù)量（3~18個堿基）高度可變，并富含稀有堿基。（4）反密碼子環(huán)(anti-cordonloop)。由7個堿基組成，處于中間位的3個堿基為反密碼子。反密碼子可與mRNA中的密碼子結(jié)合。毗鄰反密碼子的3'端堿基往往為烷化修飾嘌呤，其5'端為U，即：U-反密碼子-修飾嘌呤。

（5）二氫尿嘧啶環(huán)(D-loop)由8~12個堿基組成，含有2±1個修飾的堿基(D)。（6）TψC環(huán)、反密碼子環(huán)和二氫尿嘧啶分別連接在由4~5個堿基組成的螺旋區(qū)上，依次稱為TψC莖，反密碼子莖和二氫尿嘧啶莖。

15~16個固定堿基幾乎全部位于這些環(huán)上。

（三）核糖體

核糖體(ribosome，核蛋白體）是由rRNA和蛋白質(zhì)組成的亞細(xì)胞顆粒，位于胞漿內(nèi)。一類核糖體附著于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與分泌性蛋白質(zhì)的合成。一類游離于胞漿，參與細(xì)胞固有蛋白質(zhì)的合成。1.rRNA

組成核糖體的rRNA為單股鏈，可自行折疊形成螺旋區(qū)和環(huán)區(qū)，所有螺旋區(qū)的堿基都是保守的。所有來源rRNA均能形成4個結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，每個結(jié)構(gòu)域均含許多莖和環(huán)，它們通過堿基對的相互反應(yīng)彼此靠近；絕大多數(shù)的rRNA堿基的特異功能尚不清楚。2.蛋白質(zhì)大多數(shù)蛋白呈纖維狀，只有少數(shù)呈球狀。3.核糖體的結(jié)構(gòu)模型4.核糖體的結(jié)合位點

（1）mRNA結(jié)合位點：位于30s小亞基頭部，負(fù)責(zé)與mRNA的結(jié)合，特別是16srRNA的3'-端與mRNA的AUG之前的一段序列互補(bǔ)是這種結(jié)合必不可少的。

（2）A位點：（Aminoacyl-tRNAsite）是結(jié)合新進(jìn)入的氨基酰-tRNA的位置。即氨基酰-tRNA位或受位。它大部分位于大亞基，而小部分位于小亞基，（3）P位點：（peptidyl-tRNAsite）是結(jié)合起始tRNA并向A位給出氨基酸的位置。又稱肽?；?tRNA位或給位。它大部分位于小亞基，小部分位于大亞基。5.多核糖體（Polysomes）原核生物的翻譯和轉(zhuǎn)錄是相偶連的

由一個分子與一定數(shù)目的單個核糖體結(jié)合形成多核糖體，每個多核糖體獨立完成一條多肽鏈的合成，極大提高了翻譯的效率。

多核糖體正處于工作狀態(tài)，游離的單核糖體則是貯備狀態(tài)，核糖體亞基是剛從mRNA上釋放的，核糖體在這三種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換稱為核糖體循環(huán)。二、蛋白質(zhì)的生物合成

蛋白質(zhì)生的合成（翻譯，Translation）是把mRNA分子中堿基排列順序轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)中的氨基酸排列順序的過程。參與蛋白質(zhì)生物合成的成份至少有200種，主要由mRNA、tRNA、核糖體以及有關(guān)的酶和蛋白因子組成。

蛋白質(zhì)是由20種氨基酸合成的。某些蛋白質(zhì)中含有羥脯氨酸、羥賴氨酸、γ-羧基谷氨酸等，都是在肽鏈合成后的加工修飾過程中形成的。氨基酸在核糖體上縮合成多肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^核糖體循環(huán)而實現(xiàn)的。此循環(huán)可分為肽鏈合成的起始(initiation)，肽鏈的延伸(elongation)和肽鏈合成的終止(termination)三個過程。1.氨基酸的激活與氨酰-tRNA的合成

在蛋白質(zhì)生物合成中，各種氨基酸在參入肽鏈之前必須先經(jīng)活化，然后再由其特異的tRNA攜帶至核糖體上，才能以mRNA為模板縮合成肽鏈。氨基酸活化后與相應(yīng)的tRNA結(jié)合的反應(yīng)，是由特異的氨酰tRNA合成酶催化的。

每種氨基酸都只有一種氨酰tRNA合成酶(aaRS)。因此細(xì)胞內(nèi)有20種氨酰tRNA合成酶。

aaRS具有高度的特異性，它既能識別特異的氨基酸，又能識別攜帶該氨基酸的特異tRNA。

aaRS對氨基酸有嚴(yán)格的特異性，而對與此氨基酸相適應(yīng)的數(shù)種同工tRNA則無嚴(yán)格的特異性。

原核生物先合成此物質(zhì)甲酰蛋氨酰-tRNA2.肽鏈合成的起始

（1）三元復(fù)合物(trimercomplex)的形成在起始因子3(IF3)介導(dǎo)和IF-1促進(jìn)下，核糖體30S小亞基附著于mRNA的起始信號部位，形成IF3-30S亞基-mRNA三元復(fù)合物。mRNA上位于AUG的上游8~13個核苷酸處有一短的SD序列（Shine-Dalgarno，核糖體結(jié)合序列），它與30S小亞基16SrRNA的3'端部分序列互補(bǔ)，是核糖體結(jié)合位點。

