第7章種質離體保存

第七章種質離體保存概述低溫保存的細胞學基礎保存中遺傳變異的檢測與利用影響保存效果的因素超低溫保存的方法1幾個相關概念（見《園藝植物育種學》）種質（germplasm）：決定生物的遺傳性狀，并將遺傳信息從親代傳遞給子代的遺傳物質。種質資源包括動植物的個體、器官、組織、細胞甚至控制生物遺傳性狀的基因。種質庫：又稱基因庫（GenBank），是以種為單位的群體中的全部遺傳物質，它由許多不同基因型的個體所組成。種質資源（germplasmresource）或遺傳資源（geneticresource）：具有種質并能繁殖的生物體。種質資源保存：為避免種質資源的流失，利用自然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，實現(xiàn)種質材料生活力的長期保持。2種質資源保存方法就地保存（自然保護區(qū)）遷地保存（種質圃保存）種子保存離體培養(yǎng)保存基因文庫保存常溫限制生長保存中低溫調控生長保存低溫干燥保存減壓保存低溫保存（低于-80℃）超低溫保存（-196℃）難以長期保持種質壽命，對種質保存的作用不是很大。按保存條件（溫度、含氧量等）按材料和方式3第一節(jié)概述一、植物種質資源低溫保存的意義防止物種或品種滅絕節(jié)省人力物力便于種質資源的國內外交流4二、超低溫保存的概念

低溫保存（cryopreservation）是由cryo和preservation組成，在英語中cryo為一前綴，被解釋為低溫、冷、冰、霜之意。從詞義看，低溫所涉及的溫度范圍是不確定的。超低溫:≤-80℃極低溫:≤-70℃(干冰溫度)低溫:≤4℃

5但對植物而言，低溫常常是指那些比常溫稍低一些的溫度。如果低溫超過細胞原生質所能忍受的臨界溫度，就會致使植物細胞遭受凍害而死亡。如甜橙樹發(fā)生凍害的臨界溫度通常在-6.5℃，枳殼通常在-20℃左右（沈德緒等，1986）。6低溫保存（Cryopreservation），是指將植物的組織或細胞經(jīng)過防凍處理后，在低于-80℃條件下保存的方法。超低溫保存：將植物的組織或細胞經(jīng)過防凍處理后，在-196℃的極端低溫下保存的方法。7超低溫保存的優(yōu)點:在超低溫條件下，活細胞內的物質代謝和生長活動幾乎完全停止，呈現(xiàn)“假死”狀態(tài)。因此，細胞、組織和器官在此過程中不會發(fā)生遺傳性狀的改變，也不會丟失形態(tài)發(fā)生的潛能。在超低溫條件下，生命的代謝和衰老過程也基本停止，故能夠實現(xiàn)長時期的保存。8超低溫保存的意義:可以在有限空間內保存大量種質材料；與種子保存相比，可以不受時間和種子含水量的制約；與試管苗相比，可以避免頻繁繼代培養(yǎng)造成的變異，并大幅度減少工作量。9常用的超低溫保存方法：冷凍誘導保護性脫水的超低溫保存法玻璃化處理的超低溫保存法10三、超低溫保存的研究概況1．超低溫保存技術的發(fā)展2．用于超低溫保存的植物材料3．超低溫保存的植物種類

據(jù)王君暉等1998年統(tǒng)計，有40多個屬60多個種的木本植物已進行了超低溫保存研究，其中：種子、胚、胚軸和胚的保存一般采用干凍法；莖尖和分生組織多采用玻璃化法或包埋脫水法；愈傷組織和懸浮細胞大多采用兩步法。1112第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎一、細胞內外水的凍結狀態(tài)是細胞凍存技術的關鍵

植物細胞中含有大量的水分，約占細胞總重量的60-90％。細胞中的水由游離水和束縛水組成，其中游離水約占90％，很容易凍結，由于細胞內含有許多化合物，因此細胞內溶液并不象純水那樣在0℃就結冰。131.細胞內外水分的凍結特性

