第3章 細(xì)胞工程

第三章細(xì)胞工程細(xì)胞工程是生物工程的一個(gè)重要方面?？偟膩?lái)說(shuō)，它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計(jì)藍(lán)圖，進(jìn)行在細(xì)胞水平上的遺傳操作及進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞和組織培養(yǎng)。當(dāng)前細(xì)胞工程所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域有細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體操作及基因轉(zhuǎn)移等方面。通過(guò)細(xì)胞工程可以生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或培養(yǎng)有價(jià)值的植株，并可以產(chǎn)生新的物種或品系。第一節(jié)細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)一細(xì)胞工程的興起和基本內(nèi)容

細(xì)胞工程是在細(xì)胞水平上研究、開(kāi)發(fā)、利用各類細(xì)胞的工程。細(xì)胞工程應(yīng)用的原理和方法細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品概念分類植物細(xì)胞工程研究的目的研究的水平動(dòng)物細(xì)胞工程細(xì)胞工程的概念二細(xì)胞工程的主要成就1植物細(xì)胞工程可以獲得大量的次生代謝物質(zhì)；使傳統(tǒng)的作物育種實(shí)現(xiàn)工廠化；植物花藥培養(yǎng)和單倍體育種技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。2動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物胚胎移植，使牲畜快速良種化；單克隆抗體技術(shù)也是動(dòng)物細(xì)胞工程的重大貢獻(xiàn)；動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用。3微生物細(xì)胞工程在生物藥品生產(chǎn)上的應(yīng)用:生產(chǎn)抗生素、生物活性物質(zhì)、疫苗等在環(huán)保中具有重要作用：消除環(huán)境中的有害廢物或變廢為寶三細(xì)胞工程的基礎(chǔ)和基本操作

細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的區(qū)別?基本操作：無(wú)菌操作細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)是指動(dòng)植物或微生物的細(xì)胞在體外無(wú)菌的條件下的保存和生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：1.直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)。2.直接觀察細(xì)胞的變化可便于攝影。3.研究細(xì)胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。4.便于使用各種技術(shù)：相差、熒光、電鏡、組化、同位素標(biāo)記等方法觀察和研究細(xì)胞狀況。5.是分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究對(duì)象，也是其主要的組成部分。6.易于施用物理、化學(xué)生物的實(shí)驗(yàn)研究。7.易于提供大量生物性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,耗資少比較經(jīng)濟(jì)。8.成為生物制品單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程等的材料來(lái)源。細(xì)胞培養(yǎng)的流程一、準(zhǔn)備工作

準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。

二、取材

在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過(guò)一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過(guò)程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無(wú)取材這一過(guò)程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無(wú)菌，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養(yǎng)

將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱為培養(yǎng)。

正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好，形態(tài)是否正常，有無(wú)污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對(duì)培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時(shí)檢查。四、凍存及復(fù)蘇

為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無(wú)限的。

復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

凍存過(guò)程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對(duì)細(xì)胞活力有影響。

細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合：兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并，染色體等遺傳物質(zhì)重組的過(guò)程稱細(xì)胞融合。細(xì)胞融合的過(guò)程：制備原生質(zhì)體：植物細(xì)胞壁（纖維素酶等）誘導(dǎo)細(xì)胞融合：PEG或其他的誘導(dǎo)劑篩選雜合細(xì)胞：第二節(jié)植物細(xì)胞工程一植物組織培養(yǎng)定義：組織培育是在無(wú)菌和人為控制外因（營(yíng)養(yǎng)成分、光、溫、濕）的條件下，培養(yǎng)植物組織或器官，從中分化發(fā)育出整體植株的技術(shù)。理論基礎(chǔ)：植物細(xì)胞具全能性進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的5個(gè)階段：1預(yù)備階段：（1）選擇合適的外植體外植體：能被誘導(dǎo)產(chǎn)生無(wú)性增殖系的器官或組織切段（2）除菌：

