第十四章、顯微攝影(2015.10.19)

第十四章

顯微攝影技術

(photomicrography)組織胚胎學教研室周莉

顯微攝影技術

什么是顯微攝影技術？是指利用顯微照相裝置把顯微鏡下觀察到的圖像拍攝下來制成照片，長期保存研究結果，以便進一步研究和交流。2.為什么要學習顯微攝影技術？

一是要保存研究結果；二是要真實地記錄研究結果。第一節(jié)攝影基礎顯微攝影是攝影學的一個分支，其基本原理相同，方法也有相似之處。故首先學習攝影的基礎知識。一、照相機鏡頭和成像原理鏡頭是照相機的關鍵部件，最早的照相機沒有鏡頭。1839年由巴黎的達蓋爾(Daguerre)利用顯影的概念發(fā)明了攝影術。照相機鏡頭和成像原理鏡頭的透鏡片組鏡頭成像原理圖（一）鏡頭的焦距（focallength)

從鏡頭的中心點到形成清晰影像的膠片或數(shù)碼CCD之間的距離。以F等于某數(shù)來表示，如F=50意旨50毫米焦距的鏡頭。（二）鏡頭的有效孔徑

即鏡頭的最大光圈（光圈是安裝在鏡頭上，用于控制光線的孔徑光闌），是表示鏡頭最大進光量的參數(shù)，其大小與鏡頭的最大直徑和焦距有關。

最大光孔直徑（25mm）1：2，F(xiàn)2

焦距（50mm）最大光孔直徑（35mm）1：1.4，F(xiàn)1.4焦距（50mm）(三）鏡頭的視角一般來說，相機的膠片和CCD的大小是固定的，因此視角大小有鏡頭的焦距長度所決定，焦距越短，視角越大，焦距越長，視角越小。焦距的長短決定視角的大小（四）景深與焦深概念：是指拍攝對象的最近清晰點至最遠清晰點之間的范圍。

前景深：被攝物前的一段清晰范圍；

后景深：被攝物后的一段清晰范圍；景深：前景深加后景深。景深受三個因素影響：光圈的大小，鏡頭焦距的長短，物距遠近。景深長景深短虛化背景（景深短）（五）鏡頭的種類根據(jù)相機鏡頭的焦距長短及其與膠片畫幅的對角線長度的關系，將鏡頭分為標準鏡頭、廣角鏡頭、遠攝鏡頭和中焦鏡頭等。1.標準鏡頭焦距約等于拍攝膠片畫幅對角線的長度，換言之，覆蓋135膠片（24mm×36mm)大小的影像所需的焦距鏡頭，稱標準鏡頭，為50mm，視角43°。鏡頭焦距越長，產(chǎn)生覆蓋膠片的影像就越大。焦距焦點距離2.廣角鏡頭：焦距短于膠片對角線的鏡頭，其焦距短于標準鏡頭，視場角度大，135相機的廣角鏡頭焦距一般為17mm-35mm，視角越大，景深也隨之增大。3.遠攝鏡頭又稱長焦距鏡頭，焦距長于底片對角線的鏡頭，焦距長于200mm以上，視角在8度以下。4.中焦距鏡頭又稱“肖像鏡頭”焦距在80-135mm,小于85mm的鏡頭拍攝，肖像容易變形，而大于135mm的鏡頭拍攝肖像容易產(chǎn)生面部扁平，只有用中焦距鏡頭拍攝，才逼真和自然。

照相機鏡頭種類與焦距焦距在攝影中的功能1.對被攝物的調焦，決定于照片的清晰度；2.焦距的長短決定視角的大小；3.景物影像的大??；4.景深的長短；5.影像變形的程度。二、感光膠片（Film)

是通過相機的光學鏡頭把拍攝的景物在感光乳膠上記錄下來，感光乳劑隨著光線的強弱發(fā)生不同變化而產(chǎn)生“潛影”，再通過沖洗，潛影就轉變?yōu)榭梢姷挠跋?。感光乳劑的主要成分時鹵化銀和明膠。黑白膠片最后形成的影像由金屬顆粒構成，彩色膠片形成的影像由染料構成。

1.感光度（sensitivity)