理論上講，細胞外水的凍結溫度為-5～-15℃，細胞內游離水的凍結溫度為-25℃，故在-30℃時，細胞內的游離水全部被凍結，而結合水則在-100℃溫度下也不發(fā)生凍結。14根據(jù)Luyet的凍結理論（1937），細胞內游離水的凍結溫度（-30℃）可認為是細胞凍存的安全溫度，因而細胞凍存的兩步凍結法一般以-30℃為基礎的。也就是說，控制細胞內外水的凍結狀態(tài)，是細胞凍存技術的關鍵。15超低溫保存的原理為什么在超低溫條件下材料不會凍死。關鍵原因是進行了“防凍處理”，具體如下：使用冷凍防護劑可以降低培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的冰點。使用冷凍防護劑可以提高培養(yǎng)基的滲透壓，導致細胞發(fā)生輕微質壁分離，從而提高了組織和細胞的抗寒能力。16根據(jù)細胞內外水分的凍結特性，凍存方法有：分步冷凍：在細胞內游離水凍結之前，先使細胞外水分凍結，從而使細胞內游離水向胞外滲溢，導致細胞適度脫水，利于細胞的冷凍保存。快速冷凍：也稱玻璃化冷凍保存技術，通過迅速降溫，使細胞內水凍結產(chǎn)生的冰晶體積非常小，呈現(xiàn)為一種玻璃狀的凍結現(xiàn)象，避免細胞受到傷害，達到細胞冷凍保存的目的。172.低溫下細胞的致死損傷超低溫保存的一般過程：超低溫保存是建立在生物細胞凍害和抗凍機理的基礎之上的。超低溫保存成功的關鍵，在于降溫過程中避免細胞內溶液結冰。為此，對于不同的植物種類或材料，應篩選相應的冰凍保護劑，采用適當?shù)慕禍厮俣燃盎瘍龇绞?，才能使細胞不受損傷或損傷最小。預凍超低溫長期保存解凍18第三節(jié)超低溫保存的方法超低溫保存的程序包括培養(yǎng)材料的準備、預處理、冰凍及保存、化凍處理、細胞活力測定、植株再生和變異評價等步驟。降溫冰凍方法玻璃化保存方法超低溫保存的方法19一、傳統(tǒng)的降溫冰凍方法1．慢凍法：以0.5-2℃/min速度降溫至-100℃后投入液氮，或以該速度一直降溫至-196℃后投入液氮。在冰凍保保護劑的作用下，既可避免在細胞脫水時細胞內產(chǎn)生冰晶，又能防止因溶質含量增加引起的“溶液效應”。因此，對于原生質體、懸浮培養(yǎng)細胞等細胞類型一致的培養(yǎng)物，這種方法效果最好。202．快凍法：將材料用玻璃瓶或錫箔紙袋保護后直接投入液氮或液氮的蒸氣相中，該方法對高度脫水的材料如種子、花粉及抗寒性很強的休眠枝條或冬芽比較適宜，對含水量高的細胞培養(yǎng)物則不適合。213．分步冰凍法：是慢凍法和快凍法的結合，先用較慢的速度(0.5～4℃/min)降至-30～-40℃，停留0.5～1h，然后直接投入液氮中保存。停留的目的是誘導細胞外水分結冰，對細胞進行保護性脫水，避免細胞內產(chǎn)生非均一性冰晶。224.干凍法：將樣品在高濃度(0.5-1.5M)滲透性化合物培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)小時至數(shù)天，再經(jīng)過硅膠、無菌空氣干燥脫水數(shù)小時(使含水量降至17～40％)或用藻酸鹽包埋后投入液氮保存。該法特別適合于愈傷組織、體細胞胚、胚軸、胚、莖尖、生根苗保存，但不適用于脫水敏感的材料。23二、玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液體轉變?yōu)榉蔷w玻璃態(tài)的固化過程。使溶液玻璃化有兩條途徑：一是大幅度提高冷卻速率；二是增加溶液濃度。241.玻璃化法

玻璃化法是指將生物材料經(jīng)高濃度玻璃化溶液快速脫水后，直接投入液氮，使材料連同玻璃化溶液同時轉變成玻璃態(tài)。在此過程中，水分子沒有發(fā)生重排，不形成冰晶，不發(fā)生結構和體積的改變，因而不會對材料造成機械損傷。當保存終止后，通過快速化凍防止去玻璃化的發(fā)生。如果材料能夠安全度過冷卻和化凍兩個關口，凍存即告成功。252.包埋玻璃化法包埋玻璃化法是包埋脫水法和玻璃化法的結合。先把保存材料用藻酸鈣包埋，再經(jīng)蔗糖濃度梯度脫水和玻璃化溶液處理后投入液氮保存，其存活率比包埋脫水法要高，可能是因為藻酸鈣的包埋減輕了玻璃化溶液的毒性。26包埋玻璃化的實例(a)將離體培養(yǎng)誘導的莖尖在黑暗和低溫（4℃）條件下進行鍛煉。(b)用海藻酸鈣包埋莖尖。(c)將包埋體置于超凈工作臺上吹風干燥。(d)將包埋體在含0.75M蔗糖的培養(yǎng)基上預培養(yǎng)，進一步脫水。(e)將包埋體置于冷藏管中，投入液氮中保存。(f)快速化凍。(g)植株再生。27第四節(jié)

