布魯氏菌病原學(xué)血清學(xué)診斷

布魯氏菌病原學(xué)血清學(xué)診斷第一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容：1、布魯氏菌病原學(xué)；2、布魯氏菌診斷標(biāo)準(zhǔn)；3、布魯氏菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的幾種方法。第二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（一）布氏菌概述

1887年英國(guó)醫(yī)生布魯氏首先從死于“馬爾他熱”的英國(guó)士兵脾臟中分離出羊種布氏菌后，布魯氏菌屬（Brucella)，包括6個(gè)種19個(gè)生物型。羊種布氏菌（Brmelitensis)

牛種布氏菌（Brabortus)

豬種布氏菌（Brsuis)

沙漠森林野鼠種布氏菌（Brneotomae)

綿羊附睪種布氏菌（Brovis)

犬種布氏菌（Brcanis)第三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日布魯氏菌的發(fā)展史年份菌名發(fā)現(xiàn)人國(guó)家宿主1887羊種菌Bruce馬爾他羊1897牛種菌Bang丹麥牛1914豬種菌Traun美國(guó)豬1953綿羊附睪種菌Buadle新西蘭公綿羊1956沙漠森林鼠種菌Stoennen美國(guó)沙漠森林野鼠1966犬種菌Carmichael美國(guó)小獵犬第四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（一）病原學(xué)概述布魯氏菌屬（Brucella)包括6個(gè)種19個(gè)生物型。

牛種布氏菌（Brabortus)：1、2、3、4、5、6、7、9型

羊種布氏菌（Brmelitensis)：1、2、3型豬種布氏菌（Brsuis)：1、2、3、4、5型沙漠森林野鼠種布氏菌（Brneotomae)

綿羊附睪種布氏菌（Brovis)

犬種布氏菌（Brcanis)第五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日1、形態(tài)

布魯氏菌是一組微小的球狀、球桿狀、短桿狀細(xì)菌；寬約0.3—0.5微米、長(zhǎng)0.6—1.5微米。電鏡下見到的羊種菌為明顯的球桿狀、牛種菌和豬種菌為短桿狀；6種布魯氏菌靠形態(tài)很難區(qū)分，一般來說，羊種菌最小，牛種菌產(chǎn)次之，豬種菌較大；布魯氏菌沒有鞭毛，不形成芽胞和夾膜。第六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日2、染色涂片染色檢查多為單個(gè)排列，少見成對(duì)短鏈排列。布魯氏菌可被堿性染料著色；革蘭染色陰性；柯茲羅夫斯基提出用0.5%沙黃水溶液染色，加熱出現(xiàn)氣泡，水洗后用0.5%孔雀綠或1%美蘭復(fù)染，布魯氏菌呈紅色，其它細(xì)菌呈綠色和蘭色。第七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日布魯氏菌：

革蘭陰性，μm,

μm,

用柯氏染色染成紅色,無(wú)鞭毛、不形成芽胞和莢膜。第八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日3、培養(yǎng)特性1.布魯氏菌培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求高：需要各種氨基酸和各種金屬離子，有的菌種需要血清才能生長(zhǎng)。2.生長(zhǎng)緩慢：一般需經(jīng)4—6天，有的甚至21—30天才能長(zhǎng)出菌落。3.生長(zhǎng)所需溫度：20—40℃，最適為37℃,超過42℃則不生長(zhǎng)。4.C02:

綿羊附睪種菌和牛種菌的某些生物型菌需嚴(yán)格的C02(5～10％)。

第九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（4）細(xì)菌變異布氏菌在各種理化因素作用下易發(fā)生變異;即從光滑型（S）變?yōu)榉枪饣汀植?R)或粘液(M)狀。變異菌落常比光滑型稍長(zhǎng)，表面有顆粒。菌落顏色為灰白色或褐色，第十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（5）抵抗力

