植物組織培養(yǎng)技術(shù)86878126

植物組織培養(yǎng)技術(shù)1緒論組培是二十世紀發(fā)展起來的新技術(shù)，近四十年來發(fā)展極為迅速，幾乎以植物為研究對象的各個分支學(xué)科都在廣泛進行組織培養(yǎng)。

1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt

根據(jù)細胞學(xué)說提出細胞全能性（totipotency）理論。初步成功：1904年Hanning

最先成功培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚→開始大量實驗，技術(shù)逐步完善→1960年“蘭花工業(yè)”巨大利潤沖擊→促使新一輪研究熱潮興起→奠定新興獨立學(xué)科→植物組織培養(yǎng)學(xué)。

目前達到的水平：從任何植物器官、組織、細胞甚至沒有細胞壁的裸露原生質(zhì)體中再生小植株。在這一技術(shù)基礎(chǔ)上各國競相投資，在快繁、脫毒、育種、次生代謝物生產(chǎn)、種質(zhì)資源的保存方面取得了巨大的社會、經(jīng)濟、生態(tài)效益。第一章植物組培的基本理論

第一節(jié)植物組培的概念

一.概念

廣義：離體條件下利用人工培養(yǎng)條件在無菌情況下培養(yǎng)、生長、發(fā)育再生出完整植株的過程。

狹義：將離體植物器官、組織、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當培養(yǎng)條件，使細胞增殖或誘導(dǎo)長成完整的植株。根據(jù)外植體來源又分：

（一）按培養(yǎng)對象可分：

1.植株培養(yǎng)：是對完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株。

2.器官培養(yǎng)：離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要不同，包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體培養(yǎng)。

3.組織或愈傷組織培養(yǎng)：為狹義組織培養(yǎng)，對植物體各部分組織進行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進行培養(yǎng)，二者均通過再分化誘導(dǎo)形成植株。

4.細胞培養(yǎng)：對由愈傷組織等液體振蕩培養(yǎng)得到的，能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞，或很小的細胞團的培養(yǎng)。

5.原生質(zhì)體培養(yǎng)：用酶及物理方法除去細胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。

（二）根據(jù)培養(yǎng)條件可分：液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)二.常用名詞的解釋

1.愈傷組織(callus)：在培養(yǎng)基上由外植體形成的一團無序生長的薄壁細胞。

器官發(fā)生→植株胚狀體發(fā)生→人工種子、轉(zhuǎn)基因材料外植體→愈傷組織懸浮細胞培養(yǎng)→次生代謝物培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)→細胞融合

2.外植體(explant)：由植物體取下接種在培養(yǎng)基上的無菌細胞、組織、器官等。

特點：多細胞，組成細胞類型不同，形成愈傷組織有異質(zhì)性，不同組分細胞具有不同的形成完整植株的能力，即再分化能力。幾十年來人們廣泛嘗試不同材料作外植體，如Haberlandt用葉肉細胞、髓細胞、腺毛、雄蕊毛、氣孔保衛(wèi)細胞。由于對細胞性質(zhì)和條件摸索不夠均未成功。基本上用薄壁組織，成熟組織如機械組織、輸導(dǎo)組織、分泌組織不易成功（如山西農(nóng)科院用果柄。復(fù)習(xí)組織類型）

適宜的外植體材料：薄壁細胞、形成層。

不適宜的外植體材料：成熟組織不宜，如瓜皮、果柄。

第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)一.植物細胞的全能性（totipotent)

概念:植物細胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。植物細胞只要有完整膜系統(tǒng)和有生命力的核，即使已高度成熟分化，還保持回復(fù)到分生狀態(tài)的能力。

原理：生物體每個細胞都含有該物種全套遺傳物質(zhì)，有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因，理論上講，每個活細胞都具有全能性。差異：1.受精卵全能性最高。受精卵－胚－種子－幼苗－植株，即說明全能性；2.受精卵分化后，體細胞的全能性比生殖細胞低。

體細胞從合子的有絲分裂產(chǎn)生，也具全能性，有遺傳信息的傳遞、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力。完整植株上某一部分體細胞只表現(xiàn)一定形態(tài)，承受一定功能，是受具體器官或組織所在環(huán)境束縛，其遺傳潛質(zhì)并沒消失，一但脫離束縛，條件適宜即表現(xiàn)全能性。

潛在全能性原因：基因表達的選擇性。處于離體狀態(tài)的植物活細胞，在一定營養(yǎng)物質(zhì)、激素和外界條件作用下，即可表現(xiàn)出全能性。人工條件下實現(xiàn)這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。

二.植物細胞全能性表達不少植物繁殖就是通過根莖葉等器官再分化而成，如扦插繁殖，原因：受傷組織--創(chuàng)傷激素--促使周圍組織生長--愈傷組織--內(nèi)源激素促使儲存營養(yǎng)--新器官。

植物組培技術(shù)擴大此項功能，使植物的范圍、再生部位均擴大。自然條件下營養(yǎng)器官和細胞再生困難，是內(nèi)源激素調(diào)整緩慢或不全面，外界條件不易控制。組培在人工控制條件下通過調(diào)整培養(yǎng)基，特別是對激素成分調(diào)整，有可能順利實現(xiàn)。

分化：胚性細胞幾乎無差異。隨種子萌發(fā)，細胞分裂分化為根莖葉等器官--逐漸失去分裂能力，形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生永久性適應(yīng)變化的過程，即--。

原因：由基因決定。基因在時空上差次表達的結(jié)果。

結(jié)果：細胞分裂能力喪失，通常不會恢復(fù)直至死亡。脫分化：已分化的、停止分裂的細胞，從植物體部分抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)分裂活性。把成熟細胞放到培養(yǎng)基上，即發(fā)生恢復(fù)分裂能力的現(xiàn)象。溶酶體分解失去功能細胞質(zhì)--酶活使蛋白質(zhì)合成代謝改變--基因表達改變--返老還童。