（1）刷洗或沖洗外植體材料。（2）在超凈工作臺(tái)上用已消毒的燒杯、鑷子和消毒劑操作。一般先用70％酒精浸泡30～60s，再用其他消毒劑。（3）然后，無(wú)菌水反復(fù)沖洗三四次。（3）配制適宜的培養(yǎng)基：①基本成分：無(wú)機(jī)鹽（大量元素）和有機(jī)化合物（如糖類，氨基酸、酰胺類、維生素類、肌醇、天然營(yíng)養(yǎng)物等）。②微量無(wú)機(jī)物－－微量元素③微量有機(jī)物，包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素pH值常為5.6～6.0

生長(zhǎng)素類包括：

吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（IBA）萘乙酸（NAA）

2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）

細(xì)胞分裂素包括：

6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）（又名激動(dòng)素，6-糠基氨基嘌呤）

6-芐基腺嘌呤（6BA）玉米素（ZT）赤霉素類（GA)

生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素愈傷組織胚根、胚芽

（1）接種：每瓶約4～10個(gè)（2）封口（3）培養(yǎng)條件：溫度為25℃左右光照為1000～4000lx

相對(duì)濕度保持在70～80%，

接種和培養(yǎng)：2誘導(dǎo)去分化階段分化：是導(dǎo)致細(xì)胞或組織形成不同結(jié)構(gòu)并引起功能或潛在發(fā)育方式改變的一種過(guò)程；去分化（脫分化）：是指已分化的細(xì)胞在一定因素作用下重新恢復(fù)分裂機(jī)能并改變?cè)瓉?lái)的發(fā)展方向而沿著一條新的途徑發(fā)育的過(guò)程激素要求：較高的生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素3繼代增殖階段愈傷組織長(zhǎng)出4-6周水分和營(yíng)養(yǎng)成分消耗有害物質(zhì)積累移植把愈傷組織切割后轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。一般一個(gè)月左右增殖培養(yǎng)一次。4生根發(fā)芽階段愈傷組織胚狀體小植株胚狀體：是指在組織培養(yǎng)中分化產(chǎn)生的具有芽端和根端類似合子胚的構(gòu)造

需要條件:

(1)增加細(xì)胞分裂素濃度，減少生長(zhǎng)素濃度；

(2)光照

外植體↓高濃度生長(zhǎng)素（2,4-D）

脫分化↓愈傷組織↓高（細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素）

再分化↓形成芽↓低（細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素）

分化根↓完整植株

激素控制器官分化模式圖5移栽成活階段試管苗人工氣候室大田

植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱為次生代謝。二植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產(chǎn)

酚類化合物－黃酮類、單酚類、醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）；萜類化合物－三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜；含氮化合物－生物堿（真生物堿、偽生物堿、原生物堿）；胺類（伯、仲、叔、季胺）、生氰甙、多炔類以及有機(jī)酸等。

