第五章 基因的重組及轉(zhuǎn)移

外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第五章

基因的重組與轉(zhuǎn)移

一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第一節(jié)

DNA片段的體外連接1.兩段DNA的連接依靠粘性末端2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端ligasenick二、齊平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用

④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：（3）DNA接頭

(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP處理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。引物1GCAGAATTC

互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’

GCAGAATTC

互補(bǔ)序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互補(bǔ)序列

PCR產(chǎn)物5’--3’

3’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’

3-’

5’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物

互補(bǔ)序列-5’

3’-引物2帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個(gè)3’端人為地各加一個(gè)T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非粘性末端連接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’

3’

載體插入片斷1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組（能存活）171.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第二節(jié)

重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法

2.轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L

電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F

脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒

5.影響轉(zhuǎn)化率的因素①生長(zhǎng)狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞

（competentcells)把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）

（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（4）

互補(bǔ)型噬菌體

外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2(5)體外包裝過程

體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

轉(zhuǎn)導(dǎo)

轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合）。第三節(jié)

外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。

轉(zhuǎn)化

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1.葉盤法（leafdisk)植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electropo