是膠片的感光速度，即膠片對光線照射時的反應能力。感光度高，鹵化銀顆粒較大，吸收光線的能力強，反之，感光度低，鹵化銀顆粒較小，吸收光線的能力弱，所以，感光度的高低取決于膠片乳劑的制備和加工工藝。在光線較弱的環(huán)境下拍攝，常使用高感光度膠片。但是，感光度高的膠片產(chǎn)生的影像顆粒較大，質感欠細膩和反差?。欢透泄舛饶z片產(chǎn)生的影像顆粒較細，反差較大，所形成的影像質感細膩。感光度的表示法：美國的“ASA制”，德國的“DIN制”，中國的“GB制”，后兩者表示的感光度數(shù)值相同，國際標準感光度（1980）用ISO表示：ISO100/21°，200/24°，400/27°。三、反差照片中不同部分的明暗差別程度稱反差，明暗對比強烈，則反差大，反之，則反差小。被攝物各部分的亮度差和色彩飽和度直接影響反差的大小。

反差小反差大曝光不足與曝光過度的比較

曝光不足曝光過度四、曝光控制

欲得到理想的照片曝光是關鍵，影響曝光因素有三個：光圈、快門和膠片感光度。前兩者決定進入光線的多少，后者決定于膠片對光線的反應速度。（一）光圈（Aperture）由若干金屬薄片組成，安裝在鏡頭內部，可均勻地自由開合，以調節(jié)鏡頭的相對口徑，控制進光量。一般來說，相機采用光圈系數(shù)表示口徑的大小。光圈系數(shù)（f系數(shù)）：標志鏡頭的相對口徑系數(shù)英國制：f2、f2.8、f4、f5.6、f8、f11、f16、f22、f32等。數(shù)字越大，光圈越小，可用“2n”計算任意兩檔光圈進光量的倍率關系，n為兩檔之間相差的檔數(shù)，如f2與f8相差4檔，24=16即f2進光量是f8的16倍。

調節(jié)景深，光圈小，景深長，光圈大，景深短；調節(jié)焦點深度；調節(jié)反差，光圈小，反差大，光圈大，反差??；。最佳光圈：鏡頭的分辨率和影像反差均處于最佳狀態(tài)，一般來說，把鏡頭的最大光圈收縮三檔為該鏡頭的最佳光圈。最大光圈是f2，收縮三檔，最佳光圈是f5.6

2、2.8、4、5.6、8、11、16光圈的幾個其他作用

大光圈可虛化背景小光圈的應用（二）快門

（Shutter）

快門：是光圈的開啟時間,用來控制膠片曝光時間長短的裝置。快門的開啟時間長短與曝光量的多少成正比。用某些數(shù)字的倒數(shù)秒來表示，如1/30秒、1/60秒、1/125秒等。

f系數(shù)與快門之間存在一種倒易率關系，即如果快門速度降低，光圈必須縮小，才能獲得等量的曝光。下面的組合會產(chǎn)生完全相同的膠片曝光量：f16與1/30;f11與1/60;f8與1/125;f5.6與1/250;f4與1/500。從曝光均勻這一意義來講，用小光圈慢速度，比用大光圈快速度為好。從快門本身性質來講，也是慢速度比快速度好。理想的快門速度：1/60-1/100秒。如何選擇一組合適的光圈和快門速度組合？依據(jù)不同的需要：1.景深的需要（使用光圈優(yōu)先）；2.撲捉運動物體的影像，使其不動或使其有動感。

（使用快門優(yōu)先）機械快門與電子快門：

快速快門慢速快門-1慢速快門-2慢速快門-3五、色溫

(colortemperature)色溫:是指色質，即白光的程度。所謂白光，就是日光、燈光、天空光等。攝影所用的光源有色溫，彩色膠片中的感光乳劑對色溫有一定要求,彩色膠片一般分兩類：即日光片與燈光片。日光片適合于5400K(±1200)的色溫下拍照，而燈光片適合于3200K(±700)下拍照。如何求得色溫平衡？如何利用色溫不平衡？利用低色溫拍照利用高色溫拍照B門曝光六、濾色鏡的應用(filter)（一）原色光和補色光指光的三原色，即紅、綠、藍。

補色光：攝影學光的三原色中，兩種色等量相混得出一個新的顏色，稱為補色。紅加綠等于黃；藍加綠等于青；紅加藍等于品紅；同樣，有時將三原色與三補色相互對應的顏色稱互補色，即：綠與品紅為互補色；黃與藍為互補色；紅與青為互補色。三原色和互補色三原色：紅、綠、藍三補色：黃、青、品紅互補色：綠與品紅，黃與藍，紅與青（二）濾色鏡的特性1.吸收補色；藍色濾色鏡吸收黃色2.限制補色鄰近色;藍色濾色鏡限制紅色3.通過相同色。(三)濾色鏡在攝影中的應用1.校正顏色對比