影響超低溫保存效果的因素材料的基本特性冰凍保護劑的應用再生技術預培養(yǎng)與低溫鍛煉解凍方法28一、材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性、器官、組織或細胞的年齡以及生理狀態(tài)等（特別是基因型）。

植物細胞培養(yǎng)物的生長年齡，也是決定凍后細胞成活率的最重要因素之一。指數(shù)生長期和滯后期的幼齡細胞抗凍力強，存活率高。29二、預處理和低溫鍛煉預處理對于調整植物材料的生理狀態(tài)非常有效，可以減少細胞內自由水含量，減輕冷凍傷害，提高抗凍能力。預處理措施:包括提高培養(yǎng)基的糖濃度、提高滲透壓以減少細胞內自由水含量；在預培養(yǎng)基中添加誘導抗寒力的物質或冰凍保護劑，如0.3-1.0Ｍ蔗糖、甘露醇、山梨醇等滲透壓調節(jié)劑，5-10％DMSO等冰凍保護劑。低溫預培養(yǎng)：將材料于0℃以上低溫、黑暗或弱光下離體培養(yǎng)幾周，可明顯增強其忍耐冷凍能力。30三、冰凍保護劑的應用冰凍保護劑（Cryoprotectiveagent，CPA）也稱抗凍劑，為植物低溫保存必不可少。特點：易溶于水，對細胞無毒害，容易從組織或細胞中清除。作用：增加膜透性，加速細胞內水流到細胞外結冰；穩(wěn)定細胞膜結構，阻止低溫傷害；降低冰點，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶的生長。依據(jù)滲透性的有無，可將CPA分為兩類：

滲透型非滲透型&31滲透型冰凍保護劑特點：多為中性低分子物質，在溶液中易與水分子結合發(fā)生水合作用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰點，從而弱化了水結晶的過程，達到保護材料的目的。

種類：常用的有甘油、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）。不同滲透型冰凍保護劑滲入細胞的能力及其對水分子活性的影響也有不同，如甘油適用于慢速冷卻，DMSO容易滲入細胞，但有輕微毒性。32非滲透型冰凍保護劑特點：能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，在特定溫度下能夠降低溶質（電解質）濃度，從而起到保護作用。種類：主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖(Dextrane)、聚乙二醇(PEG)、白蛋白(Albumin)、羥乙基淀粉(HES)等。33四、解凍方法根據(jù)解凍速度分為快速解凍和慢速解凍兩種方式：快速解凍：能使材料迅速通過冰融點的危險溫度區(qū)(-50～-10℃)，防止降溫過程中形成晶核對細胞造成損傷。通常的做法是把樣品放入37～45℃溫水浴中，待冰完全溶化后（約90s）立即移開。慢速解凍：對于脫水處理后干凍保存的材料，一般認為應先置于0℃下一段時間，再于室溫下緩慢解凍效果較好。34另外，不同材料或方法采用的化凍方式也有不同：材料含水量：液泡小、含水量少的細胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法；液泡大、含水量高的細胞則一般需要采用慢速化凍法。材料的生理狀態(tài)：生長季節(jié)中的材料，一般在37～45℃溫水浴中快速化凍（500-700℃/min）比在室溫下慢速化凍要好，而木本植物的冬芽，在超低溫保存后，必須在0℃低溫下進行慢速化凍才能達到良好的效果。保存方法：玻璃化凍存的材料在保存終止后，要求快速化凍，以防止次生結冰對組織細胞造成傷害。351.冷凍保存后細胞和器官活力的檢測再培養(yǎng)法測定存活率存活細胞(或器官)數(shù)目解凍(或器官)數(shù)目存活率=×100%五、培養(yǎng)及再生36經(jīng)凍存的材料，不可避免地受到一些傷害，需要小心維護：培養(yǎng):一般將材料培養(yǎng)在黑暗或弱光下培養(yǎng)1-2周，再轉入正常光照下培養(yǎng)。

