單克隆抗體的發(fā)展情況

?2006Accenture.Allrightsreserved.1Monoclonalantibodytechnology?2006Accenture.Allrightsreserved.2輕鏈（L）由約214個aminoacid組成，分兩種：Kappa（κ）和Lambda（λ），重鏈由450-550個aminoacid組成，根據其抗原性差異可分為5種：μ鏈、γ鏈、α鏈、δ鏈和ε鏈。由此將免疫球蛋白分為M、G、A、D和E。?2006Accenture.Allrightsreserved.31抗體技術的發(fā)展單克隆抗體技術的發(fā)展第1代單抗技術：鼠源性單克隆抗體第2代單抗技術：嵌合性單克隆抗體第3代單抗技術：人源化單克隆抗體第4代單抗技術：全人源化單克隆抗體?2006Accenture.Allrightsreserved.41細胞工程單克隆抗體?2006Accenture.Allrightsreserved.52單鏈抗體（scFv）SOE法構建scFv基因產物VHVLVLVH變性、復性接頭DNA，（Gly4Ser）3引物引物接頭DNAPCR重疊延伸拼接法（SOE），是把Linker的編碼序列分別設計在擴增VH和VL引物中，用PCR直接合成scFv基因。scFv的優(yōu)點是分子量小、免疫原性弱、滲透力強，并具有藥物導向、中和毒素等功能，不需要進行糖基化修飾，可以在原核表達系統中進行表達。缺點是無抗體C區(qū)，不能介導抗體的其他生物學活性。?2006Accenture.Allrightsreserved.63Fab抗體Fab抗體分子的制備PrVHVHVLCLCH1CH1VLCLS-S-H鏈表達載體L鏈表達載體共轉染細胞抗體分泌細胞Fab片段是由H鏈Fd段和完整L鏈通過二硫鍵形成的異二聚體，僅含有一個抗原結合位點，大小為完整抗體的1/3。可利用噬菌體構建表達有天然構象的Fab片段。Fab片段有中和毒素和病毒，封閉受體和藥物的螯合作用，其免疫原性低，但半衰期比完整抗體短的多。Pr?2006Accenture.Allrightsreserved.74抗體庫技術抗體庫按基因的來源可分為：鼠源性抗體庫，人源性抗體庫和駝源性抗體庫

抗體庫展示技術：噬菌體表面展示技術，酵母表面展示技術，核糖體展示技術抗體庫技術的優(yōu)點：1不需要進行細胞融合，避免了因雜交瘤不穩(wěn)定而需要反復亞克隆的繁瑣程序。2擴大了篩選容量，可達到106以上的克隆，而雜交瘤技術一般只能篩選約1000個克隆。3可直接克隆到抗體的基因，便于進一步構建各種基因工程抗體。4得到的抗體可以進行原核表達，降低制備成本。5構建抗體庫時由于H鏈和L鏈V區(qū)基因在體外隨機組合，因而可以獲得新的特異性抗體。已有的噬菌體抗體庫：抗HIV，麻疹病毒，破傷風類毒素，呼吸道合抱病毒，乙肝病毒，單純皰疹病毒糖蛋白和TNF-α等的抗體庫。?2006Accenture.Allrightsreserved.8構建方法1動物免疫2血清效價檢測3淋巴細胞的分離純化4總RNA提取5第一鏈cDNA反轉錄合成6輕、重鏈基因的擴增7scFvDNA的組裝與擴增8scFvDNA片段的SfiI/NotI酶切9pCANTAB5E–scFv重組質粒的構建10重組噬菌體的制備11庫容量的滴定12單鏈抗體噬菌體抗體庫的富集淘選4.1噬菌體展示技術構建和篩選scFv圖片來源：蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司