2.調整反差：與被攝物顏色互補的濾色鏡可使反差加大。3.消除或突出某種顏色4.校正色溫的作用：如光的色溫與底片色溫不相符，可用濾色鏡校正。濾光鏡的特性（通過相同色）校正色溫（用日光片在燈光下拍照）中灰漸變鏡和偏振光鏡第二節(jié)顯微攝影基本方法一、顯微鏡的幾何光學成象原理照明光源聚光鏡聚焦物鏡目鏡（入射光）（聚焦到標本上）（焦平面）

（聚焦）普通顯微鏡與特殊顯微鏡傳統(tǒng)顯微攝影與數(shù)碼顯微攝影

放大再放大一、物鏡與目鏡的選用

物鏡的分辨率就是顯微鏡的分辨率，目鏡與顯微鏡的分辨率無關；故物鏡是衡量一臺顯微鏡成像質量的重要標準。

（一）物鏡的選用以分辨率為首選指標，數(shù)值孔徑的大小決定物鏡的分辨率，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高，但大于40倍的物鏡，其景深范圍較小，不能拍攝到標本全層。

物鏡種類很多，根據(jù)物鏡像差校正程度可分為全復消色差物鏡、半復消色差物鏡和消色差物鏡。全復消色差物鏡可將可見光譜中的紅、綠、黃聚焦于一點改善球差和像差；平場物鏡可校正像場彎曲，不存在視野中心與邊緣不同時聚焦的現(xiàn)象。故平場復消色差物鏡的成像質量最好。可根據(jù)實際需要選用合適的物鏡。（二）目鏡的選用

目鏡的作用是把物鏡映來的的影像進一步放大，同時矯正物鏡成像中的像差和色差。

物鏡的標識（三）聚光鏡（condenser）聚光鏡的其作用在于將光源發(fā)散的光，有效地產(chǎn)生與物鏡相適應的光束，造成一個明亮而又均勻的視場。它同時也影響分辨率、對比度、景深和光亮度，而這些因素又直接影響顯微成像質量。聚光鏡的種類：1．阿貝聚光鏡2．消色差聚光鏡：不適用于4倍以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個視場。3．旋出式聚光鏡

二、光路合軸攝影前應檢查照明光源與顯微鏡光軸是否在一條直線上，方法：注意整個視野的光亮度是否一致，如不一致，需光路合軸。方法如下：（1）聚光器升到最高，4倍物鏡，視場光闌收縮到最小，調節(jié)聚光器至視野中視場光闌邊緣清晰；（2）轉動聚光器兩個調中螺旋桿將收縮的視場光闌圖像調至視野中心。三、光闌的調節(jié)

顯微鏡有孔徑光闌和視場光闌兩種，物鏡的數(shù)值孔徑與聚光鏡的數(shù)值孔徑相等時，物鏡的分辨率最高。聚光鏡的數(shù)值孔徑受孔徑光闌的控制。（一）孔徑光闌的調節(jié)位于聚光鏡的透鏡組之間，顯微攝影的影像反差和景深可隨孔徑光闌的縮小而提高，當孔徑光闌小于物鏡的數(shù)值孔徑時，影像的反差和景深提高，影像更加清晰。所以當孔徑光闌調整至物鏡數(shù)值孔徑的60%-80%時能獲得良好的顯微圖像?？讖焦怅@與視場光闌（二）視場光闌的調節(jié)

在正置顯微鏡，視場光闌位于鏡座之中，用于控制照明光束的直徑，即控制照野，提高顯微圖象的清晰度。

視場光闌的調節(jié)方法：將視場光闌收縮到最小位置，在標本平面中心處看到一個呈正多邊形的光斑，此為視場光闌的圖像。將其開到比取景框略大的位置為好。五、曝光補償顯微鏡攝影裝置均有自動測光和自動曝光裝置，只要正確輸入膠片的感光度一般都能獲得正確曝光。但是，當背景過亮或背景過暗，標本面積過小時，依據(jù)自動曝光裝置將會曝光不足或曝光過度。在這兩種極端情況下，需使用曝光補償。方法：

-3-2-10123曝光補償?shù)膽瞄W光燈的應用（近距離時）熒光顯微鏡曝光補償?shù)膽?/p>

曝光過度使用曝光補償減少曝光量后六、顯微攝影的基本步驟

（一）顯微鏡的使用環(huán)境

1.遠離動源；

2.室內光線不能太亮；

3.防塵、防潮、防霉。（二）攝影前準備

1．光路合軸調節(jié)