再分化：脫分化的組織或細胞（愈傷組織）在一定培養(yǎng)條件下，可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細胞類型的能力。

已分化的細胞表達全能性必須經(jīng)脫分化、再分化，即細胞培養(yǎng)目的：設(shè)計培養(yǎng)基、創(chuàng)造培養(yǎng)條件即組培目的。原則是如何使細胞完成脫分化和再分化，主要工作為設(shè)計、篩選培養(yǎng)基；探索建立合適的培養(yǎng)條件，摸索植物激素的主要作用。三.外植體離體分化過程的類型

1.無菌短枝型也稱節(jié)培法或微扦插。將待繁殖材料剪成帶一葉的單芽莖段轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基，一定時間后可成苗，再剪成帶一葉的單芽莖段，繼代又可成苗。

特點：一次成苗，遺傳穩(wěn)定，過程簡單，適用范圍大，移栽易成活。試管繁殖常用，也是其他方法最后階段常用方法，但初期繁殖速度慢。

2.叢生芽增殖型莖尖或初代培養(yǎng)的芽在適宜培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，不斷發(fā)生腋芽而成叢生芽，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根成苗，擴大繁殖。

特點：從芽到芽，遺傳穩(wěn)定，繁殖速度快，是莖尖培養(yǎng)和脫毒苗初期必由之路。但過程復(fù)雜，品種差異大。

3.愈傷組織再分化，有兩種方式：

A.不定芽：指愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株，這是細胞和組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。愈傷組織的器官發(fā)生順序：

（1）愈傷組織有根或芽的分別形成，即無根的芽或無芽的根；（2）先形成芽，芽伸長后在莖基長出根，形成小植株。多數(shù)植物屬此；（3）先產(chǎn)生根，再從根基部分化出芽，形成小植株。較難誘導(dǎo)芽形成，尤其單子葉；（4）先在愈傷組織鄰近部位分別形成芽和根，然后結(jié)合形成小植株。

B．胚狀體：由培養(yǎng)細胞誘導(dǎo)分化出的胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)而植株

4.原球莖型第三節(jié)植物組培技術(shù)的特點

一.培養(yǎng)條件可以人為控制組織培養(yǎng)采用的植物材料，完全在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下生長，擺脫大自然四季、晝夜變化及災(zāi)害性氣候影響。條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定、周年培養(yǎng)生產(chǎn)。

二.生長周期短，繁殖率高

組培是人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位不同要求提供不同培養(yǎng)條件，因此生長快。另外植株比較小，往往20-30d為一周期。所以，雖然有設(shè)備及能源消耗，由于材料能按幾何級數(shù)繁殖，總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。

三.管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制

組培是在一定場所和環(huán)境下，人為提供溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的方向。與盆栽、田間栽培相比，省去中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等系列繁雜勞動，可節(jié)省人力、物力及田間種植所需要土地。四.植物組織培養(yǎng)的材料經(jīng)濟

取材少，培養(yǎng)效果好，對品種推廣及復(fù)壯均有意義。非洲紫羅蘭一枚葉片，三個月可得5000株苗。第二章植物組培的發(fā)展和應(yīng)用

第一節(jié)發(fā)展簡史

一.植物組織培養(yǎng)的探索階段

1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide

和Schwann發(fā)表了細胞學(xué)說，奠定組織培養(yǎng)理論基礎(chǔ)。

1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt

根據(jù)細胞學(xué)說，提出單個細胞的植物細胞全能性（totipotency）理論。

1904年，Hanning

最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。

1922年，Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。

1934年，White用番茄根尖建立起第一個活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。

二.植物組織培養(yǎng)的技術(shù)建立階段

1933年李繼侗培養(yǎng)銀杏離體胚（3mm的胚），添加胚乳、種子、果實提取物。

1934年美國White由番茄根建立第一個無性繁殖系，28年繼代1600代。并研究光、溫度、通氣、pH值、培養(yǎng)基組成的影響，于1937年建立第一個綜合培養(yǎng)基，定名為White培養(yǎng)基。

1934年Gautherer提出B族維生素和生長素的作用，于1939年培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲成功。同年White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜建立連續(xù)生長的培養(yǎng)物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起譽為組培學(xué)科奠基人?，F(xiàn)在所用培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，基本由這三位科學(xué)家建立。

1943年White發(fā)表《植物組織培養(yǎng)手冊》，使組培成為新興學(xué)科。

40年代Skoog和崔徵明確腺嘌呤與生長素比例是控制芽根形成的主要條件。比例高-芽，低-根；相等則不分化。

1956Miller等人發(fā)現(xiàn)激動素可代替腺嘌呤，效果可增3萬倍。上述模式變?yōu)榧铀嘏c生長素比例。這一發(fā)現(xiàn)有力推動組培發(fā)展。

1952年Morel和Martin首次獲得無病毒植株。

1958年，英國科學(xué)家Steward等用胡蘿卜根愈傷組織細胞懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整植株，使細胞全能性理論得到證實，且為組培技術(shù)程序奠定基礎(chǔ)。三.植物組培的迅速發(fā)展階段

1960年，Morel提出離體無性繁殖蘭花，繁殖系數(shù)極高。被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。

1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲成功。

1971年，Takebe等用煙草原生質(zhì)體獲再生植株，不僅理論上證明無壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，且在實踐上為外源基因?qū)胩峁├硐胧荏w。80年代中期以來，對禾谷類原生質(zhì)體培養(yǎng)相繼告捷，中國學(xué)者做出重要貢獻。

1962年，Murashinge和Skoog

在煙草中篩選出仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。

1964-1