SD序列可使核糖體選擇mRNA上AUG的正確位置起始肽鏈合成。

（2）30S前起始復(fù)合物的形成在IF2作用下，fMet-tRNAMet與mRNA分子中的起始密碼子(AUG或GUG)相結(jié)合（密碼子與反密碼子反應(yīng)）。同時IF3從三元復(fù)合物脫落，形成30S前起始復(fù)合物：

IF2-30S亞基-mRNA-fMet-tRNAMet復(fù)合物。

（3）70S起始復(fù)合物形成

50S亞基與30S前起始復(fù)合物結(jié)合，同時IF2脫落，形成70S起始復(fù)合物：30S亞基-mRNA-50S亞基-fMet-tRNAMet復(fù)合物。起始2.肽鏈的延長

肽鏈的延長包括：進(jìn)位、肽鍵形成、脫落和移位等過程。肽鏈合成的延長需兩種延長因子(Elongationfactor，EF）EF-T和EF-G以及GTP供能。

（1）進(jìn)位在GTP、EF-T等參與下，新的氨酰-tRNA進(jìn)入50S大亞基A位，并與mRNA分子上相應(yīng)的密碼子結(jié)合。（2）肽鍵形成在大亞基上肽酰轉(zhuǎn)移酶催化下，P位點上tRNA攜帶的甲酰蛋氨?；?或肽?；?轉(zhuǎn)移給A位上新進(jìn)入的氨基酰-tRNA的氨基酸，即P位上的氨基酸(或肽的3'端氨基酸)的α-COOH基，與A位上的氨基酸的α-NH2基形成肽鏈。

（3）脫落并移位在EF-G和GTP的作用下，核糖體沿mRNA鏈(5'→3')相對移動。每次移動相當(dāng)于一個密碼子的距離，使下一個密碼子能準(zhǔn)確定位于A位點。原來處于A位點上的二肽酰tRNA轉(zhuǎn)移到P位點上，空出A位點。

隨后再依次進(jìn)位、肽鍵形成、脫落和移位進(jìn)行下一循環(huán)。延長過程每重復(fù)一次，肽鏈延伸一個氨基酸殘基，多次重復(fù)使肽鏈增長到必要的長度。肽鏈的延伸是從N端開始的。3.肽鏈合成的終止與釋放

（1）當(dāng)mRNA上肽鏈合成終止密碼子出現(xiàn)在核糖體的A位點上。終止因子（RF）—可識別終止密碼子，并在A位點上與終止密碼子相結(jié)合，從而阻止肽鏈的繼續(xù)延伸。

（2）終止因子可使核糖體P位點上的肽酰轉(zhuǎn)移酶發(fā)生變構(gòu)，酶活性從轉(zhuǎn)肽作用變?yōu)樗庾饔?，使tRNA所攜帶的多肽鏈與tRNA之間的酯鍵被水解切斷，多肽鏈從核糖體及tRNA釋放出來。

核糖體與mRNA分離；在核糖體P位上的tRNA和A位上的RF脫落。在IF3的參與下，與mRNA分離的核糖體又分離為大小兩個亞基，可重新投入另一條肽鏈的合成過程。4.真核生物和原核生物蛋白合成的異同

起始復(fù)合物形成位于mRNA5'端AUG上游的帽子結(jié)構(gòu)。①形成43S核糖體復(fù)合物：40S小亞基與elF3和elF4c組成。②形成43S前起始復(fù)合物：在43S核糖體復(fù)合物上，連接elF2-GTP-Met-tRNAMet復(fù)合物。（1）起始的異同③形成48S前起始復(fù)合物：由mRNA及帽結(jié)合蛋白1(CBP1)、elF4A、elF4B和elF4F共同構(gòu)成一個mRNA復(fù)合物。mRNA復(fù)合物與43S前起始復(fù)合物作用，形成48S前起始復(fù)合物。

④形成80S起始復(fù)合物：在elF5的作用下，48S前起始復(fù)合物中的所有elF釋放出，并與60S大亞基結(jié)合，最終形成80S起始復(fù)合物：

40S亞基-mRNA-Met-tRNAMet-60S亞基。

在真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始階段，40S核糖體亞基一般可選擇第一個起始密碼子AUG，開始對mRNA翻譯。由于AUG是唯一的起始密碼子；并且，40S亞基與帶帽的mRNA5'末端接觸，沿著mRNA"掃描"一直到抵達(dá)第一個AUG處再開始翻譯。（2）肽鏈的延長和終止

真核細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成延長和終止中所涉及的因子比較簡單。真核細(xì)胞肽鏈延長和終止所涉及的因子：因子功能