布氏菌在合適條件下能生存很長(zhǎng)時(shí)間，有較高的抗滅活能力。對(duì)濕熱、紫外線和各種射線以及常用的消毒劑、抗生素、化學(xué)藥物比較敏感；對(duì)低溫和干燥有較強(qiáng)的抵抗力，故可用冷凍真空干燥法保存菌種。第十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日布氏菌在自然條件下的生存能力

自然條件生存時(shí)間（天）自然條件生存時(shí)間（天）水50—120奶油25—65塵4—120奶酪21—90糞21—72凍肉14—47畜舍墻棚

4—150腌肉20—45地面4—150培養(yǎng)基60—318衣服30—80干燥胎膜120皮毛45—120腐敗臟器死亡鮮牛乳2—550人工胃液20—50第十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日

(1)對(duì)物理因子的抵抗力

物理因子對(duì)布氏菌的影響物理因子生存時(shí)間物理因子生存時(shí)間濕熱56℃60分鐘以上干熱80℃60分鐘以上濕熱63℃60分鐘以上干熱90℃60分鐘以上濕熱80℃30分鐘以上干熱100℃7分鐘以上濕熱90℃10分鐘以上直射陽(yáng)光1～4小時(shí)濕熱100℃半分鐘死亡散射陽(yáng)光7～8天第十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日

(2)對(duì)化學(xué)因子的抵抗力

化學(xué)因子對(duì)布氏菌的影響

藥物名稱濃度(%)生存時(shí)間藥物名稱濃度(%)生存時(shí)間新潔爾滅0.130秒鐘漂白粉0.2～2.52分鐘以內(nèi)石炭酸1～21～5分鐘紅汞27分鐘來蘇兒21～3分鐘過錳酸鉀0.1～0.27～15分鐘來蘇兒31分鐘以內(nèi)甲醛0.220分鐘以上氯亞明0.25～7分鐘乳酸0.51分鐘以內(nèi)氯亞明0.53～5分鐘氫氧化鉀23分鐘升汞0.051分鐘以內(nèi)肥皂220分鐘以上第十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日主要化學(xué)藥品對(duì)三型菌的影響──────────────────

濃度布魯氏菌生存時(shí)間(分鐘)化學(xué)藥品名稱──────────────(%)羊型牛型豬型──────────────────石碳酸1≤5≤3≤5石碳酸2121來蘇兒2≤3≤1≤3來蘇兒3瞬間瞬間瞬間漂白粉澄清液0.21-2瞬間瞬間漂白粉乳劑2.51-2瞬間瞬間

肥皂水2≥20≥20≥20─────────────────────────────第十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（二）布魯氏菌分離培養(yǎng)采用何種方法、取何種材料、何種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)室條件第十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日布氏菌的分離培養(yǎng)一、從可疑病人分離布氏菌血培養(yǎng)：30天未培養(yǎng)出菌，可定位陰性。

骨髓培養(yǎng)：抽取骨髓（接種雙相培養(yǎng)基）尿培養(yǎng)：其他病原材料培養(yǎng):乳、腦脊液、關(guān)節(jié)液和滑囊液分離布氏菌，參照血培養(yǎng)觀察結(jié)果，15天不長(zhǎng)菌定為陰性第十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日二、從牲畜材料中分離布氏菌

從牲畜流產(chǎn)羔檢菌：從胎衣檢菌：從陰道分泌物檢菌：尿液檢菌：乳汁檢菌：膿汁檢菌：血液培養(yǎng)：臟器檢菌：第十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日我國(guó)出菌宿主及材料我國(guó)從人、羊、牛、豬、犬、鹿、馬、駱駝等家畜及黃羊、巖羊、黃鼠、黃胸鼠等野生動(dòng)物檢出布氏菌。從牧區(qū)水塘水和羊毛中也檢出過布氏菌。出菌材料有血液、關(guān)節(jié)液、滑囊液、骨髓、腦髓液、胸液、淋巴結(jié)、乳汁、膿汁、膽汁、尿、陰道分泌物、等20余種。由于取材難易等原因，人多由血液、關(guān)節(jié)液、滑囊液、骨髓出菌；羊多由流產(chǎn)羔、胎盤、死羔檢出菌；牛多由流產(chǎn)犢、乳汁檢出菌；豬多由流產(chǎn)仔豬、胎盤出菌。第十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日布氏菌的鑒定及分型