?2006Accenture.Allrightsreserved.94.2噬菌體展示技術構建和篩選Fab抗體構建方法淋巴細胞分離、總RNA提取及cDNA的合成與scFv抗體庫的構建相同1PCR擴增Fd及輕鏈基因2PCR擴增產物的純化3輕鏈基因的克隆4重鏈Fd基因的克隆及噬菌體抗體庫的建立和鑒定5Fd基因的克隆及抗體庫的建立6抗體庫的富集和篩選?2006Accenture.Allrightsreserved.104.3酵母表面展示技術酵母表面展示技術是繼噬菌體展示技術之后發(fā)展起來的真核展示系統，不僅能篩選噬菌體抗體庫的全部抗體，而且能篩選新型抗體，是噬菌體抗體庫篩選抗體的兩倍。酵母存在MATa和MATα2種交配型單倍體細胞。酵母表面展示技術有兩種：a凝集素展示系統是將目的蛋白的C端與a凝集素的Aga2亞基的N端融合；α凝集素展示系統是將目的蛋白的N端與α凝集素的C端融合。α凝激素展示系統原理圖?2006Accenture.Allrightsreserved.115特殊基因工程抗體1.7.1雙特異性抗體BsAb圖片來源：武漢友芝友生物制藥有限公司利用基因重組和抗體工程技術，由大容量抗體庫的構建及優(yōu)化系統，高通量抗體篩選系統，體內體外抗體驗證系統三大部分組成，制備高效的腫瘤治療性抗體，對乳腺癌，淋巴瘤和結腸癌進行針對性的治療。細胞工程BsAb將2株分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞融合得到四源雜交瘤，就可以同時分泌具有兩種親代單克隆抗體結合特性的BsAb。其合成、組裝與分泌過程和天然免疫球蛋白的產生過程相同，穩(wěn)定性及藥代動力學特征也與天然抗體相似。?2006Accenture.Allrightsreserved.126人鼠嵌合單克隆抗體為了消除人抗鼠抗體（HAMA）反應，使單抗更好的用于疾病治療，人們設計了嵌合抗體。在基因水平上將鼠源單克隆抗體的V區(qū)和人抗體的C區(qū)連接起來，并在合適的宿主細胞中表達的抗體，成為人-鼠嵌合抗體。Pr鼠VL人CL人CH免疫球蛋白基因載體的構建L鏈嵌合載體共轉染細胞抗體分泌細胞Pr鼠VHH鏈嵌合載體嵌合抗體的構建已上市銷售的人鼠嵌合抗體：RituximabCD20抗腫瘤、類風濕CetuximabEGFRantagonist抗腫瘤Clotinab,abciximabGPⅡbⅢareceptor抗凝，心血管antagonistInfliximabTNF-αantagonist類風濕，克隆氏病等BasiliximabIL-2receptorantagonist抗移植排斥?2006Accenture.Allrightsreserved.13全人源化單抗人源化技術的難點在于它需要大量的學科集成，非常復雜，因為任何氨基酸改變都會影響蛋白質結構、活性，而這方面又沒有太多規(guī)范可以遵循，因此需要大量的實踐和探索。這是單抗藥物研發(fā)的核心技術

，也是未來的發(fā)展方向。兩個難點：一是抗體人源化技術，二是哺乳動物細胞規(guī)模化培養(yǎng)。

已上市的人源單抗：PanitumumabEGFRantagonist直腸癌AdalimumabTNFantagonist類風濕，克隆氏病等UstekinumabIL-12,IL-23antagonist銀屑病7全人源化單克隆抗體全人源化單抗的兩條技術路線：轉基因小鼠技術，噬菌體展示技術?2006Accenture.Allrightsreserved.14轉基因小鼠技術

目前主要是人外周血淋巴細胞-嚴重聯合免疫缺陷（hu-PBL-SCID）轉基因小鼠和轉染色體小鼠制備人抗體技術。hu-PBL-SCID轉基因小鼠將已產生一定免疫反應的供者或癌癥患者的淋巴細胞導入嚴重聯合免疫缺陷（severecombinedimmunodeficiency，SCID）小鼠，作為暫時的人免疫系統發(fā)揮有限的功能。然后取鼠的脾細胞與人骨髓瘤細胞雜交就可以獲得分泌人抗體的雜交瘤細胞轉染色體小鼠通過基因敲出技術使小鼠自身基因失活并導入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體H、L鏈基因簇而自身抗體基因失活的轉基因小鼠。此種小鼠所攜帶的人DNA片段具有完備的功能，可以有效的進行同種型轉換和親和力成熟。親和力成熟：在抗原刺激下，抗體V區(qū)發(fā)生高頻突變，具有高親和力抗體的細胞群體獲得優(yōu)勢而進一步擴增，同時經過類別轉換，即不再表達μ鏈、δ鏈，而表達γ、α或ε而成熟。?2006Accenture.Allrightsreserved.152抗體的市場和應用單抗從最初的鼠源單抗過渡至人源化單抗直到現在的全人單抗,單克隆抗體的發(fā)展使抗體制備技術進入了一個全新的時代,其相關的藥物已廣泛應用到生物醫(yī)學中的許多領域,如腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植、戒毒、血液性疾病、感染性疾病、中毒性疾病、變態(tài)反應性疾病等方面的診斷和治療。目前美國和歐盟已批準上市抗體藥物34個，全球有近300家公司正在研究抗體藥物，其中，臨床研究抗體項目有100多個，在研項目超過300個。我國已批準上市抗體藥物18種，其中進口10種，國內企業(yè)獲得抗體新藥證書8個，實現銷售4種，臨床研究抗體藥物13種。（截止到2012.12）

2011年全球抗體藥物的市場規(guī)模為671億美元。預計到2020年,生物技術藥物占全部藥品銷售收入的比重將超過1/3。據全球醫(yī)藥市場預測機構EvaluatePharma對2012年銷售前15位藥品的估計,今年生物技術產品全面崛起,其中銷售前十強中,單克隆抗體藥物占據五席。名稱阿達木單抗英利昔單抗利妥昔單抗曲妥珠單抗貝伐珠單抗排名14589國內商品名修美樂類克美羅華赫賽汀安維汀所屬企業(yè)雅培強生、默沙東羅氏羅氏羅氏2011年銷售額79億美元81.6億美元61.4億美元53.5億美元54.1億美元預計2012年銷售額94.8億美元76.7億美元69.4億美元60.8億美元59.8億美元?2006Accenture.Allrightsreserved.16國內主要抗體公司成都華神集團股份有限公司制藥廠華蘭生物工程股份有限公司上海蘭生股份有限公司北京天壇生物制品股份有限公司上海中信國建