植物次生代謝產(chǎn)物根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同可以分為：1植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)愈傷組織、無(wú)菌苗、胚或外植體破碎過(guò)濾振蕩培養(yǎng)試管或培養(yǎng)瓶單細(xì)胞濾液懸浮培養(yǎng)方法：有分批培養(yǎng)法、半連續(xù)培養(yǎng)法、連續(xù)培養(yǎng)法懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)快，次生代謝物含量低。2固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞固定化：將細(xì)胞包埋在惰性支持物的內(nèi)部或貼附在表面細(xì)胞分化和次生代謝物積累之間存在正相關(guān)性。細(xì)胞固定化后有利于細(xì)胞的分化和組織化，有利于次生代謝物的合成。固定化細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)慢，次生代謝產(chǎn)物含量高。三植物原生質(zhì)體的制備與融合原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說(shuō)一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。細(xì)胞原生質(zhì)體酶解體細(xì)胞融合遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)顯微操作基因槍導(dǎo)入原生質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)再生植株1.原生質(zhì)體研究概況2植物原生質(zhì)體的制備***原生質(zhì)體分離的要求：產(chǎn)量高、活性強(qiáng)，能夠進(jìn)行分裂誘導(dǎo)形成愈傷組織或胚狀體，植株再生。***1960年英國(guó)植物生理學(xué)家Cocking首次用纖維素酶降解番茄幼苗根尖細(xì)胞獲得原生質(zhì)體，從而開(kāi)創(chuàng)用酶解法分離植物原生質(zhì)體的新時(shí)期。***早期分離方法－－－機(jī)械分離法（易破碎、獲得率低）***目前使用的降解酶：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶（1）取材與除菌外植體包括：幼根、嫩葉、子葉、下胚軸、胚細(xì)胞、花粉母細(xì)胞及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等。除菌：方法同組培。（2）酶解①配制酶解反應(yīng)液:pH5.5－5.8,0.3%～3.0%的纖維素酶、滲透壓穩(wěn)定劑，細(xì)胞膜保護(hù)劑和表面活性劑等②酶解：除菌后的材料切小塊放入酶解反應(yīng)液→反應(yīng)液變綠（3）分離:沉降法和漂浮法沉降法：滲透壓溶液過(guò)濾40-100um的篩網(wǎng)濾液除去大的組織塊和殘?jiān)x心上部溶液下部沉淀加入新鮮培養(yǎng)基離心（4）洗滌用新高滲溶液或原生質(zhì)體培養(yǎng)基進(jìn)行離心洗滌2-4次（5）鑒定：低滲膨脹法、熒光染色法

在低滲溶液中，真正的原生質(zhì)體，破裂后會(huì)消失；如果原生質(zhì)體還帶有部分細(xì)胞壁，破碎后留下的殘跡仍保持半圓形的細(xì)胞壁。低滲膨脹法：熒光染色法：含有0.7mol/L甘露醇的0.05%～0.1%熒光增白劑溶液，染色5-10min，離心、洗滌除去多余的染料，在熒光顯微鏡下觀察。綠色光顯示纖維素的存在，發(fā)出紅色光的是原生質(zhì)體。原生質(zhì)體活力檢測(cè)：①形態(tài)識(shí)別法：體積能隨介質(zhì)滲透壓變化而改變的，都是活的原生質(zhì)體②胞質(zhì)環(huán)流法：有胞質(zhì)環(huán)流的是活原生質(zhì)體；③染色法：熒光素雙醋酸酯、臺(tái)盼藍(lán)等染色④氧電極法：氧電極測(cè)定氧濃度的變化來(lái)判定原生質(zhì)體是否具有活力誘導(dǎo)體細(xì)胞融合的方法主要有：聚乙二醇（PEG）高鈣高pH值法（Kao，1977）。電融合法（Zimmermann，1982）三植物原生質(zhì)體的制備與融合3植物原生質(zhì)體融合（1）化學(xué)誘導(dǎo)融合：PEG雙親原生質(zhì)體PEG搖勻，靜置搖勻，靜置高鈣高pH溶液培養(yǎng)液洗滌離心原生質(zhì)體再生雜合細(xì)胞篩選化學(xué)誘導(dǎo)融合的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需貴重儀器，試劑易得；融合子產(chǎn)生的異核率較高缺點(diǎn)：融合過(guò)程繁瑣，PEG對(duì)原生質(zhì)體有一定的毒性。（2）物理法誘導(dǎo)融合：電擊融合雙親原生質(zhì)體懸液插入電極接通交變電場(chǎng)原生質(zhì)體極化原生質(zhì)體緊密接觸施加瞬間脈沖質(zhì)膜擊穿，融合細(xì)胞膜的接觸膜的擊穿不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問(wèn)題；融合效率高；融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便；可在顯微鏡下觀察或錄像融合過(guò)程。電融合法與PEG融合法相比具有的優(yōu)點(diǎn)：4雜合體的鑒別與篩選（1）雜合細(xì)胞的顯微鏡鑒別（2）互補(bǔ)法篩選雜合細(xì)胞前提：用于雜交的是各種遺傳突變細(xì)胞株A細(xì)胞：KmRAPH