(一)常規(guī)確定布氏菌屬細(xì)菌的方法菌落生長(zhǎng)時(shí)間和形態(tài);菌體形態(tài)和染色;布氏菌血清凝集試驗(yàn);(二)特殊方法：1．細(xì)菌DNA鳥嘌呤十胞嘧啶克分子百分比(C+CMOL％)的測(cè)定;2．布氏菌DNA與可疑菌DNA雜交試驗(yàn);3．應(yīng)用色譜技術(shù)鑒定布氏菌;第二十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日布氏菌屬的種、型鑒定方法

初代分離培養(yǎng)對(duì)二氧化碳的需要

硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)染料抑菌試驗(yàn)單項(xiàng)特異性血清A、M、R凝集試驗(yàn)粗糙型（R型）血清凝集試驗(yàn)（玻片、試管法）噬菌體裂解試驗(yàn)?zāi)蛩孛富钚栽囼?yàn)第二十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日布魯氏菌分離用培養(yǎng)基血清葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基胰酶大豆培養(yǎng)基土豆瓊脂培養(yǎng)基胰示瓊脂Albimi瓊脂培養(yǎng)基肝瓊脂培養(yǎng)基土豆+10%馬血清培養(yǎng)基效果最好第二十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日SAT滴度與培養(yǎng)陽(yáng)性的符合率第二十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日BSL－2：實(shí)驗(yàn)室設(shè)施(二級(jí)屏障)第二十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日

人間布病診斷方法和判定標(biāo)準(zhǔn)

1、流行病學(xué)接觸史：密切接觸家畜、野生動(dòng)物、畜產(chǎn)品、布魯氏菌培養(yǎng)物等或生活在疫區(qū)內(nèi)的居民。

2、臨床癥狀和體征:應(yīng)排除其他疑似疾病。

3、實(shí)驗(yàn)檢查：病原分離試管凝集試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗人球蛋白試驗(yàn)參考：（皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)）

第二十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日人間布病血清學(xué)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)病原分離:檢出布魯氏菌；試管凝集試驗(yàn):1:100(++)及以上為陽(yáng)性；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn):1:10(++)及以上為陽(yáng)性；抗人球蛋白試:1:400(++)及以上為陽(yáng)性；

第二十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日人間布病診斷方法和判定標(biāo)準(zhǔn)凡具備1、2和第3項(xiàng)中的任何一項(xiàng)檢查陽(yáng)性即可確定為布病病人。對(duì)已確診的慢性布病病人和接種過菌苗的人，應(yīng)以臨床癥狀為主要依據(jù)，血清學(xué)試驗(yàn)效價(jià)高低，皮變反應(yīng)僅供參考。第二十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日(1）布氏菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

原理：當(dāng)機(jī)體受布氏菌抗原作用之后，導(dǎo)致T細(xì)胞過敏。致敏T細(xì)胞再遇到相同抗原后進(jìn)行分化，衍變，產(chǎn)生能釋放各種淋巴因子的效應(yīng)細(xì)胞，局部的皮膚變態(tài)反應(yīng)就是各種淋巴因子綜合作用的結(jié)果，是一種遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。注意：布氏菌素注射后，不會(huì)使人感染布?。灰膊粫?huì)導(dǎo)致常規(guī)檢測(cè)的抗體增加。器材及試劑：布氏菌素、酒精棉球，1ml注射器，測(cè)量尺第二十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)操作方法1.每次注射前必須詳細(xì)詢問職業(yè)、健康情況曾否接種過布氏菌活菌苗等。2.前臂掌側(cè)中部皮膚用75%酒精棉球消毒，待干后，用1ml注射器皮內(nèi)注射0.1ml。3.判定反應(yīng)時(shí)間：注射后24、48h各觀察一次（以48H結(jié)果為準(zhǔn)）。4.判定反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性反應(yīng)局部紅腫達(dá)2x2cm或面積4cm2第二十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)注意事項(xiàng)部位：要皮內(nèi)注射，切勿皮下注射劑量：為0.1ml，注射后應(yīng)在注射部位有小白泡隆起，注射液不得從針口漏出。消毒：用酒精，切勿用碘酒，以免引起假陽(yáng)性反應(yīng)。面積計(jì)算：浸潤(rùn)、偽足都屬于測(cè)量范圍制品渾濁，有搖不散的沉淀，有異物，安瓶有裂紋，標(biāo)簽不清，過期失效者不可使用。保存：布氏菌素于4-10℃冷暗處.第三十頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)禁忌