EF1α促使aa-tRNA與核糖體結(jié)合

EF1βγ使EF1α再循環(huán)

EF2轉(zhuǎn)位

RF肽鏈釋放

延長因子(EF1α）可與GTP和aa-tRNA形成復(fù)合物，并把a(bǔ)a-tRNA供給核糖體。

EF1βγ能催化GDP-GTP交換，有助于EF1α再循環(huán)利用；EF2催化GTP水解和使aa-tRNA從A位轉(zhuǎn)移至P位。

肽鏈合成的終止僅涉及釋放因子(RF)。RF可識別所有的三種終止密碼子UAA，UAG和UGA。終止肽鏈合成。

RF活化肽鏈酰轉(zhuǎn)移酶釋放新生肽鏈后，即從核糖體解離。6.肽鏈合成后的加工mRNA翻譯的多肽大多數(shù)為無功能的初級產(chǎn)物，需經(jīng)折疊、修飾、剪切等加工過程后才具有活性。原核的有些蛋白質(zhì)要分泌到細(xì)胞外，真核的許多蛋白質(zhì)要易位到細(xì)胞器或胞液中。（1）蛋白質(zhì)的修飾

蛋白質(zhì)的修飾一般伴隨著肽鏈合成的進(jìn)行。修飾利于折疊，也與蛋白質(zhì)的易位和分泌有關(guān)。多肽鏈的修飾包括：①N-端的Met（fMet）殘基，以及有些多肽鏈N-端的多個殘基或C-端的殘基都會被切除；②一些多肽鏈還要經(jīng)過一定的剪接；③氨基酸側(cè)鏈的修飾：二硫鍵形成、磷酸化、糖基化、脂化、核糖基化和乙?；?。（2）蛋白質(zhì)的折疊

蛋白質(zhì)的折疊是由多肽鏈中氨基酸順序決定的。但環(huán)境條件對折疊有影響。肽鏈折疊與肽鏈合成同步進(jìn)行。隨著肽鏈的延伸，空間構(gòu)象不斷調(diào)整，最終成為天然態(tài)的構(gòu)象。一些酶和分子伴侶可參與肽鏈的折疊，稱它們?yōu)橹郫B蛋白(foldlinghelper)。①酶,如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(proteindisulfide1somerase，PDI)可加速形成蛋白質(zhì)中正確的二硫鍵；肽酰脯酰順反異構(gòu)酶(peptidylprolylcis/transisomerase，PPI)可催化肽脯氨酰之間肽鍵的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)，從而加速蛋白質(zhì)的折疊過程。②分子伴侶(chaperonin)是細(xì)胞內(nèi)一類能幫助新生肽鏈正確組裝、成熟和跨膜運輸，自身卻不是終產(chǎn)物分子的成分的蛋白質(zhì)，類似酶但又無酶的專一性特征，所以稱為分子伴侶。分子伴侶所識別的靶蛋白部位是它們部分折疊的非天然狀態(tài)，促進(jìn)折疊的機(jī)理尚不清楚。7.抑制翻譯的抗菌素

很多抗菌素對蛋白質(zhì)合成都有抑制作用。①四環(huán)素族(tetracyclinefamily)

抑制氨基酰–tRNA與原核細(xì)胞核糖體的結(jié)合，而抑制多種細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成。②氯霉素(chloromycetin)

與原核細(xì)胞核糖體的50S亞基結(jié)合，阻斷肽鍵的形成。高濃度時，對哺乳動物線粒體內(nèi)核糖體50S亞基也有作用。③鏈霉素(Streptomycin)和卡那霉素(Kanamycin)

與原核細(xì)胞核糖體30S亞基結(jié)合而改變其構(gòu)象，引起讀碼錯誤，導(dǎo)致合成錯誤的蛋白質(zhì)。④嘌呤霉素(Puromycin)

結(jié)構(gòu)與氨酰–tRNA末端相似，帶有游離氨基，可以取代氨基酰–tRNA進(jìn)入核糖體受位，使正在延長中的肽鏈轉(zhuǎn)移到嘌呤霉素的氨基上，這種異常肽鏈很容易從核糖體上釋放下來，從而終止肽鏈的延長。對真核及原核細(xì)胞都有作用，不能用于臨床治療。

⑤亞胺環(huán)己酮(Cycloheximide)

對真核細(xì)胞有作用，能抑制核糖體上的多肽轉(zhuǎn)移酶。此外，白喉毒素也能抑制蛋白質(zhì)合成，它是由白喉棒狀桿菌產(chǎn)生的，卻不抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成。此毒素可對延長因子–2進(jìn)行酶促反應(yīng)，使其修飾成腺苷二磷酸核糖衍生物，從而使動物延長因子–2失活，抑制肽鏈的移位作用。由于它是一種酶蛋白，極小量即能完全抑制蛋白質(zhì)合成，成為一種劇毒物。三、蛋白質(zhì)的定位

原核生物和真核生物新合成的蛋白質(zhì)只有被運送到各自特定的亞