×B細(xì)胞：KmHAPR

AB雜合細(xì)胞KmRAPR

細(xì)胞融合（3）采用細(xì)胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體染色體核型分析染色體顯帶分析核酸分子雜交DNA分子標(biāo)記技術(shù)（RFLP,AFLP,RAPD等）（4）根據(jù)融合處理后再生長(zhǎng)出的植株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別番茄×

馬鈴薯雜交植株形態(tài)象馬鈴薯，果實(shí)象番茄，高度不育細(xì)胞融合因?yàn)椴煌N生物之間存在著生殖隔離，所以用傳統(tǒng)的有性雜交方法是不可能做到這一點(diǎn)的。于是，科學(xué)家試圖用這兩種植物的體細(xì)胞進(jìn)行雜交，來(lái)實(shí)現(xiàn)這一美妙的設(shè)想。植物體細(xì)胞雜交技術(shù)這幅圖中的植物利用傳統(tǒng)有性雜交方法能實(shí)現(xiàn)嗎？為什么？植物體細(xì)胞雜交的概念

將不同種植物的體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的技術(shù)。植物體細(xì)胞雜交的原理：（1）細(xì)胞膜的流動(dòng)性（2）細(xì)胞的全能性相關(guān)問(wèn)題（1）要想讓兩個(gè)來(lái)自不同植物的體細(xì)胞融合在一起，遇到的第一個(gè)障礙是什么？（2）有沒(méi)有一種溫和的去細(xì)胞壁的方法？（3）為什么兩個(gè)原生質(zhì)體能發(fā)生融合，這與細(xì)胞膜的什么特性有關(guān)？（4）如果兩個(gè)來(lái)源不同的原生質(zhì)體發(fā)生融合形成了雜種細(xì)胞，下一步該對(duì)此細(xì)胞做何種處理？（5）如何將雜種細(xì)胞培育成雜種植株？植物體細(xì)胞雜交過(guò)程植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁（細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）雜種細(xì)胞（篩選）細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株融合植物組織培養(yǎng)去壁物理法：離心、振動(dòng)、電刺激等化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）等試劑纖維素酶、果膠酶等雜種植株遺傳物質(zhì)的變化：雜種植株的染色體是兩親本細(xì)胞染色體之和。

意義

與有性雜交（種內(nèi)）相比，植物體細(xì)胞雜交克服了遠(yuǎn)緣雜交不親合的障礙，大大擴(kuò)展了可用于雜交的親本組合范圍（種間、屬間），并且培育出了許多在生產(chǎn)上有較高應(yīng)用價(jià)值的雜種植株品種。煙草——

海島煙草胡蘿卜——

羊角芹四單倍體植物的誘發(fā)與利用單倍體植物：具有單套染色體的植物體。誘導(dǎo)植物單倍體主要有4種途徑：人工誘導(dǎo)單倍體是指單倍體細(xì)胞在人工離體條件下培養(yǎng)，使其發(fā)育成單倍性植物體。第三章細(xì)胞工程第二節(jié)植物細(xì)胞工程1花藥培養(yǎng)原理：花粉囊中的花粉經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)，可能去分化而發(fā)育成單倍體胚或愈傷組織，最終形成花粉植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)的不足：雙倍體植株所占百分比過(guò)高；白化苗較多。（1）選取成熟度適中的花蕾或幼穗；（2）花藥預(yù)處理;（3）選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基與培養(yǎng)條件?；ǚ壑仓甑恼T導(dǎo)：2花粉培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)的植株全部為單倍體植株；不足：白化苗較多。3未授粉胚珠的培養(yǎng)1976年，Noeum從大麥未授粉子房獲得單倍體植株。優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)的植株大多數(shù)是單倍體綠苗；不足：該領(lǐng)域的工作目前開(kāi)展得不多。4雜交法獲得單倍體植株原理：雜交，特別是遠(yuǎn)緣雜交，雜種胚在胚胎發(fā)育過(guò)程中往往會(huì)將一方親本的染色體逐步排除，最終將得到僅含一方染色體的單倍體植物。優(yōu)點(diǎn)：長(zhǎng)出的植株都是綠苗。5.單倍體培養(yǎng)物的染色體加倍：誘導(dǎo)單倍體培養(yǎng)物的目的：是為了對(duì)其進(jìn)行染色體加倍，從而獲得“純系”二倍體植物。誘發(fā)單倍體植株的各個(gè)階段（愈傷組織、幼胚和植株）常規(guī)途徑培養(yǎng)二倍體植株0.2%～0.4%秋水仙素處理24～48h染色體加倍五人工種子的研制人工種子:人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營(yíng)養(yǎng)成分、激素以及其他成分的人工膠囊。1人工種子的構(gòu)成及特點(diǎn)人工種皮人工胚乳胚狀體人工種子2人工種子的制備