既往有各種過敏史者，支氣管哮喘病者不可使用第三十一頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日

評(píng)價(jià)：

此法敏感性較好，呈陽(yáng)性反應(yīng)的人只表示受過布氏菌感染，不能做最后判定。此法用于流行病學(xué)調(diào)查和大量檢疫，所以布病監(jiān)測(cè)時(shí)為初診方法，若皮變陽(yáng)性，應(yīng)采血進(jìn)一步做特異性抗體檢測(cè)。第三十二頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（2）試管凝集試驗(yàn)原理：

Ag+AbAg-AbNacl電介質(zhì)布氏菌侵入機(jī)體后，就會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，這種抗體可與相應(yīng)抗原（布氏菌體）發(fā)生特異性結(jié)合，在電介質(zhì)作用下，就會(huì)形成肉眼可見的凝集反應(yīng)，我們就是用已知抗原查未知抗體。第三十三頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日試管凝集反應(yīng)步驟1、加入倍比稀釋受檢血清0.5ml2、加入1：10稀釋布氏菌抗原0.5ml37度24小時(shí)觀察結(jié)果同時(shí)配置比濁管便于結(jié)果判定第三十四頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日0.50.50.50.5試管凝集反應(yīng)（SAT）示意圖(1)0.50.50.50.50.50.5稀釋血清1:251:501:1001:2001:4000.5棄去稀釋度第三十五頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日比濁管的制備管號(hào)1:20稀釋抗原生理鹽水清亮度標(biāo)記10.001.00100%++++20.250.7575%+++30.500.5050%++40.750.2525%+51.000.000%-第三十六頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日每次試驗(yàn)須作三種對(duì)照陰性血清對(duì)照陽(yáng)性血清對(duì)照抗原對(duì)照第三十七頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果判定：根據(jù)各管中上層液體的清亮度記錄凝集反應(yīng)程度（滴度），特別是50%清亮度（++）對(duì)判定結(jié)果關(guān)系較大，一定要與比濁管對(duì)比判定。++++等于完全凝集，上層液100%清亮。+++等于幾乎完全凝集，上層液75%清亮。++等于顯著凝集，上層液50%清亮。+等于有凝集出現(xiàn)，液體25%清亮。-等于無(wú)凝集，液體不清亮。人的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1:100++為陽(yáng)性，1:50++為可疑。第三十八頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日評(píng)價(jià)：試管凝集試驗(yàn)是Wright和Sample于1898年首先建立的，是布病診斷在國(guó)際上唯一的全標(biāo)化方法，使用廣泛，經(jīng)久不衰。特異性好，也較敏感，實(shí)用性強(qiáng)，診斷、流調(diào)、監(jiān)測(cè)均適用。缺點(diǎn)：—有前帶現(xiàn)象?！荒軈^(qū)別人工免疫和自然感染?！a(chǎn)生一定的交叉反應(yīng)?！枰獌商?。第三十九頁(yè)，共四十五頁(yè)，2022年，8月28日（3）、虎紅平板凝集試驗(yàn)

(一)器材及試劑清潔脫脂玻片或有凹型孔的玻片，0.1毫升吸管或微量加樣器、牙簽或細(xì)鐵絲?；⒓t平板凝集抗原、被檢血清。(二)操作方法在玻片上加0.03毫升被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03毫升，