；

2．柯勒照明調節(jié)

使觀察的視野獲得均勻而又充分的照明；

3．物鏡與目鏡合理組合

4．色溫的設定：將中灰濾色鏡（ND）、色溫平衡濾色鏡（NCB）放入光路中；5．瞳距及屈光度的調節(jié)：使左右兩個視場合二為一；7．觀察時的調節(jié)（1）將欲觀察標本置于載物臺上，使選用的物鏡進入光路，并對標本對焦；（2）調整聚光鏡，并按上一步驟對視場光闌進行調節(jié)；（3）將孔徑光闌縮至物鏡數(shù)值孔徑的60%～80%。8．調焦和取景（一）倍數(shù)表示法（二）比例尺表示法（scalebar)Bar=20μm八、顯微照片放大倍數(shù)的計算第三節(jié)數(shù)碼顯微攝影技術

數(shù)碼顯微攝影是用數(shù)碼相機替代傳統(tǒng)的膠片相機進行顯微鏡下攝影的一種方法。一、數(shù)碼攝影基礎

傳統(tǒng)攝影是靠膠片上銀鹽的光化學反應來記錄通過光學鏡頭的影像，而數(shù)碼攝影是將通過光學鏡頭的影像信號轉化為可由電腦處理的數(shù)碼信息（即數(shù)字信息）。它記錄影像不使用膠片，而采用CCD等影像傳感器來接受影像信號。（一）影像傳感器1.CCD是光電耦合元件（ChargeCoupledDevice）的簡稱，具有光電轉換功能。成像原理：CCD是由數(shù)百萬只微型光電二極管感光組件構成，通常排列成小面積的長方形，在CCD上每一只光電二極管感受投射到它表面的光線強度，并將光信號轉變?yōu)殡娦盘枺a(chǎn)生電荷。光強弱不同，產(chǎn)生的電荷也不同。所以，每只光電二極管感受不同的光線強度，產(chǎn)生不同的電荷。2.CMOSCMOS（ComplementMetalOxideSemiconductor）,意為“互補性氧化金屬半導體”。是計算機內重要記憶芯片，也可加工成數(shù)碼相機的感光元件。CMOS的集成度高，可以把許多電路集成在單一芯片上，例如，信號處理、模/數(shù)轉換、放大電路、時鐘驅動等，而這些在CCD的數(shù)碼相機上均為分離的芯片。因而，CMOS成本低，耗電少。CMOS的主要缺點，一是噪音較大，易在數(shù)碼影像上引起雜點；二是敏感性較低，影響“ISO感光度”的提高。（二）影像傳感器像素

CCD或CMOS上每一個光敏單元對應圖像中的一個點，這個點即為像素（pixed),是形成影像的最小單位。像素的多少決定于數(shù)碼相機的分辨率，是表示相機檔次的主要依據(jù)之一。但并不是唯一標準。表示方法：①陳列表示法：即“橫、縱像素的乘積”，例如，像素640×480，像素1024×768；②總量表示法：如像素100萬，300萬等。

內插值只是將CCD的像素總量通過某種軟件進行一定程度的軟化模糊處理，再在影像相同部位的空隙進行填充來增加像素。這種經(jīng)內插處理后，CCD本身像素并沒有改變，也不能從根本上提高影像的最終質量。例如，CCD本身像素300萬，經(jīng)“內插”標稱像素總量達到500萬。這種500萬的內插值與本身具有500萬像素的CCD質量不能等同。

（三）相當感光度此概念并非完全指它對光線的敏感性能。拍攝時影像傳感器產(chǎn)生的信號在進行模/數(shù)轉換前需要進行放大，當提高數(shù)碼相機感光度拍攝時，圖象傳感器輸出的信號并未改變，只是改變了信號的放大倍率，實際上并未影響到影像傳感器本身。使用方法與傳統(tǒng)相機相同，在熒光顯微鏡攝影時常用，一般調節(jié)到ISO200以上。當ISO過大時，會引起過多的“噪聲”，表現(xiàn)為雜點增多。（四）白平衡

白平衡功能是一種針對不同光照環(huán)境的顏色糾正功能，是讓白色的物體在不同光照環(huán)境下依然呈現(xiàn)白色的功能。它的作用類似傳統(tǒng)相機彩色攝影中校正色溫濾光鏡，用以獲取準確的色彩還原。數(shù)碼相機有自動（2500-6500K)、自定義與手動白平衡功能。（五）數(shù)碼圖片數(shù)碼圖片的主要指標（1）圖片大?。簣D像尺