（1）胚狀體的制備及其同步生長(zhǎng);**獲得體細(xì)胞胚是生產(chǎn)人工種子的基礎(chǔ)，其發(fā)生頻率的高低、胚的質(zhì)量和體細(xì)胞胚發(fā)生的同步控制是生產(chǎn)人工種子的關(guān)鍵。

細(xì)胞、組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基＋天然大分子碳水化合物＋激素、抗生素、農(nóng)藥、除草劑（2）人工胚乳的制備;（3）配制包埋劑及包埋。3人工種子的貯存與萌發(fā)保存：低溫，4-7C；干燥，相對(duì)濕度小于67%第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程一動(dòng)物組織及細(xì)胞培養(yǎng)1.動(dòng)物組織培養(yǎng)法無(wú)菌取出目的組織切成組織小塊加培養(yǎng)基翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶180°15-30min使組織塊貼壁生長(zhǎng)翻回培養(yǎng)瓶37℃靜置培養(yǎng)2.細(xì)胞培養(yǎng)法無(wú)菌取出目的組織切成小塊將小組織塊放在含蛋白酶類的解離液中離散細(xì)胞低速離心收集細(xì)胞洗滌轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中培養(yǎng)人的細(xì)胞培養(yǎng)：大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的三種方法：（1）微導(dǎo)管培養(yǎng)法；（2）微載體培養(yǎng)法；（3）微膠囊培養(yǎng)法。3培養(yǎng)物的傳代4無(wú)血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基：包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基質(zhì)因子和生長(zhǎng)因子、激素和維生素等約30種有機(jī)和無(wú)機(jī)微量物質(zhì)第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程無(wú)血清培養(yǎng)基的附加成分：5培養(yǎng)物的長(zhǎng)期保存：經(jīng)典傳代法、冷凍保存法冷凍保存法：培養(yǎng)物與5%－10%的甘油或二甲亞砜混勻分裝于若干個(gè)耐低溫容器降溫到-30℃降溫度降到－150℃轉(zhuǎn)移到液氮中凍存1-3℃/min15-30℃/min6.動(dòng)物組織、細(xì)胞培養(yǎng)污染的防治污染源：微生物污染、不同細(xì)胞株之間的交叉污染二動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合的途徑有三條：1.病毒誘導(dǎo)融合雙親本細(xì)胞分別制成細(xì)胞懸液混合離心收集雙親細(xì)胞沉淀混勻細(xì)胞凝集細(xì)胞融合選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)滅活仙臺(tái)病毒懸液冰浴20min間歇搖動(dòng)水浴37℃30min間歇搖動(dòng)第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程人、鼠細(xì)胞融合3.電激誘導(dǎo)融合2化學(xué)誘導(dǎo)融合同植物原生質(zhì)體融合三單克隆抗體技術(shù)1免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)三道屏障皮膚非特異性免疫特異性免疫細(xì)胞免疫：不產(chǎn)生抗體體液免疫：產(chǎn)生抗體體液免疫的特征：機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)浸入細(xì)菌的抗體。抗原決定簇抗體：是由體內(nèi)一種免疫細(xì)胞即B淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生的特殊蛋白質(zhì)，能專一性識(shí)別細(xì)菌表面的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)。2抗原和抗體抗原（antigen）：進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)抗體產(chǎn)生的外源物質(zhì)抗原的特性：從未接觸過(guò)的外源異物分子表面有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基團(tuán)作為識(shí)別位點(diǎn)相對(duì)分子量愈大，抗原性愈高抗體與抗原間的反應(yīng)是特異的3B淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體技術(shù)克隆選擇理論：一種B淋巴細(xì)胞只產(chǎn)生一種類型的免疫球蛋白分子，從一個(gè)單克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體分子就是單克隆的，這種單克隆抗體具有獨(dú)特的均一結(jié)構(gòu)（1957年，Burnet）。1975獲得了由一個(gè)克隆產(chǎn)生的抗體即單克隆抗體雜交瘤B淋巴細(xì)胞（免疫小鼠脾細(xì)胞）：骨髓瘤細(xì)胞（小白鼠的骨髓瘤細(xì)胞）：產(chǎn)生抗體，但不能體外增殖不能產(chǎn)生抗體，可體外無(wú)限增殖3B淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體技術(shù)產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞雜交瘤的技術(shù)過(guò)程：四細(xì)胞核移植與動(dòng)物克隆1.細(xì)胞核移植核移植技術(shù)：是利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，從而可能創(chuàng)造無(wú)性系雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。2.開(kāi)展細(xì)胞核移植的目的：（1）異種細(xì)胞核質(zhì)之間的遺傳相互關(guān)系研究；魚(yú)移植鯉魚(yú)囊胚期細(xì)胞核鯽魚(yú)去核受精卵檢測(cè)形態(tài)：口、須、咽像鯉魚(yú)，脊椎骨數(shù)目像鯽魚(yú)，側(cè)線鱗片數(shù)為中間類型分子鑒定：血清和血紅蛋白的電泳分析雜種魚(yú)發(fā)育（2）脊椎動(dòng)物克隆――細(xì)胞核遺傳全能性研究。是否具有遺傳全能性？處于個(gè)體發(fā)育各個(gè)時(shí)期、履行不同職責(zé)的細(xì)胞，它們細(xì)胞核的遺傳潛能是否一樣？Briggs在1952年的實(shí)驗(yàn)：蛙囊胚期細(xì)胞核克隆蛙成功；而胚胎發(fā)育后期、蝌蚪期及成蛙的細(xì)胞核克隆失敗。