培養(yǎng)基:一般是保存前使用的培養(yǎng)基，但有時需將大量元素或瓊脂含量減半，或在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等，以利于材料的恢復生長。

2.培養(yǎng)及再生37六、超低溫保存中變異及其檢測保持原有種質的遺傳穩(wěn)定性，是種質保存的基本要求。超低溫保存的遺傳變異屬于體細胞變異。變異與起始細胞的生理狀態(tài)和培養(yǎng)基、預處理方式、解凍方式等有關（變異基本上都是在非超低溫下產(chǎn)生的）。在保證保存材料活性的同時，應盡量采用減少變異的方法技術。38為了掌握超低溫保存材料的遺傳變異情況，有必要在保存材料的恢復和再生階段建立有效的檢測體系。目前，形態(tài)學觀察、細胞學方法、同功酶、分子標記（如RFLP和RAPD）等檢測方法常常單獨或結合起來用于遺傳變異分析。39種質超低溫保存法程序示意圖植物器官、組織和細胞細胞生長或植株再生再培養(yǎng)玻璃化凍存法分步冷凍法（兩步法、多步冰凍法）加冷凍防護劑（0℃）快速冷凍法（降溫速度1000℃/min）預處理（加速繼代、提高培養(yǎng)基滲透壓、低溫鍛煉）種質庫（-196℃）迅速解凍（34-45℃）包埋干燥冷凍法40

植物種類參考文獻白花三葉草（Trifoliumrepens）Yamadaetal.1991白薯（Ipomoeabatatas）

Towill1992百合（LiliumjaponicumThumb）Matsumoto1995,Sakai&Matsumoto1996菠蘿（Ananascomosus）Gonzalez-Arnaoetal.1998薄荷(MenthaspicataL.)Hiraietal.1999茶（Camelliasinensis）Kuranuki&Sakai1994大麻（HumuluslupulusL.）Martínez1999大蒜（AlliumsativumL.）Niwataetal.1998豆莢樹(Acaciamangium)Sudarmonowatietal.1998番木瓜（Caricapapaya）Towill1990甘蔗(BetavulgarisL.cloneSES1)Vandenbusscheetal.1998,柑橘（Poncirustrifoliate(L.)Raf.）Gonzalez-Arnaoetal.1998龍膽（GentianascabraBungevarbucrgcriMaxim.）SukaiandMatsumoto1996蘆筍（Asparagusofficinalis）Uragamietal.1990,Kohmuraetal.1992陸生蘭（Cymbidiumspp）Thinhetal.1998馬鈴薯（Solanumtuberosum）Fabre&Dereuddre1990獼猴桃（Actinidiadeliciosa）Suzukietal.1994苜蓿(MedicagosativaL.)Shiblietal2001蘋果（Matusdomestica）Niinoetal.1992,Niino&Sakai1992,Pauletal2000葡萄（VitisvinifcraL.cv.chardonnay）Plessoaetal.1994桑樹（Manihotesculenta）Niinoetal.1992山茱菜（Wasabiajaponica）Matsumonoetal.1994,Sakai&Mataumoto1996麝香石竹（Dianthuscaryophullus）Langisetal.1990,Towill1990柿(DiospyroskakiThunb.)Matsumotoetal.2001薯蕷(Dioscoreaspp)Mandal1995香蕉(Musaspp.)Helliotetal.2002杏（PrunusdulcisMill.）Shatnawietal.1998洋梨（Pyruscommunis）Niinoetal.1992,Dereuddreetal.1990,Niino&Sakai1992芋（Colocasiaesculenta(L.)schott）Takagietal.1997蕓苔（Betavulgaris）Kohmuraetal.1992

玻璃化法和包埋脫水法保存植物莖尖文獻一覽表

41冷凍保存的應用前景1、長期保存種質的遺傳穩(wěn)定性。2、長期保存去病毒的種質。3、保持稀有珍貴及瀕危植物的種質資源。4、保持不穩(wěn)定性的培養(yǎng)物，如單倍體。5、保持培養(yǎng)細胞形態(tài)發(fā)生的能力。6、防止種質衰老。7、延長花粉壽命，解決不同開花期和異地植物雜交上的困難。8、冷凍解