色譜分析超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜法

SupercricalFluidChromatography（SFC）超臨界流體的定義：純凈物質(zhì)根據(jù)溫度和壓力的不同，呈現(xiàn)出液體、氣體、固體等狀態(tài)變化，如果提高溫度和壓力，來觀察狀態(tài)的變化發(fā)現(xiàn)，如果達到特定的溫度、壓力，會出現(xiàn)液體與氣體界面消失的現(xiàn)象,該點被稱為臨界點。在臨界點附近，會出現(xiàn)流體的密度、粘度、溶解度、熱容量、介電常數(shù)等所有流體的物性發(fā)生急劇變化的現(xiàn)象。當(dāng)物質(zhì)所處的溫度高于臨界溫度，壓力大于臨界壓力時，該物質(zhì)處于超臨界狀態(tài)。

溫度及壓力均處于臨界點以上的液體叫超臨界流體(supercriticalfluid，簡稱SCF)。例如:當(dāng)水的溫度和壓強升高到臨界點(t=374.3℃，p=22.05MPa)以上時，就處于一種既不同于氣態(tài)，也不同于液態(tài)和固態(tài)的新的流體態(tài)──超臨界態(tài)，該狀態(tài)的水即稱之為超臨界水。超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜(supercricalfluidchromatography,SFC)是以超臨界流體作為流動相的色譜方法，是20世紀(jì)80年代以來發(fā)展迅速的一個色譜分支，所謂超臨界流體，是指在高于臨界壓力和臨界溫度時的一種物質(zhì)狀態(tài)。它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低粘度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴散系數(shù)等特性。從理論上說SFC既可以分析GC法難以處理的高沸點、不揮發(fā)性樣品，又有比HPLC法更高的柱效和更短的分離時間，且可使用二者常用的檢測器，也可與MS、FT-IR光譜儀等在線聯(lián)接，因而可以方便地進行定性、定量分析。在中藥藥物分析領(lǐng)域已有愈來愈多的應(yīng)用。一、超臨界流體色譜的特點與原理

principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1．超臨界流體的特性。對于某些純物質(zhì)來說，具有三相點和臨界點，如圖所示，從圖中可以看出，物質(zhì)在三相點，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)處于臨界溫度和臨界壓力以上時，則不論施加多大壓力，氣體也不會液化，此時即非氣體，也非液體，而是以超臨界流體形式存在。

超臨界流體對于分離具有極其有用的物理性質(zhì)，這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。下表對氣體、液體、和超臨界流體的有關(guān)物理性質(zhì)進行了比較。表氣體、液體、超臨界流體物理性質(zhì)的比較流動相密度（g/ml）擴散系數(shù)（cm2/s）粘度（g/cm.s）氣體超臨界流體液體約10-30.2-0.90.8-1.01-10-210-3-10-4＜10-510-410-4-10-310-22.原理

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細管柱SFC；

分離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離；通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；壓力效應(yīng)：SFC的柱壓降大（比毛細管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）；超臨界流體的密度受壓力的影響在臨界壓力處最大，超過該點，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對分離的影響?。?/p>

壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度的增加，能提高溶劑效率，淋洗時間縮短。

CO2流動相，當(dāng)壓力改變：7.0→9.0×106Pa，則：

C16H34的保留時間25min→5min。程

序

升

壓HPLC與SFC

比較與GC法和HPLC法比較,因超臨界流體的粘度接近于氣相色譜的流動相,對溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以使用更高的流速洗脫，因此SFC的分離速度快于HPLC而與GC相當(dāng)；超臨界流體的擴散率介于GC和LC之間，因而峰展寬小于在氣體中。SFC中的流動相不是惰性的傳輸介質(zhì)，這不同于GC而與LC一樣，溶質(zhì)與流動相間有相互作用，利用此點可調(diào)控選擇因子α在一定壓力下，超臨界流體溶解的分子的分壓比在氣體中高幾個數(shù)量級，這就可以實現(xiàn)對大分子、熱不穩(wěn)定性化合物、高聚物等的有效分離。二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)與流程