胚胎發(fā)育后期及成體細(xì)胞核不具全能性尚未分化已分化1981年Illmenses用小鼠幼胚細(xì)胞核克隆出小鼠

1986年Willadsen等用早期羊胚胎細(xì)胞核克隆出羊

1964年南非科學(xué)家Gurdon取得了突破

體細(xì)胞克隆終于在1997年取得重大突破

胚胎早期細(xì)胞核具全能性Gurdon（

1964）：非洲爪蟾蝌蚪腸壁細(xì)胞核移植試驗(yàn)

；Wilmut（1997）：利用6歲綿羊乳腺細(xì)胞成功克隆出“多莉羊”

到目前為止，用體細(xì)胞克隆技術(shù)已成功克隆出小鼠、牛、山羊、綿羊、豬、兔、貓、猴子、騾子、馬等動(dòng)物。

動(dòng)物的體細(xì)胞核具有遺傳全能性英國(guó)羅斯林研究所的維爾穆特成功克隆了多莉羊（Nature,1997,

385,810–813）。多利羊的產(chǎn)生過(guò)程：芬蘭多塞特白臉綿羊蘇格蘭黑臉綿羊

蘇格蘭黑臉母綿羊

多莉?yàn)榘啄樉d羊重復(fù)227次29個(gè)異核卵發(fā)育到囊胚期植入13只代孕母羊子宮只產(chǎn)下一只羊羔3.體細(xì)胞克隆的影響和意義：①遺傳素質(zhì)完全一致的克隆動(dòng)物更有利于開(kāi)展對(duì)動(dòng)物包括人的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和健康等機(jī)制的研究；②有利于大量培養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的家畜；③經(jīng)轉(zhuǎn)基因的克隆哺乳動(dòng)物，將能夠?yàn)槿祟愄峁┝畠r(jià)藥品及易為人體接受的器官；④從同種克隆技術(shù)探索異種克隆，將極大地促進(jìn)瀕危哺乳動(dòng)物的保護(hù)工作。4.關(guān)于克隆人基于動(dòng)物克隆的發(fā)展，克隆人已成為可能支持者認(rèn)為：克隆人是科學(xué)的巨大進(jìn)步反對(duì)者認(rèn)為：克隆人類，將會(huì)導(dǎo)致一系列倫理、道德和社會(huì)問(wèn)題；學(xué)術(shù)界也持反對(duì)態(tài)度，認(rèn)為克隆人是遺傳上的退化。五染色體轉(zhuǎn)移細(xì)胞間遺傳信息轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因細(xì)胞融合染色體轉(zhuǎn)移微細(xì)胞介導(dǎo)法直接轉(zhuǎn)移法1.微細(xì)胞介導(dǎo)法

微細(xì)胞：是指只有一條或幾條染色體和一薄層細(xì)胞質(zhì)，外面包裹一層完整的細(xì)胞膜的核質(zhì)體

微細(xì)胞制備：秋水仙素處理，CB與離心并用脫核微細(xì)胞制備示意圖微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移：2直接轉(zhuǎn)移法

制取供體細(xì)胞染色體的步驟：供體細(xì)胞秋水仙素低溫處理細(xì)胞破碎高速離心收集染色體

染色體向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法：①直接用微注射針向胞內(nèi)注射染色體懸液；②染色體與細(xì)胞共培養(yǎng)，使其以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞；③將染色體與高濃度CaCl2混勻后滴加到受體細(xì)胞上；④用脂質(zhì)體包裹染色體，再經(jīng)聚乙二醇介導(dǎo)融合。六干細(xì)胞研究

在20世紀(jì)50年代，科學(xué)家在畸形胎瘤中首次發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES）干細(xì)胞（stemcell）：是動(dòng)物包括人胚胎及某些器官中具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，是重建、修復(fù)病損或衰老組織、器官的種子細(xì)胞。

3種干細(xì)胞類型：全能性干細(xì)胞：即胚胎干細(xì)胞，具有自我更新、高度增值和多向分化發(fā)育成為人體各種器官、組織、細(xì)胞，甚至形成完整個(gè)體的能力；多能性干細(xì)胞：具有分化出多種細(xì)胞、組織的潛能，但不具備發(fā)育成完整個(gè)體的能力；專一性干細(xì)胞：只能分化出一種或功能相關(guān)的兩種細(xì)胞。干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(somaticstemcell)。干細(xì)胞的特點(diǎn)具有分裂成其他細(xì)胞的可能性；具有無(wú)限增殖分離的潛能；可連續(xù)分裂幾代，也可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；以對(duì)稱或不對(duì)稱兩種方式進(jìn)行生長(zhǎng)。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ESCs，簡(jiǎn)稱ES或EK細(xì)胞。）胚胎干細(xì)胞是早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺種分離出來(lái)的一類細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性。1.胚胎干細(xì)胞具有正常、完整(雙倍體)及穩(wěn)定的染色體核型。2.胚胎干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為體積小，核大，胞質(zhì)少，有1或2個(gè)核仁，細(xì)胞與細(xì)胞緊密聚集在一起，細(xì)胞間界限不清晰，呈集落型生長(zhǎng)，形狀似鳥(niǎo)巢，集落邊緣清晰，折光性強(qiáng)。3.胚胎干細(xì)胞可以表達(dá)早期胚胎細(xì)胞特異表達(dá)基因，如堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP)基因，高端粒酶基因活性。4.胚胎干細(xì)胞具有無(wú)限增殖的能力。5.胚胎干細(xì)胞具有廣泛體外的分化能力。6.胚胎干細(xì)胞具有廣泛的體能分化能力。7.胚胎干細(xì)