instrument

structureandthegeneralprocessofSFC1.結(jié)構(gòu)流程

2.主要部件（1）SFC的高壓泵

無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計算機控制流動相的密度和流量；

（2）SFC的色譜柱和固定相

可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細管柱；

SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；專用的毛細管柱SFC；色譜柱①填充柱填充柱與HPLC柱相似，基于分配平衡實現(xiàn)分離，柱長可達25cm，分離柱內(nèi)徑0.5-4.6mm。使用粒徑為3-10μm的填料填充。如硅膠、-NH2、-CN及C18、C8等化學(xué)鍵合相均可用于SFC。其中以極性填料的分離效果更好。SFC在手性化合物的分離上效果優(yōu)于HPLC。在實際操作中，往往會因壓力變化而產(chǎn)生較大的柱壓降，使柱入、出口處的保留時間有很大差異，所以一般采用高于超臨界壓力20%左右的壓力以減小影響。在填料的選擇上也要注意與所分析的樣品相適應(yīng)，如分析極性或堿性化合物時，填料覆蓋度小，會產(chǎn)生不對稱峰。若使用“封端”填料則會得到改善。填充柱在重現(xiàn)性、載樣量等方面要優(yōu)于毛細管柱，操作簡便，也有用微填充柱的，將3-10μm的填料填充到內(nèi)徑幾個毫米或更小的毛細管柱中。②毛細管柱較長用的填充毛細管柱內(nèi)徑≤0.5mm，柱長為10-30m；開管毛細管柱主要是內(nèi)徑為50-100μm化學(xué)交連的各種硅氧烷柱或其它類型的交連柱。SFC色譜柱必須借助柱箱以實現(xiàn)精確的溫度控制，范圍可以從室溫至450°C，同時配低溫控制系統(tǒng)，可在-50℃以下工作。主要部件（3）流動相

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4）檢測器

可采用液相色譜檢測器，也可采用氣相色譜的FID檢測器①使用氣相色譜檢測器，以FID為多用，應(yīng)用時可將色譜柱的流出物分流，部分流出物通過限流器變?yōu)闅鈶B(tài)進入檢測器，若用FID檢測時，流動相中不能加入改進劑，否則改進劑本身將給出信號干擾測定，F(xiàn)ID對小分子量化合物可得到很好的結(jié)果，對分子量大的化合物常得不到單峰，而是一簇峰。如把檢測器加熱可使分子量大于2000的化合物獲得滿意的分離。在SFC中也可以使用氮磷檢測器（NPD）、火焰光度檢測器（FPD）等。②使用液相色譜檢測器。在進入檢測器之前應(yīng)將超臨界狀態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)，可增加檢測的靈敏度，使譜帶變窄，而且可以在室溫下操作，UVD是用改性劑流動相的填充柱SFC的最常用的檢測方法。要求檢測器必須耐高壓。如使用毛細管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛細管構(gòu)成，內(nèi)容積在200nl左右，這樣不會影響柱效；熒光檢測器（FD）也可以如此應(yīng)用。對于填充柱，蒸發(fā)光散射檢測器也是一種常用的通用檢測器。三、超臨界流體色譜的流動相和改性劑（一）流動相SFC的流動相為超臨界流體。超臨界流體的主要特點是在不同壓力下對各種樣品有不同的溶解能力。其溶解度隨超臨界流體密度的增加而增加。當(dāng)兩組分的溶解度常數(shù)越接近時，，其互溶性就越好。有人研究認(rèn)為，幾種常用的超臨界流體的溶解能力在相同的壓力條件下順序是乙烷<二氧化碳<氧化亞氮<三氟甲烷，在相同條件下其分離能力是：＜二氧化碳＜氧化亞氮＜三氟甲烷≈乙烷。對于SFC流動相的選擇應(yīng)綜合考慮。除溶解性能外，還要與檢測器相適應(yīng)，CO2是最常用的流動相。其臨界溫度低、壓力適中，容易操作，相對便宜，無毒無嗅，安全性好，且在190nm以上無紫外吸收。（二）改性劑在SFC中，弱極性或非極性超臨界流體流動相如CO2，對于一些極性化合物的溶解能力較差。為了加強其對極性溶質(zhì)的溶解和洗脫能力，常常向其中加入一定比例的極性溶劑稱為改性劑，加入的量一般為1%-5%，以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分適于二氧化碳的改性劑及應(yīng)用特性。

表常用CO2改性劑CO2改性劑檢測方法CO2改性劑檢測方法甲醇UVDMSFIDC（用量應(yīng)少于1%）脂肪二甲基亞砜乙二氧甲烷UVUVUVMSUVMS脂肪醇UVMS甲醇UVMSFID四氫呋喃UVMS二氧化碳UVMSFID2-基乙醇UV水UVMSFID在分離酸性或堿性化合物時，也可以向CO2流動相中加入酸或堿，使其峰形變銳。1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m×63μmi.d.

毛細管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動相：CO